专利名称：丙型肝炎病毒hcv5'非编码区基因分型的生物芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种丙型肝炎病毒HCV5’非编码区基因分型的生物芯片。
丙型肝炎病毒HCV是9，600个核苷酸的单链RNA病毒。含有一个编码3011氨基酸的ORF和5’非编码区(5’-Non-coding region)，3’非编码区。
HCV病毒现在发现有十大类型(HCV type1，2，3，4，5，6，7，8，9，10)；每一大类型又有许多亚型(subtypes)，如HCV1a，HCV2b等。在临床上不同的亚型对于α-IFN的治疗，肝病的发生过程及严重程度有重要意义。HCV不同基因型也影响HCV感染的抗体诊断及病毒传染途径。α-IFN是治疗HCV感染最有效的方法之一，有关研究发现，HCV不同的亚型对α-IFN有不同的治疗效果，如HCV 1a，1b，2a，3a的治疗LTR(long-term response)分别为20％，7％，17％和16％。RIBAVIRIN是治疗慢性HCV肝炎的药物，经常与α-IFN同时使用，相关研究结果是HCV 1b，2a，3a的LTR分别是20％，40％和75％。另外，HCV 1b和4比HCV 1a，2a，3a感染在手术移植后，更快出现慢性肝病和cirrhosis并发症；而HCV 1b感染也更容易导致严重的慢性肝炎，cirrhosis和HCC(hepatocellular careinoma)形成。
人类在疾病基因诊断(又称分子诊断)上的早期实践始于70年代初期，但直到80年代中期PCR(polymerase chain reaction)技术诞生后，其在医学诊断上的应用才得到了迅速的发展。现代基因诊断是应用分子生物学高新技术-如PCR、分子杂交和DNA测序等技术手段，通过在分子水平上对被检样品进行分析来达到诊断疾病的目的。
目前人类对人体基因及病源体基因致病性的知识积累，己使基因诊断技术广泛应用于人类遗传病、传染病、肿瘤和其他与基因相关的许多疾病等方面的诊断。与医学上传统的实验诊断比较，基因诊断技术的主要优势是能获得高度特异性的针对病因分子的诊断结果，而对于人类遗传病，细菌，病毒感染和某些肿瘤病而言，基因诊断结果是最后的确诊指标。简变快速可靠的现代基因诊断新技术的发展，特别是最近生物芯片(biochip)技术的出现，其发展趋势将不可避免的替代现有临床实验室的许多方法，并可能改变传统的医学诊断观念。
现在HCV的亚型分析一般是分析5’非编码区(5’NCR)，核心(core)区序列和NS5B序列。利用的方法主要有(1)PCR-RFLP(restriction fragment lengthpolymorphism)，该方法利用多种限制性内切酶对基因扩增产物进行酶切，不同的基因序列将产生不同的电泳图谱(Davidson F et al，J Gen Virol 1995，76，1197-1204；Murphy D et al，J Infect Dis，1994，169，473-475；Mellor Jet al，J Gen Virol，1995，76，2493-2507)，该方法只能应用于当突变改变了某一酶切位点时。(2)探针杂交方法(Stuyver J et al，Virus Res，1995，38，137-157；Tisminetzky SG et al，Int Hepatol Commun，1994，2，105-142)，待测基因经PCR扩增后，分别与15-20bp标记的特异性探针杂交。该方法需进行同位素标记或地高辛，生物素，过氧化物酶等标记，分析过程复杂，不适宜快速分析。(3)特异性PCR引物扩增方法(Okamoto H et al，J Gen Virol，1992，73，673-679；Okamoto H et al，J Gen Virol，1993，74，2385-2390)，其原理是根据已知突变位点的性质在引物中设计一错配碱基，使之仅能扩增突变型或野生型基因。该方法较为快速简便。但一次只能检测有限的亚型。(4)DNA酶免疫分析方法(DNA enzyme immunoassay)(Viazov S et al，J Virol Methods，1994，48，81-91)。(5)DNA测序法，这是最直观，最准确的方法。但技术复杂价格昂贵，不能作为常规方法。(6)ELISA分析法(Simmonds P et al，J ClinMicrobiol，1993，31，1493-503；Bhattacherjee V et al，J Gen Virol，1995，76，1737-48；Machida A et al，Hepatology，1992，16，886-91；Tanaka T etal，Hepatology，1994，19，1347-53)，这种方法只能对HCV病毒的主要类型(type)，如HCV1和HCV2，进行分类，不能分析亚型(subtype)。
综上所述，在有关丙型肝炎病毒HCV的诊断及基因分型的现有技术中，存在操作繁杂，所需时间长，成本较高，难以自动化及大量样本平行分析等问题。本发明的目的就是针对现有技术的不足，提出一种与现有技术完全不同的有关HCV基因分型诊断方法。利用DNA芯片技术检测HCV病毒，并对30多种亚型进行分型。
本发明的目的是提供一种可以方便，快速地一次检测30种左右的丙型肝炎病毒的亚型的丙型肝炎病毒HCV5’非编码区基因分型生物芯片。
为了达到上述目的本发明采取下列措施丙型肝炎病毒HCV5’非编码区基因分型的生物芯片是在玻片、硅片、膜、高分子材料上固定诊断丙型肝炎病毒及其30多种亚型的DNA探针，所说的探针为HCV1(127-113) ATG CCT GGA GAT TTGHCV1(168-154) TTG CCA GGA CGA CCGHCV1a(242-228) GTG TCG TGC AGC CTCHCV1b(106-92) CCC CCG CGA GAC T/CGCHCV1c(145-131) CTT GGA TTA ACC CGCHCV1d(144-130) TTG GAT AAC CCC GCTHCV1f(143-129) TGG ATC TAA CCG CTCHCV2(139-125) TAA ACC CAC TCT ATGHCV2(83-69) TAG CGT TGG GTT GCGHCV2a(128-114) TAT GCC CGG TCA TTTHCV2b(168-154) TTA CCG GAA AGA CTGHCV2c(126-112) TGC CCG GCC ATT TGGHCV2d(129-115) CTA TGC CTG GTC ATTHCV2e(101-87) GCA AGA CCG CTA GCCHCV3(170-156) AAT CGC TGG GGT GACHCV3(129-114) CAA TAC CCA GAA ATT THCV3(103-89)CCG CGA GAT CAC TAGHCV3a(146-132) TCT TGG AGC AAC CCGHCV3d(145-132) CTT GGA ACA AAC CCGHCV3f(145-132) CTT GGA ATC AAC CCGHCV4(244-229) GAG TGT TGT ACA GCC THCV4(170-156) AAT CGC CGG GAT GACHCV4bg(127-113) ATG CCC GGC AAT TTGHCV4e(144-129) TTG GAT TAA ACC GCT CHCV5a(243-229) AGT GTC GAA CAG CCTHCV6ab(147-136) TTC CAT TGG ATC AAAHCV6a(242-228) GTG TCG TAC AGC CTCHCV10a(168-154) TCG CCG GGT TGA CCG本发明与现有技术相比，可以方便，快速地一次检测30种左右的丙型肝炎病毒的亚型，非常适合于临床的病毒基因分型。每一种病毒亚型有一种杂交信号模式，通过杂交信号模式分析，判断待检测病毒的亚型，分辨率高，专一性强。一次测试能检测的病毒亚型数是现有技术中最多的。采用荧光分析方法，灵敏度高。同一芯片可同时检测HCV1a，HCV1b，HCV1c，HCV1d，HCV1e，HCV1f，HCV2a，HCV2b，HCV2c，HCV2d，HCV2e，HCV3a，HCV3b，HCV3c，HCV3d，HCV3e，HCV3f，HCV4a，HCV4b，HCV4c，HCV4d，HCV4e HCV4f，HCV4g，HCV5a，HCV6a，HCV6b，HCV10a。本发明也适用于其他病毒和微生物的检测及基因分型，如HBV的基因分型。
下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。
图1是丙型肝炎病毒(HCV)5’非编码区基因分型生物芯片模式图；图2是检测HCV2a，1b病毒的杂交信号模式示意图；图3是HCV1b，HCV2a检测杂交结果图。
本发明的目的是这样实现的。通过对HCV病毒的5’非编码区(5’NCR)的PCR扩增及特异性探针杂交的方法鉴定HCV病毒的基因型1a，1b，1c，1d，1f，1e，2a，2b，2c，2d，2e，3a，3b，3c，3d，3e，3f，4a，4b，4c，4d，4e，4f，4g，4h，4k，5a，6a，6b和10a。5’非编码区(5’NCR)的核苷酸序列(341bp)5’non-coding region of HCV-1 1a genome(GenBank ACC No.D31603) 5’非编码区(5’NCR)的PCR扩增引物(243bp)Primers of 5’non-coding region of HCV-1 1a genomeOLIGO tm gc％ seqPrimerHCV1 59.37 50.00 cttcacgcagaaagcgtctaPrimerHCV2 60.42 55.00 gcaccctatcaggcagtacc探针设计搜查大量文献资料，比较HCV的所有类型及亚型的5’非编码区(5’NCR)的340bp的序列，用计算机软件设计可分析30多种亚型的DNA探针，设计的探针为HCV1(127-113) ATG CCT GGA GAT TTGHCV1(168-154) TTG CCA GGA CGA CCGHCV1a(242-228)GTG TCG TGC AGC CTCHCV1b(106-92) CCC CCG CGA GAC T/CGCHCV1c(145-131)CTT GGA TTA ACC CGCHCV1d(144-130)TTG GAT AAC CCC GCTHCV1f(143-129)TGG ATC TAA CCG CTCHCV2(139-125) TAA ACC CAC TCT ATGHCV2(83-69) TAG CGT TGG GTT GCGHCV2a(128-114)TAT GCC CGG TCA TTTHCV2b(168-154)TTA CCG GAA AGA CTGHCV2c(126-112)TGC CCG GCC ATT TGGHCV2d(129-115)CTA TGC CTG GTC ATTHCV2e(101-87) GCA AGA CCG CTA GCCHCV3(170-156) AAT CGC TGG GGT GACHCV3(129-114) CAA TAC CCA GAA ATT THCV3(103-89) CCG CGA GAT CAC TAGHCV3a(146-132)TCT TGG AGC AAC CCGHCV3d(145-132)CTT GGA ACA AAC CCGHCV3f(145-132)CTT GGA ATC AAC CCGHCV4(244-229) GAG TGT TGT ACA GCC THCV4(170-156) AAT CGC CGG GAT GACHCV4bg(127-113) ATG CCC GGC AAT TTGHCV4e(144-129)TTG GAT TAA ACC GCT CHCV5a(243-229)AGT GTC GAA CAG CCTHCV6ab(147-136) TTC CAT TGG ATC AAAHCV6a(242-228)GTG TCG TAC AGC CTCHCV10a(168-154) TCG CCG GGT TGA CCGDNA探针的固定氨基修饰DNA探针(NH2-(CH2)6-DNA oligo)，以上28种DNA探针以每种探针重复2次以上固定于载体表面(载玻片，硅片，高分子材料，膜等)。样品处理取待测者血液1毫升，利用商业化的RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)扩增HCV病毒5’非编码区(5’NCR)，引物5’末端用荧光修饰。PCR产物加入1/10体积的3M pH5.2醋酸缓冲液，加入2.5倍体积的-20℃冷藏的100％乙醇，混匀后，-20℃放置30分钟。13000rpm离心10分钟，用70％乙醇洗涤沉淀，干燥。DNA芯片表面杂交过程5μl杂交缓冲液(5 X SSC，0.2％SDS)溶解上述DNA，95℃变性5分钟，冷却至室温，滴加于DNA阵列表面，再盖上载玻片，42℃杂交4～8小时。杂交信号检测及信号模式分析用共聚焦荧光显微镜或荧光扫描仪检测DNA芯片杂交信号。通过信号模式分析判别HCV病毒亚型。信号模式识别分析表HCV1a1，2，3HCV1b1，2，4HCV1c1，2，5，3HCV1d1，2，6HCV1e1，2，27HCV1f1，2，7HCV2a8，9，10HCV2b8，9，11HCV2c8，9，12HCV2d8，9，13HCV2e8，9，14HCV3a15，16，17，18，3HCV3b17，3，22HCV3c15，16，3HCV3d15，16，17，3，19HCV3e15，16，17，3HCV3f3，20HCV4a21HCV4b21，22，23HCV4c21，22HCV4d21，22HCV4e21，22，24HCV4f21，20HCV4g19，23HCV4h20，22HCV4k22HCV5a25HCV6a1，9，26，27HCV6b1，2，3，9，26HCV10a3，28
图1为丙型肝炎病毒(HCV)5’非编码区(5’non-coding region，NCR)基因分型的生物芯片模式图。1HCV1(127-113)，2HCV1(168-154)，3HCV1a(242-228)，4HCV1b(106-29)，5HCV1c(145-131)，6HCV1d(144-130)，7HCV1f(143-129)，8HCV2(139-125)，9HCV2(83-69)，10HCV2a(128-114)，11HCV2b(168-154)，12HCV2c(126-112)，13HCV2d(129-115)，14HCV2e(101-87)，15HCV3(170-156)，16HCV3(129-114)，17HCV3(103-89)，18HCV3a(146-132)，19HCV3d(145-132)，20HCV3f(145-132)，21HCV4(244-229)，22HCV4(170-156)，23HCV4bg(127-113)，24HCV4e(144-129)，25HCV5a(243-229)，26HCV6ab(149-135)，27HCV6a(242-228)，28HCV10a(168-154)。
图2为检测HCV2a，1b病毒的杂交信号模式。HCV2a的信号点是8，9，10；HCV1b的信号点是1，2，4。
图3 HCV2a，HCV1b检测杂交结果图实施例1利用本发明的生物芯片检测HCV 2a病毒。取待测者血液1毫升，用设计的PCR(聚合酶链式反应)引物PrimerHCV1cttcacgcagaaagcgtcta和PrimerHCV2FITC-gcaccctatcaggcagtacc和商业化的RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)试剂盒扩增HCV病毒5’非编码区(5’NCR)。得243bp的基因片断，加入1/10体积的3M pH5.2醋酸缓冲液，加入2.5倍体积的-20℃冷藏的100％乙醇，混匀后，-20℃放置30分钟。13000rpm离心10分钟，用70％乙醇洗涤沉淀，干燥。5μl杂交缓冲液(5 X SSC，0.2％SDS)溶解上述DNA，95℃变性5分钟，冷却至室温，滴加于DNA阵列表面，再盖上载玻片，42℃杂交4～8小时。用荧光扫描仪检测DNA芯片杂交信号，结果如图3右图。
实施例2利用本发明的生物芯片检测HCV 1b病毒。取待测者血液1毫升，用设计的PCR(聚合酶链式反应)引物PrimerHCV1cttcacgcagaaagcgtcta和PrimerHCV2FITC-gcaccctatcaggcagtacc和商业化的RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)试剂盒扩增HCV病毒5’非编码区(5’NCR)。得243bp的基因片断，加入1/10体积的3M pH5.2醋酸缓冲液，加入2.5倍体积的-20℃冷藏的100％乙醇，混匀后，-20℃放置30分钟。13000rpm离心10分钟，用70％乙醇洗涤沉淀，干燥。5μl杂交缓冲液(5 X SSC，0.2％SDS)溶解上述DNA，95℃变性5分钟，冷却至室温，滴加于DNA阵列表面，再盖上载玻片，42℃杂交4～8小时。用荧光扫描仪检测DNA芯片杂交信号，结果如图3左图。
权利要求
1.一种丙型肝炎病毒HCV5’非编码区基因分型的生物芯片，其特征在于在玻片、硅片、膜、高分子材料上固定检测丙型肝炎病毒及其30多种亚型的DNA探针，所说的探针为HCV1(127-113) ATG CCT GGA GAT TTGHCV1(168-154) TTG CCA GGA CGA CCGHCV1a(242-228) GTG TCG TGC AGC CTCHCV1b(106-92) CCC CCG CGA GAC T/CGCHCV1c(145-131) CTT GGA TTA ACC CGCHCV1d(144-130) TTG GAT AAC CCC GCTHCV1f(143-129) TGG ATC TAA CCG CTCHCV2(139-125) TAA ACC CAC TCT ATGHCV2(83-69) TAG CGT TGG GTT GCGHCV2a(128-114) TAT GCC CGG TCA TTTHCV2b(168-154) TTA CCG GAA AGA CTGHCV2c(126-112) TGC CCG GCC ATT TGGHCV2d(129-115) CTA TGC CTG GTC ATTHCV2e(101-87) GCA AGA CCG CTA GCCHCV3(170-156) AAT CGC TGG GGT GACHCV3(129-114) CAA TAC CCA GAA ATT THCV3(103-89)CCG CGA GAT CAC TAGHCV3a(146-132) TCT TGG AGC AAC CCGHCV3d(145-132) CTT GGA ACA AAC CCGHCV3f(145-132) CTT GGA ATC AAC CCGHCV4(244-229) GAG TGT TGT ACA GCC THCV4(170-156) AAT CGC CGG GAT GACHCV4bg(127-113) ATG CCC GGC AAT TTGHCV4e(144-129) TTG GAT TAA ACC GCT CHCV5a(243-229) AGT GTC GAA CAG CCTHCV6ab(147-136) TTC CAT TGG ATC AAAHCV6a(242-228) GTG TCG TAC AGC CTCHCV10a(168-154) TCG CCG GGT TGA CCG
全文摘要
本发明公开了一种丙型肝炎病毒HCV5’非编码区基因分型的生物芯片。它是在玻片、硅片、膜和高分子材料上固定我们设计的28种特异DNA探针,可用来检测丙型肝炎病毒及其30多种亚型。本发明与现有技术相比,可以方便,快速地一次检测30种左右的丙型肝炎病毒的亚型,非常适合于临床的病毒基因分型。每一种病毒亚型有一种杂交信号模式,分辨率高,专一性强。一次测试能检测的病毒亚型数是现有技术中最多的。采用荧光分析方法,灵敏度高。
文档编号C12Q1/68GK1335410SQ0012216
公开日2002年2月13日 申请日期2000年7月23日 优先权日2000年7月23日
发明者叶邦策 申请人:浙江江南生物科技有限公司