专利名称：葡萄糖脱氢酶的生产过程的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生产可大量表达洋葱伯克霍尔德氏菌(Burknorderia cepacia)葡萄糖脱氢酶复合物的埃希氏菌(Escherichia)的方法及一种生产该酶复合物的方法。葡萄糖脱氢酶应用在使用酶电极之类的葡萄糖感应器中。
背景技术：
已知由属于伯克霍尔德氏菌属(Burkhorderia)的微生物洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株产生的一种酶为葡萄糖脱氢酶(GDH)。该酶是一种酶复合物，由作为催化亚基的α-亚基，作为细胞色素c的β-亚基以及γ-亚基组成，由于具有高热稳定性的超级特性，因此由该酶催化的反应几乎不被溶解氧等物质影响。已分离到编码该酶α-亚基和γ-亚基的DNA，而且也分离到编码β-亚基的部分DNA。而且该酶已在大肠杆菌中得到成功表达(参考国际专利公布WO02/36779)。然而，所表达的GDH并不含β-亚基。
同时，通过大肠杆菌的细胞色素成熟系统了解到ccm系统(细胞色素c成熟系统)。而且已知ccm系统在大肠杆菌中在厌氧及特定的条件下表达(J.Bacteriol.177.4321-4326(1995))。编码ccm系统操纵子(ccmABCDEFGH)的DNA序列已得到阐明(Nature，409(6819)，529-533(2001)；GeneBank登录号U0008(1993))。另外，已报道通过使用可表达ccm系统的质粒转化大肠杆菌，在厌氧条件下可表达并生产来源于不同于大肠杆菌的生物体中共价键类型的多亚铁血红素细胞色素(Biochem.Biophys.Res.Commun.，251，744-7(1998)；Bioehem.Biophys.Acta，1411，114-20(1999)；Biochem.Biophys.Acta，1481，18-24(2000)；Protein Sci.9，2074-84(2000))。
另外，已知含ccm操纵子的质粒pEC86是通过将操纵子插入到pACYC184上而获得的(Biochem.Biophys.Res.Commun.，251，744-7(1998))。
发明描述本发明的发明人已发现上述葡萄糖脱氢酶的α-亚基和β-亚基同时在大肠杆菌中表达时比单独表达α-亚基的表达效率更低。因此本发明的一个目标是提供一种在埃希氏菌中大量表达含α-亚基和β-亚基的酶复合物的方法。
为了完成上述目标，本发明的发明人进行了刻苦的研究。结果他们发现通过增强埃希氏菌中ccm系统的表达，可提高编码洋葱伯克霍尔德氏菌葡萄糖脱氢酶复合物的DNA的表达，从而完成了本发明。
因此本发明提供下列各项。
(1)一种埃希氏菌，该菌导入了以可表达形式存在的编码洋葱伯克霍尔德氏菌葡萄糖脱氢酶α-亚基和β-亚基的DNA，而且其ccm系统的表达是增强的。
(2)根据(1)中的埃希氏菌，其中编码α-亚基的DNA位于编码β-亚基的DNA的上游，而且它们的表达由同一个启动子调控。
(3)根据(1)中的埃希氏菌，该菌进一步引入以可表达形式存在的编码葡萄糖脱氢酶γ-亚基的DNA。
(4)根据(3)中的埃希氏菌，其中编码γ-亚基的DNA位于编码α-亚基的DNA的上游。
(5)根据(1)到(4)任何一项中的埃希氏菌，其中埃希氏菌是大肠杆菌。
(6)一种生产葡萄糖脱氢酶复合物的方法，包括培养(1)到(5)任何一项中的埃希氏菌，使编码α-亚基和β-亚基的DNA得到表达从而生产葡萄糖脱氢酶复合物，并收集该复合物。
附图的简要描述
图1所示的是从洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株和大肠杆菌JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccm中纯化的GDH复合物的SDS-PAGE结果(照片)。
泳道1分子量标准泳道2从KS1菌株纯化的GDH泳道3从JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccm纯化的GDH实现本发明的最佳实施方式以下对本发明进行详细描述。
本发明的埃希氏菌是一种引入以可表达形式存在的编码洋葱伯克霍尔德氏菌葡萄糖脱氢酶(以下也简称为“GDH”)α-亚基和β-亚基(以下也分别称为“α-亚基基因”和“β-亚基基因”)DNA的埃希氏菌，而且其中ccm系统得到增强。
上述埃希氏菌的实施例包括大肠杆菌。
而且，上述洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkhorderia cepacia)的实施例包括KS1菌株，JCM2800菌株，JCM2801菌株，J2315菌株等。KS1菌株保藏在国际专利生物保藏机构，国立产业技术综合研究所(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，保藏号是FERM BP-7306。JCM2800菌株和JCM2801菌株从日本微生物保藏中心(JCM)，理化学研究所生物资源中心获得。另外，J2315菌株保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，ATCC号为BAA-245，以及比利时微生物协调保藏中心(BCCMTM)，保藏号是LNG 16656，并可从这些保藏中心获得。
包含KS1菌株GDHα-亚基和部分β-亚基的染色体DNA片段的核酸序列如SEQ ID NO1(参考WO02/36779)所示。在该核酸序列中存在3个开放阅读框(ORFs)。从5’端开始的第二和第三个ORFs分别编码α-亚基(SEQ ID NO3)和β-亚基(SEQ ID NO4)。另外，估计第一个ORF编码γ-亚基(SEQ ID NO2)。包含全长β-亚基基因的核酸序列如SEQ ID NO9所示。另外，β-亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO10所示。估计SEQ ID NO10中1到22位的氨基酸是一个信号肽。虽然在SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示的第一个氨基酸残基是Val，但它更可能是Met，在翻译后被除去了。
本发明所用的α-亚基基因并不限于编码氨基酸序列为SEQ IDNO3的基因，并可以是编码具有在SEQ ID NO3所示的氨基酸序列基础上通过包括替代，缺失，插入或添加一个或几个氨基酸残基所得的氨基酸序列的蛋白的基因，只要编码的多肽具有GDH活性即可。虽然由核酸序列SEQ ID NO1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示，但N-末端的甲硫氨酸残基可在翻译后被除去。上面表述的“一个或几个”优选地是1到10，更优选地是1到5，特别优选地是1到3。
另外，β-亚基基因可以编码具有在SEQ ID NO10所示的氨基酸序列的第23到425位氨基酸序列的基础上包括替代，缺失，插入或添加一个或几个氨基酸残基所得的氨基酸序列的蛋白质，只要其具有GDH β-亚基的功能即可。上面表述的“一个或几个”优选地是1到20，更优选地是1到10，特别优选地是1到5。表述“具有GDH β-亚基的功能”是指具有细胞色素c的功能，而且不破坏GDH的酶活性。
α-亚基基因的特定实施例包括由SEQ ID NO1中第764到2380位核苷酸的核酸序列所组成的DNA。另外，α-亚基基因可以是能够与由SEQ ID NO1中第764到2380位核苷酸的核酸序列所组成的DNA、或从该序列制备的探针在严谨条件下杂交、并编码具有GDH活性的蛋白的DNA。
进一步，β-亚基基因的特定实施例包括由SEQ ID NO9中第187到1398位核苷酸的核酸序列所组成的DNA。另外，β-亚基基因可以是能够与由SEQ ID NO9中第187到1398位核苷酸的核酸序列所组成的DNA、或从该序列制备的探针在严谨条件下进行杂交、并编码具有β-亚基功能的蛋白的DNA。
上述严谨条件包括在该条件下，同源性为70％或更高，优选地为80％或更高，更优选地为90％或更高的DNA才能互相杂交。特别地，在1×SSC，0.1％SDS，60℃的条件下进行杂交。
α-亚基基因和β-亚基基因可通过，例如，使用洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株染色体DNA为模板的PCR来获得。PCR的引物可根据上述核酸序列通过化学合成来制备。另外，也可以用基于上述序列而制备的寡核苷酸为探针通过杂交从洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株的染色体DNA中获得这些基因。另外，它们的变异体也可以通过同样的方式从其它洋葱伯克霍尔德氏菌菌株中获得。
在本发明中，α-亚基基因位于β-亚基基因的上游并且优选它们的表达由同一个启动子进行调控。另外，优选编码γ-亚基的DNA(γ-亚基基因)与α-亚基基因和β-亚基基因一起以可表达的形式引入到埃希氏菌中。在这种情况下，优选γ-亚基基因位于α-亚基基因的上游并且这些亚基基因的表达均由同一个启动子进行调控。
以这种顺序排列的编码γ-亚基、α-亚基和β-亚基的多顺反子DNA片段可通过，例如，以洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株的染色体DNA为模板，核酸序列为SEQ ID NO12和13的寡核苷酸为引物的PCR来获得(参见下述实施例)。
为了将含有α-亚基基因和β-亚基基因(如果需要，还有γ-亚基基因)的DNA(以下用“GDHαβ基因”指代)以可表达形式引入到埃希氏菌中，可以将GDHαβ基因插入到可在埃希氏菌中起作用的载体中，然后用获得的重组载体转化埃希氏菌。在这种情况下，在GDHαβ基因上游提供一个可在埃希氏菌中起作用的启动子，则GDHαβ基因可在该启动子调控下进行表达。
在埃希氏菌中起作用的载体的实施例包括pBR322，pUC18，pUB118，pUC19，pUB119，pACYC184，pBBR122等。另外，上述启动子的实施例包括lac，trp，tac，trc，PL，tet，PhoA等。另外，通过将GDHαβ基因插入到含启动子的表达载体中的合适位置，可在同一步骤中进行基因插入载体及启动子的连接。这种表达载体的实施例包括pTrc99A，pBluescript，pKK223-3等。
另外，GDHαβ基因可以可表达形式整合到埃希氏菌的染色体DNA上。
为了将重组质粒转化到埃希氏菌中，可使用例如钙处理，电穿孔或其它类似方法制备感受态细胞。
本发明中的埃希氏菌是引入上述GDHαβ基因的埃希氏菌，而且其中ccm系统的表达得到增强。
ccm系统由ccm操纵子(ccmABCDEFGH)编码。ccm操纵子可通过，例如，使用大肠杆菌的染色体DNA为模板的PCR来获得。PCR引物可根据报道的核酸序列(DDBJ/EMBL/GeneBank序列号AE005452)通过合成而制备。另外，可使用基于上述序列制备的寡核苷酸作为探针通过杂交从大肠杆菌的染色体DNA中获得这些基因。另外，也可以通过相同方式从其它埃希氏菌中获得这些基因的变异体。
ccm操纵子除了可以是具有上述报道核酸序列的DNA，还可以是能够与含有这些序列的DNA、或者与由这些序列制备的探针在严谨条件下进行杂交、并编码一组具有ccm系统功能的酶的DNA。
已知ccm系统在厌氧及特定条件下表达(非专利文献1)。在本发明中，表述“ccm系统的表达是增强的”是指同野生的或未修饰的埃希氏菌相比表达增强了，或进行的修饰可使该系统在非厌氧及特定条件下也进行表达。非厌氧及特定条件的实施例包括需氧条件。
为了增强ccm系统的表达，将ccm操纵子基因连接到组成型表达的启动子或可调控表达的启动子上，并将获得的重组基因引入到埃希氏菌中。优选的启动子和载体、及将ccm操纵子引入到埃希氏菌中的方法与操作GDHαβ基因的描述相似。
含有ccm操纵子的质粒的实施例包括将操纵子插入到pACYC184中而获得的pEC86。该操纵子在tet启动子的调控下进行组成型表达。另外，也可以制备插入了从埃希氏菌染色体DNA中通过PCR等方式克隆的ccm操纵子的质粒，从而使其由合适的启动子进行调控。
另外，也可以通过用合适的启动子替换埃希氏菌染色体DNA上的ccm操纵子中的启动子来增强该操纵子的表达。
可通过培养本发明中的埃希氏菌，使其表达α-亚基基因和β-亚基基因，产生作为这些基因表达产物的GDH酶复合物，并收集这些复合物来有效生产GDH复合物。此处所用的术语“GDH复合物”优选地是指由亚基的联合而形成的多价蛋白，但是也包括自由形式的亚基混合物。
对于培养埃希氏菌的方法，培养条件可考虑宿主的营养和生理特性。在多数情况下，以液体培养的方式进行培养。工业培养可以在通风和搅拌的条件下方便地进行。
作为培养基的养份，可广泛使用那些培养埃希氏菌的物质。作为碳源，可使用那些可吸收的碳化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、糖蜜、丙酮酸等。作为氮源，可使用氮化合物，例如蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、大豆碱提取物等。另外，如果需要，可以使用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁盐、钙、钾、铁、锰、锌等，特定的氨基酸、特定的维生素等。
培养温度可在埃希氏菌生长和产生GDH复合物的范围内进行适当调整，优选地为约20至42℃。虽然培养时间根据条件有轻微调整，但通过估计达到GDH复合物产量最大的时间可终止培养，培养时间通常是12至72小时。培养基的pH可在细菌细胞生长和产生GDH复合物的范围内进行适当调整，优选地范围在pH约6.0到9.0。
可以收集和使用培养液作为GDH复合物。然而，当GDH复合物存在于培养液中时，通常通过过滤、离心或类似的常规方式将埃希氏菌细胞分离后，用作含GDH复合物的溶液。而当GDH复合物存在于细胞中时，则从获得的培养物中通过过滤、离心或类似的方式收集细胞，然后通过物理方法或者通过例如使用溶菌酶或其它类似酶法破碎细胞，如果需要，可加入例如EDTA及表面活性剂这样的鳌合剂溶解亚基，以水相溶液的形式分离并收集GDH复合物。
GDH复合物可从上述获得的溶液中通过，例如，真空浓缩、膜浓缩、使用硫酸铵、硫酸钠或其它类似物的盐析，或通过亲水性有机溶剂如甲醇、乙醇或丙酮进行分级沉淀而沉淀出来。另外，热处理和等电点沉淀也是有效的纯化方式。然后可通过使用吸附剂、凝胶过滤试剂或其它类似试剂的凝胶过滤、吸附层析、离子交换层析、亲和层析等方式的适当组合进行纯化，从而获得纯化的GDH复合物。可通过柱层析进行分离和纯化而得到纯化的酶制品。
GDH的α-亚基可单独表现出酶活性。因此可从本发明的埃希氏菌或GDH复合物中单独分离纯化出α-亚基，并进行使用。
实施例本发明将参考以下实施例进行更为详尽的说明。
实施例1分离编码洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株GDH β-亚基的基因<1>洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株GDH β-亚基的查找通过使用Sanger中心(http//www.sanger.ac.uk/)的洋葱伯克霍尔德氏菌J2315菌株基因组数据库查找来源于KS1菌株的GDH β-亚基基因。参照已阐明的KS1菌株GDH β-亚基的N-末端序列(SEQ IDNO5)，设计了一个氨基酸序列(SEQ ID NO6)，它与来源于下述酶的细胞色素c亚基具有同源性，所述的酶指醋杆菌(Acetobactersp.)和葡糖杆菌(Gluconobacter sp.)的乙醇脱氢酶(Tamaki T.等，Biochem.Biophys.Acta，1088(2)292-300(1991)；Matsushita K.等，Biosci.Biotech.Biochem.，56，304-310(1992)；Takemura H.等，J.Bacteriol.，175，6857-66(1993)；Kondo K.等，Appl.Environ.Microbiol.，63，1131-8(1997))、来源于欧文氏菌(Erwinia sp.)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)的葡糖酸脱氢酶(Yum D.Y.等，J.Bacteriol.，179，6566-72(1997)；Matsushita等，J.Biochem.，85，1173-81(1979))、来源于葡糖杆菌(Gluconobacter sp.)的山梨醇脱氢酶(Choi E.S.等，FEMSMicrobiol.Lett.，125，45-50(1995))及来源于欧文氏菌及泛菌(Pantoeasp.)的2-酮葡糖酸脱氢酶(Pujol C.J.等，J.Bacteriol.，182，2230-7(2000))。
以上述氨基酸序列作为索引，通过BLAST在上述洋葱伯克霍尔德氏菌J2315菌株数据库中查找所编码的氨基酸序列具有高同源性的基因序列。然后检查5个所得的序列与KS1菌株GDHα-亚基C-末端序列的同源性。结果发现，从两个基因片段翻译的氨基酸序列具有高同源性(＞90％)。由于每个基因片段都比较短，约200至500bp，因此通过BLAST在洋葱伯克霍尔德氏菌J2315菌株数据库中查找与这些序列具有高同源性的序列，并将这些片段连接起来。从而获得一个3110bp的片段。在获得的核酸序列中，存在一个表现为GDH C-末端的ORF以及一个1275bp长度的表现为细胞色素c结构基因的ORF。对所获得的J2315菌株的核酸序列与已克隆的KS1菌株α-亚基的核酸序列进行比较。结果表明，与编码J2315菌株细胞色素c信号肽的核酸序列具有高同源性的核酸序列包含在α-亚基的下游。
根据上述结果，估计已克隆的洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株GDH基因(SEQ ID NO1，参考WO 02/36779)中的第三个ORF(在SEQID NO1中2386位核苷酸与其后续序列)编码β-亚基。而且由于纯化的β-亚基的N-末端氨基酸序列与SEQ ID NO1中2452位至2466位核苷酸组成的核酸序列所翻译的氨基酸序列有5个氨基酸残基是匹配的，因此认为上述ORF编码β-亚基。
<2>通过反向PCR扩增β-亚基结构基因(1)细胞培养和基因组提取KS1菌株在37℃，5ml完全培养基(0.5％聚胨，0.3％酵母提取物，0.5％NaCl)中振荡培养过夜。用GennomicPrepTM细胞及组织DNA提取试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)从获得的细胞中提取基因组。根据附带的操作手册进行操作。将获得的基因组进行酚/氯仿处理及乙醇沉淀，然后溶解在纯水中。
(2)基因组片段的环化从KS1菌株提取的基因组用BamHI，EcoRI，HindIII，SmaI，SacI和XhoI进行消化，得到的基因组片段通过乙醇沉淀进行收集。用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo)对1μg限制性内切酶消化的基因组进行连接，于16℃连接过夜。
(3)PCR将根据编码KS1菌株GDH β-亚基N-末端信号序列的核酸序列而设计的50pmol正向引物(EF1，SEQ ID NO7)和50pmol反向引物(ER1，SEQ ID NO8)(两个引物均由Invitrogen合成)、0.5ml LATaq(Takara Bio Inc.)、8μldNTP溶液和5μl 10×PCR缓冲液加到纯水中，使终体积为50μl，使用Program Temp Control System PC-801(ASTEC)进行PCR。PCR在以下条件下进行。94℃5分钟，然后98℃20秒，62℃30秒重复30次，之后在72℃反应6分钟，72℃反应10分钟。
当以限制性内切酶SmaI消化的基因组为模板时，通过琼脂糖电泳可确定片段大小约为2.1kbp。
<3>PCR扩增片段测序(1)TA克隆对上述反向PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后切下条带并用Gene Clean II试剂盒(Bio101 Inc)进行纯化。使用pGEMR-T与pGEMR-T easy载体系统(Promega)将该片段连接到pGEM-T载体上。用连接载体转化大肠杆菌DH5α，并在含50μg/ml氨苄青霉素，40μg/ml X-Gal和0.1μM IPTG的L琼脂培养基上培养过夜。在出现的菌落中挑选白斑，并在含50μg/ml氨苄青霉素的L培养基中过夜培养，通过碱法从细胞中提取质粒。
(2)测序样品的制备对获得的质粒进行RNase处理，在1体积质粒中加入0.6倍的20％PEG6000/2.5M NaCl，置于冰上1小时。然后在4℃将混合物15000rpm离心15分钟，获得沉淀。用70％乙醇洗涤沉淀，真空干燥后，溶解在纯水中。
(3)DNA核酸序列的分析通过ABI PRISMTM310Genetic Analyzer(PERKIN-ELMERApplied Biosystems)对(2)中获得的插入到质粒中的片段进行核酸序列分析。插入载体多克隆位点的插入片段的部分序列通过M13引物进行测定。从而确定了包括已阐明的β-亚基N-末端序列的核酸序列。随后根据该序列制备引物，对插入片段的核酸序列进行测定。结果如SEQID NO9所示。另外，由该核酸序列中的ORF所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO10所示。
β-亚基共包含425个氨基酸残基。根据与已有的氨基酸序列的N-末端比较，其中22个残基被认为是信号肽。根据氨基酸序列计算的分子量为45,276Da，除去信号肽的分子量为42,731Da，这与通过SDS-PAGE获得的KS1菌株GDH β-亚基的分子量43kDa相当。确定在β-亚基的氨基酸序列中细胞色素c上有3个位点是亚铁血红素结合元件(SEQ ID NO11)。该ORF紧邻α-亚基结构基因ORF的下游，而且在起始密码子上游存在一个表现为SD序列的序列。
通过BLAST对该氨基酸序列进行同源性搜索，发现在氨基酸水平上的同源性整体上都很高，例如，与来源于茄科罗尔斯通氏菌(Ralstoniasolanacearum)的氧化还原酶脱氢酶的细胞色素c亚基同源性为65％，与来源于氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)的山梨醇脱氢酶的细胞色素c亚基同源性为48％，与来源于毛芍兰根欧文氏菌(Eriwiniacypripedii)的葡糖酸脱氢酶的细胞色素c亚基同源性为44％，与来源于柠檬泛菌(Pantoea citrea)的2-酮葡糖酸脱氢酶的细胞色素c亚基同源性为46.4％。另外，亚铁血红素结合元件序列(SEQ ID NO11)在这些细胞色素c的氨基酸序列中是保守的。
KS1菌株的GDH β-亚基结构基因与J2315菌株的GDH β-亚基结构基因在核酸序列水平和氨基酸水平上的同源性分别是92.0％和92.2％。
实施例2将GDHαβ基因导入大肠杆菌及ccm系统的增强<1>制备洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株的染色体DNA通过常规方法制备洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株的染色体基因。即，细菌菌株在TL液体培养基(1升中含10g聚胨，1g酵母提取物，5g NaCl，2g KH2PO4，5g葡萄糖，pH值为7.2)中，于34℃振荡培养过夜。通过离心收集增殖细胞。将细胞悬浮在含10mM NaCl，20mMTris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，0.5％SDS和100μg/ml蛋白酶K的溶液中，于50℃处理6小时。向该悬浮液中加入等体积酚/氯仿，室温振荡10分钟，离心获得上清。向上清中加入醋酸钠至终浓度0.3M，再加入2倍上清体积的乙醇来沉淀中间层的染色体DNA。将DNA用玻璃棒挑出，用70％乙醇洗涤，并溶解到合适体积的TE缓冲液中，从而获得染色体DNA溶液。
<2>GDHαβ基因的制备通过PCR，以上述染色体DNA为模板，以具有下面序列的寡核苷酸为引物扩增编码GDHγ-亚基、α-亚基及β-亚基的DNA片段。
<正向引物cF1>
5’-CATGCCATGGCACACAACGACAACAC-3’(SEQ ID NO12)<反向引物GDHbU1>
5’-GTCGACGATCTTCTTCCAGCCGAACATCAC-3’(SEQ IDNO13)扩增片段的C-末端是平端化的，然后N-末端用NcoI消化，然后将片段连接到相似处理的pTrc99A(Pharmacia)上。用获得的重组质粒转化大肠杆菌DH5α，在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上选取出现的菌落。所获得的转化子在液体LB培养基中培养，提取质粒。分析插入DNA片段，确认其大小约为3.8kb。该质粒命名为pTrc99Aγαβ。该质粒上的GDHαβ基因由trc启动子调控。pTrc99Aγαβ包含氨苄青霉素抗性基因。
<3>ccm系统质粒的制备用EcoT22I消化pTrc99Aγαβ，然后末端进行平端化。然后用NotI消化片段并进行琼脂糖凝胶电泳，分离和收集短的DNA片段。将该DNA片段插入到ScaI和NotI消化的pBBR122(MoBiTec)上，从而制备pBBGDHγαβ。
通过常规方法制备大肠杆菌JM109的染色体基因。即，该菌株在LB培养基(1升中含10g聚胨，5g酵母提取物，10g NaCl，pH值为7.0)中，于37℃振荡培养过夜。通过离心收集增殖细胞。将细胞悬浮在含10mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，0.5％SDS和100μg/ml蛋白酶K的溶液中，于50℃处理6小时。向该悬浮液中加入等体积酚/氯仿，室温振荡10分钟，离心获得上清。向上清中加入醋酸钠至终浓度0.3M，再加入2倍上清体积的乙醇来沉淀中间层的染色体DNA。将DNA用玻璃棒挑出，用70％乙醇洗涤，并溶解到合适体积的TE缓冲液中，从而得到JM109染色体DNA溶液。
通过PCR，以JM109染色体DNA为模板，以具有下面序列的寡核苷酸为引物扩增编码ccm系统基因的DNA片段。
<正向引物ECccmD1>
5’-TGGCCATGGTTGAAGCCAGAGAGTTACTTT-3’(SEQ IDNO14)<反向引物ECccmU1>
5’-TTATTTACTCTCCTGCGGCGACAAATGTTG-3’(SEQ IDNO15)扩增片段的末端是平端化的，然后N-末端用NcoI消化。该片段用ACCI消化，平端化，然后连接到NcoI消化的pBBGDHγαβ上，从而得到pBBJMccm。GDHαβ基因通过AccI消化、平端化和随后的NcoI消化pBBGDHγαβ而除去。
<4>将GDHαβ基因和ccm系统导入大肠杆菌用pTrc99Aγαβ和pBBJMccm转化大肠杆菌JM109，得到JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccm。
另外，用pTrc99Aγαβ转化大肠杆菌JM109，得到JM109/pTrc99Aγαβ作为对照。
这些转化子在10ml含有50μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素(JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccm)，或含有50μg/ml氨苄青霉素(JM109/pTrc99Aγαβ)的2×YT培养基中，于34℃振荡培养过夜。另外，洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株在10ml完全培养基中振荡培养过夜。通过离心从每个培养液的一部分中收集细胞，离心前加入含1％胆酸钠的10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)，再通过超声破碎细胞。然后通过离心破碎的悬浮液测定所获得的上清液中GDH活性。
GDH活性通过以下步骤进行测定。预先将47mM磷酸缓冲液(pH6.0)、20mM葡萄糖、2mM吩嗪硫酸甲脂和0.1mM 2，6-二氯酚-吲哚酚的混合物加热到37℃，然后加入样品进行反应。当混合物维持在37℃时，测定600nm处的吸收值变化可测定GDH活性。通过2，6-二氯酚-吲哚酚的分子消光系数(4.76mM/cm)测定GDH的活性。一个单位(U)的酶活性定义为每分钟1μmol 2，6-二氯酚-吲哚酚的氧化量。
结果表明，JM109/pTrc99Aγαβ、洋葱伯克霍尔德氏菌KS1和JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccm的GDH活性分别为0.3、1.4和32U/ml。这表明JM109/pTrc99Aγαβ很难表现出GDH活性，野生菌株洋葱伯克霍尔德氏菌KS1表现出较弱的GDH活性，而JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccm表现出非常高的GDH活性。另外，从JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccm中纯化出GDH复合物，并进行SDS-PAGE。结果确认了该GDH复合物与从KS1菌株中纯化的GDH复合物表现出相同的电泳模式(图1)。
工业应用根据本发明，含有洋葱伯克霍尔德氏菌葡萄糖脱氢酶α-亚基和β-亚基的酶复合物可在埃希氏菌中大量表达。
序列表<110>Arkray，Inc.
<120>葡萄糖脱氢酶的生产方法<130>G843-OPC4051<150>JP 2003-82739<151>2003-03-25<160>15<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2467<212>DNA<213>洋葱伯克霍尔德氏菌<220>
<221>CDS<222>(258)..(761)<220>
<221>CDS<222>(764)..(2380)<220>
<221>CDS<222>(2386)..(2466)<400>1aagctttctg tttgattgca cgcgattcta accgagcgtc tgtgaggcgg aacgcgacat 60gcttcgtgtc gcacacgtgt cgcgccgacg acacaaaaat gcagcgaaat ggctgatcgt 120tacgaatggc tgacacattg aatggactat aaaaccattg tccgttccgg aatgtgcgcg 180tacatttcag gtccgcgccg atttttgaga aatatcaagc gtggttttcc cgaatccggt 240gttcgagaga aggaaac atg cac aac gac aac act ccc cac tcg cgt cgc290Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg1 5 10cac ggc gac gca gcc gca tca ggc atc acg cgg cgt caa tgg ttg caa 338His Gly Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln15 20 25ggc gcg ctg gcg ctg acc gca gcg ggc ctc acg ggt tcg ctg aca ttg 386
Gly Ala Leu Ala Leu Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu30 35 40cgg gcg ctt gca gac aac ccc ggc act gcg ccg ctc gat acg ttc atg434Arg Ala Leu Ala Asp Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met45 50 55acg ctt tcc gaa tcg ctg acc ggc aag aaa ggg ctc agc cgc gtg atc482Thr Leu Ser Glu Ser Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile60 65 70 75ggc gag cgc ctg ctg cag gcg ctg cag aag ggc tcg ttc aag acg gcc530Gly Glu Arg Leu Leu Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala80 85 90gac agc ctg ccg cag ctc gcc ggc gcg ctc gcg tcc ggt tcg ctg acg578Asp Ser Leu Pro Gln Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr95 100 105cct gaa cag gaa tcg ctc gca ctg acg atc ctc gag gcc tgg tat ctc626Pro Glu Gln Glu Ser Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu110 115 120ggc atc gtc gac aac gtc gtg att acg tac gag gaa gca tta atg ttc674Gly Ile Val Asp Asn Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe125 130 135ggc gtc gtg tcc gat acg ctc gtg atc cgt tcg tat tgc ccc aac aaa722Gly Val Val Ser Asp Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys140 145 150 155ccc ggc ttc tgg gcc gac aaa ccg atc gag agg caa gcc tg atg gcc769Pro Gly Phe Trp Ala Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala Met Ala160 165 170gat acc gat acg caa aag gcc gac gtc gtc gtc gtt gga tcg ggt gtc817Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser Gly Val175 180 185gcg ggc gcg atc gtc gcg cat cag ctc gcg atg gcg ggc aag gcg gtg865Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys Ala Val190 195 200atc ctg ctc gaa gcg ggc ccg cgc atg ccg cgc tgg gaa atc gtc gag913Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile Val Glu205 210 215cgc ttc cgc aat cag ccc gac aag atg gac ttc atg gcg ccg tac ccg961Arg Phe Arg Asn Gln Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro Tyr Pro220 225 230tcg agc ccc tgg gcg ccg cat ccc gag tac ggc ccg ccg aac gac tac1009Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn Asp Tyr235 240 245 250ctg atc ctg aag ggc gag cac aag ttc aac tcg cag tac atc cgc gcg1057Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gln Tyr Ile Arg Ala255 260 265
gtg ggc ggc acg acg tgg cac tgg gcc gcg tcg gcg tgg cgc ttc att1105Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg Phe Ile270 275 280ccg aac gac ttc aag atg aag agc gtg tac ggc gtc ggc cgc gac tgg1153Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg Asp Trp285 290 295ccg atc cag tac gac gat ctc gag ccg tac tat cag cgc gcg gag gaa1201Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala Glu Glu300 305 310gag ctc ggc gtg tgg ggc ccg ggc ccc gag gaa gat ctg tac tcg ccg1249Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr Ser Pro315 320 325 330cgc aag cag ccg tat ccg atg ccg ccg ctg ccg ttg tcg ttc aac gag1297Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe Asn Glu335 340 345cag acc atc aag acg gcg ctg aac aac tac gat ccg aag ttc cat gtc1345Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe His Val350 355 360gtg acc gag ccg gtc gcg cgc aac agc cgc ccg tac gac ggc cgc ccg1393Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly Arg Pro365 370 375act tgt tgc ggc aac aac aac tgc atg ccg atc tgc ccg atc ggc gcg1441Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile Gly Ala380 385 390atg tac aac ggc atc gtg cac gtc gag aag gcc gaa cgc gcc ggc gcg1489Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala Gly Ala395 400 405 410aag ctg atc gag aac gcg gtc gtc tac aag ctc gag acg ggc ccg gac1537Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly Pro Asp415 420 425aag cgc atc gtc gcg gcg ctc tac aag gac aag acg ggc gcc gag cat1585Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala Glu His430 435 440cgc gtc gaa ggc aag tat ttc gtg ctc gcc gcg aac ggc atc gag acg1633Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ile Glu Thr445 450 455ccg aag atc ctg ctg atg tcc gcg aac cgc gat ttc ccg aac ggt gtc1681Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn Gly Val460 465 470gcg aac agc tcg gac atg gtc ggc cgc aac ctg atg gac cat ccg ggc1729Ala Asn Ser Ser Asp Met Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His Pro Gly475 480 485 490acc ggc gtg tcg ttc tat gcg agc gag aag ctg tgg ccg ggc cgc ggc1777Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly Arg Gly
495 500 505ccg cag gag atg acg tcg ctg atc ggt ttc cgc gac ggt ccg ttc cgc1825Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro Phe Arg510 515 520gcg acc gaa gcg gcg aag aag atc cac ctg tcg aac ctg tcg cgc atc1873Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser Arg Ile525 530 535gac cag gag acg cag aag atc ttc aag gcc ggc aag ctg atg aag ccc1921Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met Lys Pro540 545 550gac gag ctc gac gcg cag atc cgc gac cgt tcc gca cgc tac gtg cag1969Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr Val Gln555 560 565 570ttc gac tgc ttc cac gaa atc ctg ccg caa ccc gag aac cgc atc gtg2017Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg Ile Val575 580 585ccg agc aag acg gcg acc gat gcg atc ggc att ccg cgc ccc gag atc2065Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro Glu Ile590 595 600acg tat gcg atc gac gac tac gtg aag cgc ggc gcc gcg cat acg cgc2113Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His Thr Arg605 610 615gag gtc tac gcg acc gcc gcg aag gtg ctc ggc ggc acg gac gtc gtg2161Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp Val Val620 625 630ttc aac gac gaa ttc gcg ccg aac aat cac atc acg ggc tcg acg atc2209Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser Thr Ile635 640 645 650atg ggc gcc gat gcg cgc gac tcc gtc gtc gac aag gac tgc cgc acg2257Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys Arg Thr655 660 665ttc gac cat ccg aac ctg ttc att tcg agc agc gcg acg atg ccg acc2305Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met Pro Thr670 675 680gtc ggt acc gta aac gtg acg ctg acg atc gcc gcg ctc gcg ctg cgg2353Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala Leu Arg685 690 695atg tcg gac acg ctg aag aag gaa gtc tgacc gtg cgg aaa tct act ctc 2403Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val Val Arg Lys Ser Thr Leu700 705 710act ttc ctc atc gcc ggc tgc ctc gcg ttg ccg ggc ttc gcg cgc gcg2451Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu Pro Gly Phe Ala Arg Ala715 720 725gcc gat gcg gcc gat c 2467
Ala Asp Ala Ala Asp730<210>2<211>168<212>PRT<213>洋葱伯克霍尔德氏菌<400>2Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg His Gly Asp Ala Ala1 5 10 15Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln Gly Ala Leu Ala Leu20 25 30Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu Arg Ala Leu Ala Asp35 40 45Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met Thr Leu Ser Glu Ser50 55 60Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile Gly Glu Arg Leu Leu65 70 75 80Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala Asp Ser Leu Pro Gln85 90 95Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr Pro Glu Gln Glu Ser100 105 110Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu Gly Ile Val Asp Asn115 120 125Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe Gly Val Val Ser Asp130 135 140Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys Pro Gly Phe Trp Ala145 150 155 160Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala165<210>3<211>539<212>PRT<213>洋葱伯克霍尔德氏菌<400>3Met Ala Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser1 5 10 15Gly Val Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys20 25 30Ala Val Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile35 40 45Val Glu Arg Phe Arg Asn Gln Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro
50 55 60Tyr Pro Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn65 70 75 80Asp Tyr Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gln Tyr Ile85 90 95Arg Ala Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg100 105 110Phe Ile Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg115 120 125Asp Trp Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala130 135 140Glu Glu Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr145 150 155 160Ser Pro Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe165 170 175Asn Glu Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe180 185 190His Val Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly195 200 205Arg Pro Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile210 215 220Gly Ala Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala225 230 235 240Gly Ala Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly245 250 255Pro Asp Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala260 265 270Glu His Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ile275 280 285Glu Thr Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn290 295 300Gly Val Ala Asn Ser Ser Asp Met Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His305 310 315 320Pro Gly Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly325 330 335Arg Gly Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro340 345 350Phe Arg Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser355 360 365Arg Ile Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met370 375 380Lys Pro Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr385 390 395 400Val Gln Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg
405 410 415Ile Val Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro420 425 430Glu Ile Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His435 440 445Thr Arg Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp450 455 460Val Val Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser465 470 475 480Thr Ile Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys485 490 495Arg Thr Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met500 505 510Pro Thr Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala515 520 525Leu Arg Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val530 535<210>4<211>27<212>PRT<213>洋葱伯克霍尔德氏菌<400>4Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu1 5 10 15Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp20 25<210>5<211>16<212>PRT<213>洋葱伯克霍尔德氏菌<400>5Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala1 5 10 15<210>6<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述共有序列<220>
<221>UNSURE<222>(6，17，18，19，22)<223>Xaa＝未知<400>6Ala Asp Ala Ala Asp Xaa Ala Leu Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Asp Cys Xaa Ala Cys His20 25<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>7tgcaccgtgc ggaaatctac tctcact 27<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>8acttccttct tcagcgtgtc cgacatc 27<210>9<211>1441<212>DNA<213>洋葱伯克霍尔德氏菌<220>
<221>CDS<222>(121)..(1398)
<400>9tccgaacctg ttcatttcga gcagcgcgac gatgccgacc gtcggtaccg taaacgtgac 60gctgacgatc gccgcgctcg cgctgcggat gtcggacacg ctgaagaagg aagtctgacc 120gtg cgg aaa tct act ctc act ttc ctc atc gcc ggc tgc ctc gcg ttg168Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu1 5 10 15ccg ggc ttc gcg cgc gcg gcc gat gcg gcc gat ccg gcg ctg gtc aag216Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys20 25 30cgc ggc gaa tac ctc gcg acc gcc atg ccg gta ccg atg ctc ggc aag264Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys35 40 45atc tac acg agc aac atc acg ccc gat ccc gat acg ggc gac tgc atg312Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met50 55 60gcc tgc cac acc gtg aag ggc ggc aag ccg tac gcg ggc ggc ctt ggc360Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly65 70 75 80ggc atc ggc aaa tgg acg ttc gag gac ttc gag cgc gcg gtg cgg cac408Gly Ile Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His85 90 95ggc gtg tcg aag aac ggc gac aac ctg tat ccg gcg atg ccg tac gtg456Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val100 105 110tcg tac gcg aag atc aag gac gac gac gta cgc gcg ctg tac gcc tac504Ser Tyr Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr115 120 125ttc atg cac ggc gtc gag ccg gtc aag cag gcg ccg ccg aag aac gag552Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu130 135 140atc cca gcg ctg cta agc atg cgc tgg ccg ctg aag atc tgg aac tgg600Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp145 150 155 160ctg ttc ctg aag gac ggc ccg tac cag ccg aag ccg tcg cag agc gcc648Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala165 170 175gaa tgg aat cgc ggc gcg tat ctg gtg cag ggt ctc gcg cac tgc agc696Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser180 185 190acg tgc cac acg ccg cgc ggc atc gcg atg cag gag aag tcg ctc gac744Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp195 200 205gaa acc ggc ggc agc ttc ctc gcg ggg tcg gtg ctc gcc ggc tgg gac792Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp
210 215 220ggc tac aac atc acg tcg gac ccg aat gcg ggg atc ggc agc tgg acg840Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr225 230 235 240cag cag cag ctc gtg cag tat ttg cgc acc ggc agc gtg ccg ggc gtc888Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val245 250 255gcg cag gcg gcc ggg ccg atg gcc gag gcg gtc gag cac agc ttc tcg936Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser260 265 270aag atg acc gaa gcg gac atc ggt gcg atc gcc acg tac gtc cgc acg984Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr275 280 285gtg ccg gcc gtt gcc gac agc aac gcg aag cag ccg cgg tcg tcg tgg1032Val Pro Ala Val Ala Asp Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp290 295 300ggc aag ccg gcc gag gac ggg ctg aag ctg cgc ggt gtc gcg ctc gcg1080Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala305 310 315 320tcg tcg ggc atc gat ccg gcg cgg ctg tat ctc ggc aac tgc gcg acg1128Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr325 330 335tgc cac cag atg cag ggc aag ggc acg ccg gac ggc tat tac ccg tcg1176Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser340 345 350ctg ttc cac aac tcc acc gtc ggc gcg tcg aat ccg tcg aac ctc gtg1224Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val355 360 365cag gtg atc ctg aac ggc gtg cag cgc aag atc ggc agc gag gat atc1272Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ile Gly Ser Glu Asp Ile370 375 380ggg atg ccc gct ttc cgc tac gat ctg aac gac gcg cag atc gcc gcg1320Gly Met Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ala385 390 395 400ctg acg aac tac gtg acc gcg cag ttc ggc aat ccg gcg gcg aag gtg1368Leu Thr Asn Tyr Val Thr Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val405 410 415acg gag cag gac gtc gcg aag ctg cgc tga catagtcggg cgcgccgaca 1418Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg420 425cggcgcaacc gataggacag gag 1441<210>10<211>425
<212>PRT<213>洋葱伯克霍尔德氏菌<400>10Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu1 5 10 15Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys20 25 30Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys35 40 45Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met50 55 60Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly65 70 75 80Gly lle Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His85 90 95Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val100 105 110Ser Tyr Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr115 120 125Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu130 135 140Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp145 150 155 160Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala165 170 175Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser180 185 190Thr Cys His Thr Pro Arg Gly lle Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp195 200 205Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp210 215 220Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr225 230 235 240Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val245 250 255Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser260 265 270Lys Met Thr Glu Ala Asp lle Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr275 280 285Val Pro Ala Val Ala Asp Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp290 295 300Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala305 310 315 320
Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr325 330 335Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser340 345 350Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val355 360 365Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ile Gly Ser Glu Asp Ile370 375 380Gly Met Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ala385 390 395 400Leu Thr Asn Tyr Val Thr Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val405 410 415Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg420 425<210>11<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述血红素结合元件<220>
<221>UNSURE<222>(2，3)<223>Xaa＝未知<400>11Cys Xaa Xaa Cys His1 5<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>12catgccatgg cacacaacga caacac26<210>13
<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>13gtcgacgatc ttcttccagc cgaacatcac30<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述引物<400>15ttatttactc tcctgcggcg acaaatgttg30
权利要求
1.一种埃希氏菌(Escherichia)，该菌导入了以可表达形式存在的编码洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkhorderia cepacia)葡萄糖脱氢酶α-亚基和β-亚基的DNA，而且其ccm系统的表达是增强的。
2.权利要求1中的埃希氏菌，其中编码α-亚基的DNA位于编码β-亚基的DNA的上游，而且它们的表达由同一个启动子调控。
3.权利要求1中的埃希氏菌，该菌进一步引入以可表达形式存在的编码葡萄糖脱氢酶γ-亚基的DNA。
4.权利要求3中的埃希氏菌，其中编码γ-亚基的DNA位于编码α-亚基的DNA的上游。
5.权利要求1到4任何一项中的埃希氏菌，其中埃希氏菌是大肠杆菌。
6.一种生产葡萄糖脱氢酶复合物的方法，包括培养权利要求1到5任何一项中的埃希氏菌，使编码α-亚基和β-亚基的DNA得到表达从而生产葡萄糖脱氢酶复合物，并收集该复合物。
全文摘要
通过培养埃希氏菌，该菌导入以可表达形式存在的编码洋葱伯克霍尔德氏菌葡萄糖脱氢酶α－亚基和β－亚基的DNA，而且其ccm系统(细胞色素c成熟系统)的表达是增强的，表达上述DNA并产生葡萄糖脱氢酶复合物，以及收集该复合物的过程从而生产葡萄糖脱氢酶复合物。
文档编号C12N9/04GK1795264SQ200480014358
公开日2006年6月28日 申请日期2004年3月24日 优先权日2003年3月25日
发明者山冈秀亮, 星岛光博, 川濑至道, 黑坂启介 申请人:爱科来株式会社