专利名称：：生物相容的支架的制备方法及由该方法制备的支架的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物可降解和生物相容的、多孔聚合物支架的制备方法，该支架可用于细胞或组织培养的载体或基质。更具体地说，本发明涉及三维多孔聚合物支架的制备方法及由该方法制备的生物相容的支架，该支架由于采用泡腾盐而具有更好的生物相容性。用于生物组织培养的聚合物基本上要求其具有生物相容性和生物可降解性。以乳酸或乙醇酸为骨架单元的脂族聚酯由于符合美国食品与药品管理局的要求而被许可用作生物组织培养的聚合物，并且目前受到最为广泛的应用。这种生物相容和生物可降解的脂族聚酯的例子包括聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(己内酯)、聚(戊内酯)、聚(羟丁酸酯)、聚(羟戊酸酯)等。由于所述脂族聚酯具有生物相容性，因此其作为药物输送载体或长期缝合线已得到广泛的应用。发现PLGA通过控制乳酸单体和乙醇酸单体的比例和/或改变其合成过程赋予生物可降解聚合物各种降解周期。除要求用于生物组织培养的聚合物具有生物可降解性和生物相容性外，还要求其表面积足够大以使细胞高密度地粘附，要求其孔大小足够大使其在移植到宿主中后能够在培养的组织中血管化并传递物质如营养素、生长因子和激素，以及要求孔间的相互连通性。一般充分满足上述要求的多孔聚合物的支架制备如下。最普遍和可商购的支架由PGA缝合线(无纺PGA纤维网状物)组成。通过热处理任意缠绕的缝合线而将其制成三维的形状。所述网状物不仅具有高的孔间的相互连通性，而且具有非常高的孔隙率和足够大的孔大小，但由于其差的机械强度而限制了其应用范围(A.G.Mikos,Y.Bao,L.G.Cima,D.E.Ingber,J.P.Vacanti和R.Langer,J.Biomed.Mater.Res.(1993)27,183-189)。另一种多孔聚合物支架的制备方法是A.G.Mikos等的颗粒沥取法(A.G.Mikos,G.Sarakinos,S.M.Leite,J.P.Vacanti和R.Langer,Biometerials(1993)14,5,323-330;A.G.Mikos,A.J.Thorsen,L.A.Czerwonka,Y,Bao,R.Langer,D.N.Winslow和J.P.Vacanti,Polymer(1994)35,5,1068-1077)。颗粒沥取法的优点是根据所用盐(NaCl)的颗粒尺寸易于控制支架的孔大小，但其缺点是盐会保留在支架中或它们的粗糙形态会导致细胞损毁。此外，乳液冷冻干燥法和高压气体膨胀法也可用于这种支架的制备(K.Whang,C.H.Thomas,K.E.Healy,G.Nuber,Polymer(1995)36,4,837-842;D.J.Mooney,D.F.Baldwin,N.P.Suh,J.P.Vacanti和R.Langer,Biomaterials(1996)17,1417-1422)。尽管这些方法拥有其自身的优点，但由于难以制成开放的细胞的孔而受到限制。近年来，对采用聚合物溶液的相分离的优点形成支架的方法进行了尝试(H.Lo,M.S.Ponticiello,K.W.Leong,TissueEng.(1995)1,15-28;H.Lo,S.Kadiyala,S.E.Guggino,K.W.Leong,J.Biomed.Mater.Res.(1996)30,475-484;Ch.Schugens,V.Maguet.,Ch,Grandfils,R.Jerome,Ph.Teyssie,J.Biomed.Meter.Res.(1996)30,449-461)。如上所述，已发展了多种方法用于制备三维的聚合物支架，在该支架中可诱导细胞粘附和分化。然而，需要解决的问题是制备用于组织培养的具有生物可降解聚合物的三维支架。目前，只有极少的公司，如AdvancedTissueScienceInc.和TexasBiotechnologyInc，在这种支架的商业化上获得了成功，其中PGA缝合线已小规模应用。为克服上述缺点，本发明人进行了周密的研究并开发了一种用于组织培养的生物可降解三维多孔支架的制备方法，其中所获得的支架可模塑成所需要的形状并具有所希望的孔大小和孔隙率。因此，本发明的一个目的是提供一种具有改善的生物相容性的生物可降解三维多孔支架的制备方法。本发明的另一个目的是提供用于组织培养的具有各种孔大小和孔隙率的支架。本发明提供的生物可降解三维多孔支架的制备方法包括步骤(ⅰ)在一种有机溶剂中溶解一种聚合物以制备聚合物溶液；(ⅱ)在所得的聚合物溶液中混入一种泡腾盐获得一种聚合物/盐/有机溶剂混合的凝胶；(ⅲ)将有机溶剂从所述聚合物/盐/有机溶剂混合的凝胶中除去；和(ⅳ)将所述凝胶浸泡在酸性溶液中以使所述盐泡腾制得聚合物的支架。另外，本发明提供的生物可降解三维多孔支架的制备方法也可以是包括步骤(ⅰ)在一种有机溶剂中溶解一种聚合物以制备聚合物溶液；(ⅱ)向所得的聚合物溶液中加入一种非溶剂以使聚合物沉淀和浓缩从而形成聚合物凝胶；(ⅲ)在所述聚合物凝胶中混入一种泡腾盐获得一种聚合物/盐/有机溶剂混合的凝胶；(ⅳ)将有机溶剂从所述聚合物/盐/有机溶剂混合的凝胶中除去；和(v)将所述凝胶浸泡在酸性溶液中以使所述盐泡腾制得聚合物的支架。此外，本发明提供用于组织工程学的多孔聚合物支架，其特征在于支架的孔隙率和孔大小根据制备支架过程中所用的酸性溶液的浓度、泡腾盐的颗粒尺寸和用量而变化。本发明的上述目的、特征和其它优点通过下面结合附图的详细描述将更加清楚，其中图1是SEM照片，显示实施例1中制备的聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)基的多孔支架的放大的表面；图2a是SEM照片，显示实施例2中制备的聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)基的具有2毫米厚度、10毫米直径的多孔支架的表面；图2b是图2a的放大照片；图2c是SEM照片，显示实施例2中制备的聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)基的具有5毫米厚度、10毫米直径的多孔支架的表面；图2d是图2c的放大照片；图3a是SEM照片，显示实施例2中制备的聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)基的具有2毫米厚度、10毫米直径的多孔支架的横截面；图3b是图3a的放大照片；图3c是SEM照片，显示聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)基的厚度和直径均为10毫米的多孔支架的横截面；图3d是图3c的放大照片；图4是SEM照片，显示接种在图1的多孔支架上并培养了7天的鼠肝细胞；图5是光学显微照片，显示用于检测培养的细胞存活率的MTT评价后，存活的肝细胞的分布。在本发明的方法和支架公开或描述前，应该理解的是本文中所使用的术语仅仅是用于描述本发明的特定的实施方式，而不是限定本发明。必须注意的是在说明书和权利要求书中所使用的单数形式一个、一种和所述，除另有定义外，包括复数的指示物。在整个说明书和权利要求书中，所述出版物是本发明的参考，这些出版物中公开的全部内容并入本发明作为参考，以更充分地描述本发明涉及的现有技术的状况。在本发明中，用于组织培养的具有各种孔大小和孔隙率的支架的制备是基于相分离和颗粒沥取法。首先将一种聚合物溶解于一种有机溶剂中。优选所得的聚合物溶液为具有高粘度的高浓度溶液。本发明所使用的聚合物根据本发明的目的优选生物可降解和生物相容的聚合物。所述聚合物优选聚酯基聚合物，更优选脂族聚酯基聚合物，最优选选自聚(L-乳酸)(PLLA)、无定型聚(D，L-乳酸)(PDLLA)、聚(乙醇酸)、聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(己内酯)、聚(羟丁酸酯)、聚(二氧六环酯dioxanone)及这些聚合物的共聚物中的一种。所使用的聚合物的分子量可以不必考虑，但优选使用分子量范围为5000-500000的聚合物。用于溶解所述聚合物的有机溶剂的例子包括，但不限于，二氯甲烷、氯仿、丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二氧六环、四氢呋喃、乙酸乙酯、甲乙酮和乙腈。选择性地，所述聚合物溶液还可以与一种非溶剂混合以使该溶液浓缩成浓缩溶液的凝胶相。优选的情况下，用于本发明变通方法的所述非溶剂基本不溶解所述聚合物。非限制性的所述非溶剂的例子包括乙醇、甲醇、含水乙醇、异丙醇、乙醚、己烷、庚烷和石油醚。通过上述步骤，甚至可以用生物可降解的低分子量聚合物制备多孔的聚合物支架，所述生物可降解的低分子量聚合物由于其溶液甚至在高浓度时也表现出低的粘度，而不能常规地用作材料。然后，将所述聚合物溶液与泡腾盐均匀混合，接着从所获得的聚合物/盐/有机溶剂的混合凝胶中除去有机溶剂。在酸性溶液中浸泡不含溶剂的聚合物/盐的凝胶浆料以使所述盐泡腾，获得多孔结构。具有颗粒尺寸为100-500微米的泡腾盐选自碳酸铵、碳酸氢铵、碳酸钠和碳酸氢钠所组成的组中。优选盐的使用量为聚合物与泡腾盐的重量比可以在1∶1至1∶100的范围内。根据保留在聚合物/盐/有机溶剂的混合凝胶中的有机溶剂的类型，可以采用不同的方法除去该有机溶剂。具有相对低沸点的有机溶剂，如二氯甲烷、氯仿和二氧六环，通过在大气压下或真空中干燥除去；而对于高沸点的溶剂如二甲基亚砜和甲基吡咯烷酮，在用低沸点的溶剂如乙醇和甲醇替换后，通过在大气压下或真空中干燥除去。根据本发明，所述酸性溶液能使所述盐在相对较低的温度如室温并在短的时间内泡腾。此外，所述酸性溶液的浓度影响支架中所形成的孔的大小，使得孔大小可以由浓度进行控制。因此，用酸性溶液将所述盐泡腾可以防止聚合物的热损坏并能形成所希望的孔大小，以及如果必要，可将药物置于多孔支架中用于细胞培养。优选的情况下，所述酸性溶液是选自柠檬酸、盐酸、乙酸、甲酸、酒石酸、水杨酸、苯甲酸和谷氨酸的一种溶液。在使用时，将酸溶解于水或用有机溶剂如二氯甲烷、氯仿、二氧六环、二甲基亚砜和甲基吡咯烷酮饱和的水溶液中，浓度为1％或者过饱和。为产生颗粒支架，优选将获得的聚合物支架用没有反应活性的溶液如蒸馏水洗涤，然后用常规方法干燥如冷冻干燥、加热干燥和真空干燥。本发明的多孔支架的特征在于，可以通过改变酸性溶液的浓度、以及在上述过程中所使用的泡腾盐的颗粒尺寸和用量，来调控多孔支架的孔隙率和孔大小。在优选的情况下，本发明的多孔支架按上述方法制备。通过下列实施例可以更好地理解本发明，但这些实施例并不用来限制本发明。实施例1由聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和聚合物的溶液制备多孔支架在氯仿中，将重均分子量为180000的聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)65/35以30重量％的量溶解。分别以聚合物∶盐的重量比为1∶10、1∶15和1∶20，向所获得的高粘度的聚合物溶液中加入颗粒尺寸范围为180-300微米的碳酸氢铵，接着均匀混合，获得聚合物/盐/溶剂凝胶。将凝胶引入一个厚2毫米，直径为5毫米的聚四氟乙烯模具中，将凝胶中的溶剂通过在大气压下蒸发而排出。将从所述模具中分离出来的所述聚合物/盐混合物与3升的各种不同浓度(20％、40％、60％和过饱和)的柠檬酸溶液混合，并搅拌以泡腾所述盐。泡腾完成后，取出由此制备的多孔聚合物支架，用蒸馏水洗涤并真空干燥。用压汞孔率计(PorousMaterialsinc.,Ithaca,NY)，测量支架的孔隙率和总孔体积，结果列于下列表1中。表1所得的聚合物支架的孔隙率和孔体积<tablesid="table1"num="001"><table>柠檬酸浓度孔直径(微米)孔体积(毫升/克)孔隙率(％)20122.03±22.568.060398.0340142.49±36.248.39698.0460163.44±0.749.280398.11过饱和的186.24±22.869.984298.64</table></tables>观察支架的整体轮廓、表面和横截面的结构，并通过扫描电子显微镜(SEM)(Phillips535M)观察其内部的孔的构型，结果见图1。观察前，在5磅/平方英寸压力的氩气氛中在5毫安的电场下通过使用阴极真空喷镀机(Hummers,techniquesU.S.A)用金涂布所述聚合物支架5分钟。测量上述制备的多孔聚合物支架的压缩模量。在此方面，按照ASTMF451-95的标准，使用Instron5538以2毫米/分钟的速度在支架样品上垂直下降一个10牛顿(N)的负荷元件，所述样品为高12毫米、直径为6毫米的圆柱形。所得结果以及孔隙率列于下列表2中。表2所得的聚合物支架的孔隙率和压缩模量如表1所示，较高浓度的柠檬酸导致所述盐进行更活泼的泡腾反应，结果更多地增加了孔大小和孔隙率。此外，从表2的数据也可以看出，盐∶聚合物的重量比增加导致孔隙率的增加，同时降低所述聚合物支架的压缩模量。就是说，孔隙率的增加导致所述多孔支架的压缩模量的降低。实施例2由聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)通过聚合物的沉淀制备多孔支架在实施例1使用的聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)65/35的氯仿溶液中加入过量的乙醇并静置10分钟以沉淀所述聚合物，在浓缩后，所述聚合物的沉淀保持其在凝胶相中。以聚合物∶盐的重量比为1∶10，向所述不含有乙醇的聚合物沉淀中加入颗粒尺寸范围为180-300微米的碳酸氢铵。获得的聚合物/盐/溶剂凝胶浆料含有甚至比实施例1还少量的有机溶剂。将凝胶分别引入两个厚2毫米和5毫米，直径为5毫米的聚四氟乙烯模具中，将凝胶中的溶剂通过在大气压下蒸发而排出。将从所述模具中分离出来的所述聚合物/盐的混合物与3升的过饱和柠檬酸溶液混合并搅拌以泡腾所述盐。泡腾完成后，取出由此制备的多孔聚合物支架，用蒸馏水洗涤并真空干燥。按照实施例1的方法观察支架的整体轮廓、表面和横截面的结构，并通过扫描电子显微镜观察其内部的孔的构型，结果见图2和3。如图所示，本发明制备的多孔支架，不管其孔大小如何，都具有很好地相互连通并且均匀地分布于整个支架的均匀大小的孔。表3所得聚合物支架的孔直径、孔隙率和表面积从表3明显地看出通过聚合物沉淀和聚合物溶液制备的多孔聚合物支架之间的孔隙率和总孔体积没有明显的差异。实施例2描述的方法优于实施例1，其中仅有更少量的有机溶剂存在于聚合物/盐/有机溶剂凝胶中，这些有机溶剂可被容易地除去，因此如果必要，能使各种药物被有效地引入其中。测试例1用聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)多孔支架的细胞培养为了确认制备的多孔聚合物支架的三维细胞培养的稳定性，用已知技术(P.M.Kaufinann等，细胞移植(1997)6，5,463-468)，将鼠肝细胞移植到所述多孔聚合物支架上并培养7天(图4)。肝细胞的移植数量为在每多孔支架7×104-8×104的范围内。发现在该范围内的肝细胞的大约90-95％得到了有效的移植。相信这是由于引入的肝细胞均匀地分布在所述多孔支架上的结果，该多孔支架具有孔间的优越的相互连通性。将植入肝细胞的所述多孔支架在孵化器中在5％CO2存在下于37℃孵化7天以检测细胞的存活率。在此方面，进行MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,4-二苯基四唑鎓)的评价。如图5所示，存活的细胞均匀地分布于整个支架结构。下列表4给出孵化7天的细胞存活率以及肝细胞的微分函数的指标-分泌白蛋白的量。表4在多孔聚合物支架中培养7天的肝细胞的细胞存活率和分泌的白蛋白量<tablesid="table4"num="004"><table>孵化细胞的量(104/支架)存活率(在开始阶段存活的细胞数％)分泌的白蛋白(pg/细胞)1437.92450449.690272±4.0496492826.15077835.523805±6.8347334225.29830237.590655±2.8152565623.54362034.181293±0.199821</table></tables>根据表4的数据，在所述多孔聚合物支架中孵化7天后，存活细胞的数量降低约20-30％，并且随着孵化细胞数量的增加，在支架中培养的肝细胞的存活率和白蛋白的分泌量降低。正如上述描述，本发明提供了生物可降解和生物相容的多孔聚合物支架的制备方法，所述支架多孔并且孔间相通以容纳和培养与组织分离的细胞，所述组织是在活体外人工再生的，如软骨、骨、肝脏、心脏瓣膜、胃肠道和尿道等。所述支架是各种培养物的人工培养的优良基质。此外，基于在凝胶中通过盐的泡腾的孔的形成，所述方法具有易于控制三维多孔聚合物支架的孔大小和孔隙率的优点，所述凝胶由生物可降解聚酯聚合物和泡腾盐的混合物制备，所述方法通过控制泡腾盐的用量和颗粒尺寸以及诱导盐的泡腾和浸出的酸性水溶液的浓度来控制三维多孔聚合物支架的孔大小和孔隙率。本发明已以说明的方式进行了描述，应该理解的是所用的术语是描述性的而非限制性的。对本发明的多种修改和改变都可能落在本发明的保护范围内。因此，应该理解的是在本发明的保护范围内，可以以不同于本文特别描述的方式实施本发明。权利要求1．用于组织工程学的生物可降解和生物相容的多孔聚合物支架的制备方法，该方法包括下列步骤(ⅰ)在一种有机溶剂中溶解一种聚合物以制备聚合物溶液；(ⅱ)在所得的聚合物溶液中混入一种泡腾盐，得到聚合物/盐/有机溶剂混合的凝胶；(ⅲ)从所述聚合物/盐/有机溶剂混合的凝胶中除去有机溶剂；和(ⅳ)在酸性溶液中浸泡所述凝胶以使所述盐泡腾产生聚合物支架。2．用于组织工程学的生物可降解和生物相容的多孔聚合物支架的制备方法，该方法包括下列步骤(ⅰ)在一种有机溶剂中溶解一种聚合物以制备聚合物溶液；(ⅱ)向所得的聚合物溶液中加入一种非溶剂使所述聚合物沉淀并浓缩以形成聚合物凝胶；(ⅲ)向所得的聚合物凝胶中混入泡腾盐，得到聚合物/盐/有机溶剂混合的凝胶；(ⅳ)从所述聚合物/盐/有机溶剂混合的凝胶中除去有机溶剂；和(ⅴ)在酸性溶液中浸泡所述凝胶以使所述盐泡腾产生聚合物支架。3．根据权利要求1或2的方法，该方法还包括在浸泡步骤后的洗涤聚合物支架的步骤。4．根据权利要求3的方法，该方法还包括在洗涤聚合物支架的步骤后的干燥步骤。5．根据权利要求1或2的方法，其中所述聚合物为聚酯基聚合物。6．根据权利要求5的方法，其中所述聚酯基聚合物是脂族聚酯基聚合物。7．根据权利要求6的方法，其中所述脂族聚酯选自由聚(L-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)、聚(己内酯)、聚(羟丁酸酯)、聚(二氧六环酯)及这些聚合物的共聚物所组成的组中。8．根据权利要求1或2的方法，其中用于溶解所述聚合物的有机溶剂选自由二氯甲烷、氯仿、丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二氧六环、四氢呋喃、乙酸乙酯、甲乙酮和乙腈所组成的组中。9．根据权利要求2的方法，其中所述非溶剂基本上不溶解所述聚合物。10．根据权利要求9的方法，其中所述非溶剂选自由水、乙醇、甲醇、含水乙醇、异丙醇、乙醚、己烷、庚烷和石油醚所组成的组中。11．根据权利要求1或2的方法，其中所述泡腾盐选自由碳酸铵、碳酸氢铵、碳酸钠和碳酸氢钠所组成的组中。12．根据权利要求1或2的方法，其中所述酸性溶液是选自由柠檬酸、盐酸、乙酸、甲酸、酒石酸、水杨酸、苯甲酸和谷氨酸所组成的组中的一种的溶液。13．根据权利要求1或2的方法，其中所述聚合物的分子量范围为5000-500000。14．根据权利要求1或2的方法，其中所述泡腾盐的颗粒尺寸范围为100-500微米。15．根据权利要求1或2的方法，其中所述泡腾盐以所述盐与所述聚合物的重量比的范围为1∶1至1∶100的量混入。16．根据权利要求1或2的方法，其中所述酸性溶液的浓度范围为1％至过饱和浓度。17．用于组织工程学的多孔聚合物支架，其特征在于所述支架的孔隙率和孔大小根据制备所述支架的过程中所用的酸性溶液的浓度、泡腾盐的颗粒大小和用量的不同而变化。18．根据权利要求17的支架，其中所述支架按照权利要求1的方法制备。19．根据权利要求17的支架，其中所述支架按照权利要求2的方法制备。全文摘要一种用于组织工程学的生物可降解和生物相容的多孔聚合物支架的制备方法,该方法包括下列步骤:(i)在一种有机溶剂中溶解一种聚合物以制备聚合物溶液;(ii)在所得的聚合物溶液中混入泡腾盐,得到聚合物/盐/有机溶剂混合的凝胶;(iii)从聚合物/盐/有机溶剂混合的凝胶中除去有机溶剂;和(iv)在酸性溶液中浸泡所述凝胶以使所述盐泡腾产生聚合物支架。本发明的支架多孔并且孔间相通以容纳和培养与培养的组织分离的细胞。本发明方法的优点是易于用所述凝胶将细胞培养基质形成所需要的形状;并易于控制三维多孔聚合物支架的孔大小和孔隙率。文档编号C12N11/00GK1297042SQ0013263公开日2001年5月30日申请日期2000年11月16日优先权日1999年11月16日发明者尹准镇,朴泰宽申请人:韩国科学技术院