携带新黄素裂解酶基因的转基因植物的制作方法

专利名称：携带新黄素裂解酶基因的转基因植物的制作方法
技术领域：
本发明领域本发明涉及一种用于增强或降低植物的逆境耐性的DNA，和一种该DNA的转基因植物。
本发明背景由于不能自由移动，所以植物必须调节它们本身来适应各种逆境，例如，干旱、土壤中的盐和低温。在这些不利的环境因素中，干旱被认为对植物的生长影响最严重。为了在干旱的条件下生存，一些植物在进化过程中获得了一种生理学和/或形态学的特性，而其它许多植物也具有一种应答干旱逆境的机制来保护它们自己。植物中这些对于水短缺的应答和对于干旱环境的适应是由包括干旱条件下基因表达发生改变在内的各种生理变化引起的(Shinozaki，K和Yamaguchi-Shinozaki，K.，植物生理学(Plant physiol.)，115327-334，1997；Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.，“针对干旱逆境的分子应答(Molecular responses to drought stress)”在Shinozaki，K和Yamaguchi-Shinozaki(编辑)的“高等植物中针对冷、热和盐等不利环境的分子应答(Molecular responses to cold，drought，heat and salt stress in higherplants)”中，R.G.LANDES company，Austin，Texas，USA，pp.11-28，1999)。例如，在拟南芥属(拟南芥)中，已知干旱信息是通过脱落酸(ABA)依赖途径和脱落酸(ABA)非依赖途径进行传递来调控与干旱耐受性有关的基因表达。这些基因产物被认为具有调控例如渗透保护剂如蔗糖和脯氨酸的积累、蛋白质的半衰期、逆境信号传导途径和转录的功能(Bray，E.A.，Trends inPlant科学，248-54，1997；Bohnert，H.J.等，植物细胞，71099-1111，1995；Ingram，J.和Bartels，D植物生理学和植物分子生物学年鉴(Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.)，47377-403，1996；Shinozaki，K和Yamaguchi-Shinozaki，K.，植物生理学，115327-334，1997；Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K“针对干旱逆境的分子应答”在Shinozaki和Yamaguchi-Shinozaki(编辑)的高等植物中针对冷干旱、热和盐等不利环境的分子应答，R.G.LANDES company，Austin，Texas，USA，pp.11-28，1999)。
C40途径被认为是高等植物中的ABA的生物合成途径。该C40途径，亦称作类胡萝卜素途径，是通过玉米黄质的环氧化作用，合成堇菜黄素、新黄素、黄氧素、ABA醛(ABA aldehyde)，然后得到ABA(Zeevaart，J.A.D.和Creelman R.A.，39439-473，1998)。这一生物合成途径是通过对ABA生物合成的突变体进行生理学研究和分析后提出的。例如，从烟草(Nicotianatabacum)中分离的突变体aba2在催化玉米黄质发生环氧化反应的玉米黄质环氧化酶的基因(aba2)上具有一个突变(Marin E等，EMBOJ.，152331-2342，1996)。从玉米分离的突变体vp14在催化由新黄素向黄氧素转化的新黄素裂解酶的基因(vp14)上具有一个突变(Tan，B.C.等，美国国家科学院院报，9412235-12240，1997)。从拟南芥属植物中分离出了在催化由黄氧素转化为ABA醛的反应的酶中发生了突变的突变体aba3和氧化ABA醛生成ABA的反应中所涉及的突变体aba4(Schwartz，S.H.等，植物生理学，114161-166，1997；Leon-Kloosterziel，K.M.等，植物学杂志(Plant J.)，10655-661，1996)。
已知新黄素裂解酶基因(vp14)中发生了突变的玉米表现出易失水分和易枯萎的特性。然而，还不清楚使用新黄素裂解酶基因是否是可以改善植物的逆境耐性。
发明简述本发明的目的是提供一种编码用于改进植物逆境耐性的新黄素裂解酶的DNA，一种通过将所述DNA引进植物来提高植物逆境耐性的方法，和一种其中引进了新黄素裂解酶基因的转基因植物。本发明的另一个目的是提供一种用于降低植物逆境耐性的DNA，一种通过将所述DNA引进植物来降低植物逆境耐性的方法，和一种其中引进了所述DNA的转基因植物。植物逆境耐性的改进，例如，在植物培育中非常有用。
通过示差筛选制备于豇豆植物(Vigna unguiculata)的cDNA文库，该豇豆植物经脱水处理10小时后表现出很强的干旱耐受性，本发明人分离到对应于应答干旱处理有关的基因的cDNA克隆(CPRD65)。预测CPRD65 cDNA能编码被认为与脱落酸(ABA)生物合成有关的新黄素裂解酶。施加于8天龄(8-day-old)豇豆植物的干旱逆境强烈地诱导了ABA的积累和CPRD65的表达，表明CPRD65基因的密切相关性，尤其在应答干旱逆境方面。采用GST-CPRD65融合蛋白对酶活性的测定证实了CPRD65具有将9-顺式-新黄素裂解为黄氧素的活性。这些结果表明，CPRD65基因编码新黄素裂解酶并且其产物在干旱逆境下生物合成内源ABA的过程中起着关键性的作用。
尤其，通过以分离于豇豆植物的CPRD65基因的cDNA为探针从源自于拟南芥属植物的cDNA文库中筛选新黄素裂解酶基因，本发明人分离到了一种新型基因(AtNCED3)。另外，鉴定了从拟南芥属植物得到的与这些基因具有高度同源性的四种序列(AtNCED1，2，4和5)。这些基因在大肠杆菌(E.coli)中的表达和新黄素裂解活性的分析表明AtNCED1，3和5具有与CPRD65相同的的新黄素裂解酶活性。
本发明人采用AtNCED3，一种新黄素裂解酶基因，首次制备出一种拟南芥属的转基因植物。AtNCED3基因被连接到一个载体中的35S启动子的下游，并且通过真空渗入法将载体引进拟南芥属，所述载体用于以有义(一种过表达类型)或反义(一种表达抑制类型)方向将基因引进植物细胞(pBE2113N)。对所制备的转基因植物的干旱耐受性进行的评价表明过表达植物与它们的亲本株系比较，其逆境耐性有了显著的提高。相反，引进了反义的表达-抑制株系，其逆境耐受性降低了(

图15和16)。以这种方式，本发明人发现，实际上引进了新黄素裂解酶基因的转基因植物显著地增强了逆境耐性并且通过降低所述基因的表达显著地降低逆境耐性来完成本发明。
特别是，本发明涉及一种编码用于改进植物逆境耐性的新黄素裂解酶的DNA，一种通过将所述DNA引进植物来提高植物逆境耐性的方法，和引进了新黄素裂解酶基因的转基因植物，还涉及一种用于降低植物逆境耐性的DNA，一种通过将所述DNA引进植物来降低植物逆境耐性的方法，和引进了所述DNA的转基因植物，更具体地说，本发明提供了(1)一种分离到的DNA，该DNA编码具有用于改进植物逆境耐性的新黄素裂解活性的蛋白质，(2)一种分离的用于降低植物逆境耐性的DNA，其中所述DNA选自以下一组DNA(a)一种编码反义RNA的DNA，所述反义RNA与具有新黄素裂解活性的蛋白质的编码基因转录物互补；(b)一种编码具有核酶活性的RNA的DNA，所述核酶裂解具有新黄素裂解活性的蛋白质的编码基因转录物；和(c)一种编码RNA的DNA，所述RNA在植物细胞中通过共抑制效应抑制编码具有新黄素裂解活性的蛋白质的基因表达，(3)(1)或(2)的DNA，其中具有新黄素裂解活性的蛋白选自下列一组蛋白质(a)具有SEQ ID NOS2(AtNCED1)、6(AtNCED3)、10(AtNCED5)、12(CPRD65)、14(VP14)或16(LeNCED1)所示氨基酸序列的蛋白质，(b)具有SEQ ID NOS2(AtNCED1)、6(AtNCED3)、10(AtNCED5)、12(CPRD65)、14(VP14)或16(LeNCED1)所示序列中的一个或多个氨基酸发生了置换、缺失、添加，和/或插入的氨基酸序列的蛋白质，和(c)在严格条件下由与具有SEQ ID NOS1(AtNCED1)、5(AtNCED3)、9(AtNCED5)、11(CPRD65)、13(VP14)或15(LeNCED1)所示核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码的蛋白质，(4)(1)至(3)中的任意一种DNA，其中具有新黄素裂解活性的所述蛋白质源自于拟南芥属植物，(5)一种携带(1)至(4)中任意一项的DNA的转化植物细胞，(6)含有(5)中所述的转化植物细胞的转基因植物，(7)(6)中所述的转基因植物的子代或克隆的转基因植物，(8)(6)或(7)中所述的转基因植物，其中具有新黄素裂解活性的蛋白质的编码基因表达与其野生型相比被增强或降低了，(9)(6)至(8)中的任意一种转基因植物，其中脱落酸的量与其野生型相比增加或减少了，(10)(6)至(9)中任意一种转基因植物，其中与其野生型相比逆境耐性被提高或降低了，(11)一种(6)至(10)中的任意一种转基因植物的繁殖材料，(12)含有(1)至(4)中的任意一种DNA的载体，(13)一种用于生产(6)至(10)中的任意一种转基因植物的方法，包括步骤将(1)至(4)中的任意一种DNA引进植物细胞中并由所述植物细胞再生植物，(14)一种用于增强或降低植物的逆境耐性的方法，包括(1)至(4)中的任意一种DNA在植物细胞中的表达，(15)(1)中所述的DNA用于改进植物逆境耐性的用途，和(16)(2)中所述的DNA用于降低植物逆境耐性的用途。
本发明中，“逆境耐性”是指抵抗环境逆境的耐性，例如，干旱逆境耐性、盐逆境耐性、低温逆境耐性、空气污染逆境耐性、对于低氧条件的耐性、病原体耐性、药物如那些农用化学品耐性等。已知利用ABA进行外源处理能改进多种植物抵抗这些逆境的耐性(参考Takahashi，N.和Masuda，Y(编辑)，“植物激素手册(Plant Hormone Handbook)(The Last)，”Baifukan，日本，pp.78-160；以及其中引用的参考文献)。
附图简述图1表示经脱水或再水化作用的CPRD65基因表达的Northern印迹分析。由进行了0、1、2、4、6、8、10和12小时的脱水或脱水10小时后又进行了0、1、2、5、10和24小时的再水化作用的生长了8天(8-day-old)的豇豆植物制备总RNA。在每一电泳泳道上加上10μg的总RNA。将所述RNA在1％的琼脂糖凝胶中分级分离后，再印迹到尼龙膜上，并采用CPRD65克隆的[32P]-标记的cDNA插入片段进行探测。
图2表示CPRD65，VP14(玉米中的新黄素裂解酶，Schwartz，S.H.等，科学，2761872-1874，1997)和LeNCED1蛋白，番茄(Lycopersicon esculentum)中的新黄素裂解酶，Burbidge，A.等，实验植物学杂志472111-2112，1997；Burbidge，A.等，植物杂志17427-431，1999)的推测氨基酸序列的比较。虚线条表示为了优化排列顺序所引进的缺口。封闭框表示相同的氨基酸。阴影区域表示相似的氨基酸。
图3表示对源自于豇豆植物2246栽种品种的基因组DNA进行的SOUTHERN印迹分析。用EcoRI(E)、HindIII(H)和XbaI(X)消化基因组DNA(每泳道10μg)，在1％的琼脂糖凝胶中分级分离后，再转移到尼龙膜上使该膜与CPRD65 cDNA的[32P]-标记的片段进行杂交。“A”和“B”代表杂交条件的不同严格程度(参考实施例)。DNA片段的大小标记以kbp表示。
图4(A)表示通过高盐度(NaCl)、高温(加热)、低温(致冷)和使用脱落酸(ABA)对CPRD65基因进行诱导的Northern印迹分析。在指定时间处理后从豇豆植物中分离总RNA。每一泳道加上10μg的总RNA。每一泳道上端的数字表示处理持续的时间(小时)。
图4(B)表示没有经过或经过10小时脱水处理的CPRD65基因的Northern印迹分析。将从豇豆2246栽种品种的叶子(L)、茎(S)和根(R)中分离的总RNA各10μg加到每一泳道上。将所述RNA在1％的琼脂糖凝胶中分级分离后，再印迹到尼龙膜上，并采用CPRD65的[32P]-标记的cDNA插入片段进行探测。
图5表示GST(A)或GST-CPRD65重组蛋白(B)的类胡萝卜素代谢产物的HPLC峰图。反应混合物含有作为底物的顺式-新黄素。cN；顺式-新黄素，C25；C25-产物。
图6表示原生质体中的CPRD65N-sGFP嵌合蛋白质的质体导向。利用聚乙二醇(PGE)将携带有35S-sGFP(A、C、E)或35S-CPRD65N-sGFP嵌合构建体(B、D、F)的构建体转染到拟南芥的原生质体中。通过光学显微镜检(A，B)或带有绿色(E、F)或红色(C、D)滤光片的荧光显微镜检观察转染的原生质体。E和F表示GFP的定位，C和D表示叶绿体。
图7表示脱水期间ABA的积累与CPRD65的基因表达之间的关系。滞留在图1尼龙膜上的放射性如下所示定量和作图。ABA的定量方法如实施例所述。误差线表示标准误差。实验重复三次。
图8表示器官分离后脱水处理期间豇豆植物的叶(L)、茎(S)和根(R)中的内源ABA的积累。ABA的定量方法与实施例7中所述的相同(图7)。
图9表示AtNCED3和CPRD65的推测氨基酸序列之间的比较。虚线条表示为了优化排列顺序所引进的缺口。封闭框表示相同的氨基酸。阴影区域表示相似的氨基酸。
图10表示AtNCED1、2、3、4和5的氨基酸序列的排列顺序。虚线条表示为了优化排列顺序所引进的缺口。封闭框表示相同的氨基酸。阴影区域表示相似的氨基酸。
图11表示测定AtNCED1、2、3、4、5和CPRD65的氨基酸序列之间关系的种系发生(phylogenic)分析的结果，以及数据库中与它们有关的序列。LeNCED1(登记号Z97215)和VP14(登记号U95953)分别表示从番茄和玉米中分离的蛋白。
图12表示AtNCED基因在每一种逆境中的表达。
图13表示AtNCED3基因在AtNCED3-转化体中的表达。上面和下面的图分别表示AtNCED3基因在进行干旱逆境处理前和干旱逆境处理后的植物中的表达。表达有义AtNCED3基因(过表达)(A和B)的植物和表达反义AtNCED3基因(表达抑制)(C和D)的植物均使用两例植株。
图14表示AtNCED3-转化体中的内源ABA量。与野生型植物相比，表达有义AtNCED3基因(过表达)(A和B)的植物中的内源ABA量增大，而表达反义AtNCED3基因(表达抑制)(C和D)的植物中的内源ABA量减小。
图15表示新黄素裂解酶转基因植物的干旱耐性的测试结果，表明结束灌溉后14天的植物和叶子中的相对含水量。
图16表示新黄素裂解酶转基因植物的干旱耐性的测试结果，表明结束灌溉后17天的植物。
发明详述本发明涉及一种分离的DNA，该DNA编码具有用于改进逆境耐性的新黄素裂解活性的蛋白。已知新黄素裂解酶是一种与ABA生物合成有关的酶，然而，还没有证实在对植物的生长没有产生严重的影响条件下植物中引进编码这种酶的DNA是否确实导致了ABA的积累并改进了抵抗逆境的耐受性。
采用ABA进行的外源处理引起，例如，许多植物的生长抑制。已知在种籽中ABA也导致生长抑制(发芽的抑制)(参考Takahashi，N.和Masuda，Y(编)，“植物激素手册(The Last)，”Baifukan，日本，78-160页；以及其中引用的参考文献)。ABA含量的增加给植物带来了各种损伤。还没有报导通过外源基因造成ABA产生过量是否能导致逆境耐性的获得。采用ABA进行外源处理的传统实验方法需要高浓度的处理，其强烈地抑制了生长并妨碍了对耐性的精确测量。而且，外源性处理的实验没有确定出保证正常生长和获得耐性的合适ABA浓度。通过获得ABA生物合成基因和采用该基因来制备转基因植物，本发明人首次证实了植物的逆境耐性可以得到改进。
一种“分离DNA”是这样一种DNA，其结构不同于任何天然DNA结构或包括三个以上独立基因的天然基因组DNA片段的结构。因此该术语包括，例如，(a)一种具有天然存在于生物体基因组中的部分天然基因组DNA分子的序列的DNA；(b)结合到载体或原核或真核的基因组DNA上以致于所得分子不同于任何天然载体或基因组DNA的DNA；(c)分离的分子如cDNA、基因组片段、通过多聚酶链反应(PCR)制备的片段或限制性酶切片段；和(d)为杂交基因一部分的重组核苷酸序列，即编码融合蛋白的基因。特别是，除了这一定义以外，由不同的(i)DNA分子、(ii)转染细胞或(iii)细胞克隆，例如，源自于DNA文库如cDNA或基因组DNA文库的那些克隆所组成的混合物中存在的DNA分子。
作为用于增强逆境耐性的分离DNA，任何基因只要其编码具有新黄素裂解活性的蛋白，都能被使用。例如，玉米的VP14(Zea mays)(Schwartz，S.H.等，科学，2761872-1874，1997；Tan，B.V.等，美国国家科学院院报，9412235-12240，1997)(cDNASEQ ID NO13，蛋白质SEQ ID NO14)，番茄(Lycopersicon esculentum)的LeNCED 1(Burbidge，A.等，实验植物学杂志(J.Exp.Bot.)，472111-2112，1997； Burbidge，A.等，植物学杂志(Plant J.)17427-431，1999)(cDNASEQ ID NO15，蛋白质SEQ ID NO16)，将它们分离出来作为新黄素裂解酶基因。这些基因对改进逆境耐性有用并能用于本发明。另外，可以方便地使用编码AtNCED1(SEQ ID NO2)、AtNCED3(SEQID NO6)、AtNCED5(SEQ ID NO10)和CPRD65(SEQ ID NO12)的DNA(分别是SEQ ID Nos1、5、9和11)。尤其是，编码SEQ ID NO18所示的新黄素裂解酶的DNA(cDNASEQ ID NO17，蛋白质SEQ ID NO18)(Neill，S.J.等，实验植物学杂志491893-1894，1998，登记号AJ005813)也可用于本发明。编码具有新黄素裂解活性的蛋白质的DNA还可用作增强逆境耐性的试剂(逆境耐性增强剂)。本发明还提供了编码具有新黄素裂解活性的蛋白质的DNA用于增强逆境耐性的用途。
本发明的编码具有新黄素裂解活性的蛋白质的DNA包括基因组DNA、cDNA和化学合成DNA。基因组DNA和cDNA通过本领域技术人员公知的方法来制备。基因组DNA可通过，例如，按照常规方法从植物中提取基因组DNA来制备，包括制备基因组文库(其中，作为载体，例如使用质粒、噬菌体、粘粒和BAC)，以本发明所述DNA(例如，SEQ ID Nos1，5，9，11，13，15等)作为探针来进行菌落杂交或噬菌斑杂交。或者，也可通过采用特异于本发明DNA(例如，SEQ ID Nos1，5，9，11，13，15等)的引物进行PCR反应来制备基因组DNA。根据从植物中提取出来的mRNA合成cDNA来制备cDNA，将该cDNA插入到载体如λ噬菌体上来制备和形成cDNA文库，并以与上述相同的方式进行菌落杂交或噬菌斑杂交，或进行PCR反应。本发明的DNA不仅包括SEQ ID Nos1，5，9，11，13和15的DNA序列，而且还包括一种DNA，该DNA含有以编码每种蛋白质的氨基酸的密码简并性可选择的核苷酸序列。
本发明的DNA还包括，例如，编码一种蛋白质的DNA，该蛋白质含有SEQ ID Nos2，6，10，12，14或16中的一个或多个氨基酸发生了置换、丢失、增加、和/或插入的氨基酸序列，并且该蛋白质具有新黄素裂解活性。因此，本发明的DNA包括SEQ ID Nos1，5，9，11，13或15的突变体、衍生物、等位基因、变异体和同系物，一种从天然植物中衍生的基因。
由本发明的DNA编码的修饰蛋白含有的氨基酸序列至少70％(例如，80％、90％、95％或99％)与SEQ ID Nos2，6，10，12，14或16相同。如本文使用的，两个氨基酸序列或两个核苷酸的“同一性百分率”是利用在Karlin和Altschul(美国国家科学院院报905873-5877，1993)中修正的Karlin和Altschul算法(美国国家科学院院报，872264-2268，1990)来确定的。这一算法被编入Altschul等的NBLAST和XBLAST程序(分子生物学杂志215403-410，1990)中。利用NBLAST程序，比数＝100，字长＝12来进行BLAST核苷酸的搜索。利用XBLAST程序，比数＝50，字长＝3来进行BLAST蛋白的搜索。当两个序列之间存在缺口时，按照Altschul等中的描述使用缺口BLAST(核酸研究253389-3402，1997)。使用BLAST和缺口BLAST程序(例如，XBLAST和NBLAST)时，使用了每个程序的缺省参数。见http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
SEQ ID Nos2，6，10，12，14或16中一个或多个氨基酸被置换了的修饰蛋白优选地通过至少一个保守氨基酸的置换来制备。“保守氨基酸的置换”是指下组中与同组另一氨基酸有化学相似性侧链的氨基酸残基的置换。具有相似侧链的氨基酸残基组在本技术领域中已被定义。这些组包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，具有β-枝链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
制备这种编码具有修饰氨基酸序列的蛋白质的DNA的方法实例是本技术领域的技术人员熟知的，即利用PCR进行的体外诱变(Izawa，T.，“体外PCR诱变”在Shimamoto，K.和Sasaki，T.(主管s)，细胞技术，增刊，植物细胞技术系列VII，植物PCR实验方案，新版，151-158页，Shujunsha，日本)。在人工修饰的情况下，蛋白质中的氨基酸修饰通常在200个氨基酸的范围内，优选地在100个氨基酸的范围内，更优选地在50个氨基酸的范围内，进一步更优选地在10个氨基酸的范围内。由于核苷酸编码序列的修饰而导致的蛋白质的氨基酸修饰可以自然发生。编码野生型新霉素裂解酶的氨基酸序列中有一或多个氨基酸发生置换、丢失、加入、和/或插入，这样的编码DNA也包括在本发明中，只要其编码具有新黄素裂解活性的蛋白质。本发明的DNA还包括简并变异体，该简并变异体的核苷酸序列中的一个突变不导致蛋白质的氨基酸发生突变。
给定的DNA是否编码新黄素裂解酶可通过在大肠杆菌中表达该DNA来制备重组蛋白并按照以下实施例5，以顺式-新黄素为底物检测裂解活性来确定。
在编码已知新黄素裂解酶的DNA基础上，可分离到一种新型新黄素裂解酶基因。本技术领域的技术人员熟知的用于实现这一目的的方法实例是利用杂交技术的方法(Maniatis，T等，1982，分子克隆实验室指南，冷泉港，纽约，冷泉港实验室出版社)和聚合酶链反应(PCR)技术的方法(Nakayama，H.，细胞技术，增刊，生物学实验举例(Biological ExperimentIllustrated)，卷3，新版，Shujunsha，1998)。特别是，本技术领域的技术人员可通过以已知新黄素裂解酶基因的核苷酸序列(例如，SEQ ID Nos1，5，9，11，13，15等)或其部分序列为探针，并以与这些序列特异杂交的寡聚核苷酸为引物来从任何植物中常规地分离编码新黄素裂解酶基因的DNA。本发明中用于改进逆境耐性的DNA也包括能够通过这种杂交技术或PCR技术分离的编码新黄素裂解酶的DNA。
按照例如参考文献中的方法(Sambrook，J.等，分子克隆实验室指南，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY，1989)，以随机引物法制备的[32P]-标记的DNA为探针，在严格条件下进行杂交。将SOUTHERN印迹到尼龙膜上并与[32P]-标记的片段，在例如含有30％，优选50％的甲酰胺、6XSSC、5X Denhardt溶液和100μg/ml变性鲑精DNA的杂交溶液中，于37℃，优选42℃下进行杂交。在严格条件下，例如在1X SSC、0.1％SDS(室温)中洗涤15分钟、两次，优选(更严格地)在0.5X SSC、0.5％SDS(37℃)中洗涤15分钟、两次，更优选(更严格地)在0.1X SSC、0.1％SDS(60℃)中洗涤15分钟、两次，并进行放射自显影。“严格条件下的杂交”指在上述条件下利用碱基配对与固相参照核苷酸的特异性和非共价平衡结合。
为了使用这些DNA来制备逆境耐性得到改进的转基因植物，将所述DNA插入到合适的载体，并将该载体导入植物细胞，然后由转化的植物细胞再生为转基因植物。
任何能在植物细胞中表达插入基因的载体都可用作转化该细胞的载体。例如，可使用含有在植物细胞中稳定表达基因所需之启动子(例如，花椰菜花叶病毒的35S启动子)的载体和含有经外源刺激能激活的启动子的载体。或者，通过采用特异于植物组织的启动子诱导目的基因的表达，可专为对逆境高度敏感的组织提供逆境耐性。例如，利用特异性表达于种子中的基因的启动子，如菜豆的B-菜豆碱基因启动子(Bustos等，欧洲分子生物学组织杂志，101469-1479，1991)和大豆的大豆球蛋白基因启动子(Lelievre等，植物生理学，98387-391，1992)，特异性表达于叶子中的基因的启动子，如豌豆的RbcS基因的启动子，(Lam和Chua，科学，248471-474，1990)和小麦的Cab1基因的启动子(GotoRN等，植物志3509-518，1993)，特异性表达于根中的基因的启动子，例如番茄的TobRB7基因的启动子(Yamamoto等，植物细胞，3371-382，1991)等，可在组织中特异性表达目的基因。或者，可以使用具有由外源刺激物诱导激活的启动子的载体。一个响应环境逆境如干旱、盐或低温的启动子的实例是rd29A基因的启动子(Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki，K.，植物细胞，6251-264，1994)。本发明还优选地使用通过环境逆境如干旱和高盐浓度激活的启动子。这些启动子实例是下列基因的启动子拟南芥属AtNCED3基因、豇豆CPRD65基因等。尤其是，通过使用由药物诱导的表达系统，目的基因可以在合适的时间和合适的组织中表达。由类固醇激素(糖皮质激素)诱导的表达系统的实例是利用GVG基因(GAL4，VP16，糖皮质激素受体)的诱导系统(Aoyama T.和Chua，N.H.，植物杂志，11605-12，1997)。
载体可被插入到任何植物细胞中，例如，拟南芥(Arabidopsis thaliana)，水稻(Oriza sativa)，烟草(Nicotiana tabacum)，番茄(Lycopersicon esculentum)，土豆(Solanum tuberosum)，玉米(Zea mays)，鸟的脚三叶(birds’foottrefoil)(Lotus japonicus)等。也可使用其它的作物或树。植物可以是针叶树，阔叶树，双子叶植物，单子叶植物等。本文所用的“植物细胞”包括不同形式的植物细胞，例如，悬浮培养细胞，原生质体，叶子切片，愈伤组织等。
为了将载体引入植物细胞中，采用了本技术领域的技术人员已知的方法，例如，聚乙二醇方法，电穿孔方法，农杆菌属方法，真空渗入方法，粒子枪方法等。可采用本领域技术人员已知的方法根据植物细胞的类型从转基因植物细胞再生出植物。例如，水稻，拟南芥属等的转化体能够按照“Simamoto，K.，Okada K.(主管)，细胞技术，增刊，植物细胞技术系列4，模型植物实验方案，Shujunsha，Japan.”中描述的方法来制备。
一旦获得了其基因组中引进了本发明的DNA的转基因植物，可通过该植物的有性或无性繁殖得到子代。或者，由植物、它的子代或克隆得到繁殖材料(例如，种籽、果实、接穗、块茎、有块茎的根、茎干、愈伤组织、原生质体等)，并且可以由它们大量制备植物。本发明包括其中引进了本发明的DNA的植物细胞，含有该细胞的植物，该植物的子代或克隆，以及该植物、它的子代和克隆的繁殖材料。
与相应野生型植物比较，以这种方式制备的转化植物具有增加的ABA含量。或者，与相应野生型植物比较，以这种方式制备的转化植物具有改进的逆境耐性。逆境耐性可通过已知的方法进行比较。例如，如下面实施例所描述的，植物生长在逆境条件下，如干旱、高盐、低温或炎热的条件下，并且比较个体的生长情况。例如，通过测定表观、植物大小或组织如叶子、茎和根的大小、重量(湿重或干重)、颜色、相对生长速率、光合活性等作为指标来进行比较。逆境耐性可在植物的至少一种组织中得到增强。植物中的ABA含量通过例如免疫分析、薄层层析(TLC)、气相色谱(GC)和HPLC(参考Takahashi，N.和Masuda，Y(eds)，“植物激素手册(最后一版)，”Baifukan，日本，pp.1-21；以及其中引用的参考文献)来测定。例如，如实施例7所描述的，以标记的ABA作为内标，通过HPLC和GC/MS可最终可靠地定量初制的纯化级分。
通过本发明，一种有价值的作物能够生长在受环境逆境影响的地区，例如，干旱地区、寒冷地区或盐浓度高的地区。另外，本发明可使除作物以外的植物在植物栽培环境中。
本发明还涉及一种DNA，该DNA能够降低具有新黄素裂解活性的蛋白质的编码基因的表达水平，所述蛋白质用于降低逆境耐性。所述DNA也可用作降低逆境耐性的试剂(逆境耐性降低试剂)。本发明还提供了一种DNA的用途，该DNA能够降低具有新黄素裂解活性的蛋白质的编码基因的表达水平，所述蛋白质用于降低逆境耐性。
通过施用于杂草等，降低了逆境耐性的植物有利于从环境中除掉杂草等。例如，制备能够引起逆境耐性降低的植物来改善土地等。对于再生能力强的植物，例如杂草，在其由化学试剂(例如，糖皮质激素等)诱导的启动子的下游引进一个抑制新黄素裂解酶基因表达(例如，以反义方向)的构建体。这一转化的植物在没有使用化学试剂的条件下就能正常生长。将这种转化种子种植几年，喷洒糖皮质激素以便通过特异性降低杂草的逆境耐性而迅速除去杂草，并种植一种作物可改善干旱的土地。就作物而言，可种植能过表达新黄素裂解酶的转化作物(该植物中以有义方向引进了此酶的DNA)。
本发明首先成功地制备了一种转化植物，通过采用表达新黄素裂解酶基因的反义RNA的基因构建体，该转化植物中新黄素裂解酶的表达被人为地抑制了。与其野生型比较，该植物在非灌溉条件下容易枯萎，表明其逆境耐性降低(图15和16)。以这种方式，本发明建立了一种人工抑制具有新黄素裂解活性的蛋白质的编码基因表达并因此成功地降低植物逆境耐性的方法。
本发明中，为了降低植物逆境耐性，可降低具有新黄素裂解活性之蛋白质的编码基因的表达。本文中基因“表达”包括基因的转录和转录物的翻译。表达的抑制包括表达的完全终止。为了抑制具有新黄素裂解活性的蛋白质的编码基因的转录和翻译，可通过抑制编码该基因的DNA、其转录控制区域、或其转录物来抑制该基因的表达。
任何植物可被用于本发明，因此可使用各种植物。例如，可以使用拟南芥属等。具有新黄素裂解活性的蛋白质的编码基因并可作为抑制表达的靶子的实例是玉米的VP14(Zea mays)，(Schwartz，S.H.等，科学2761872-1874，1997；Tan，B.V.等，美国国家科学院院报9412235-12240，1997)(cDNASEQ ID NO13，蛋白质SEQ ID NO14)，番茄的LeNCED1(Lycopersicon esculentum)(Burbidge，A.等，实验植物学杂志472111-2112，1997；Burbidge，A.等，植物杂志17427-431，1999)(cDNASEQ ID NO15，蛋白质SEQ ID NO16)，AtNCED1(cDNASEQ ID NO1，蛋白质SEQ IDNO2)，AtNCED 3(cDNASEQ ID NO5，蛋白质SEQ ID NO6)，和/或拟南芥属的AtNCED 5(cDNASEQ ID NO9，蛋白质SEQ ID NO10)，豇豆的CPRD65(cDNASEQ ID NO11，蛋白质SEQ ID NO12)等。来自其它植物的同源基因也可以是一靶子。通过例如上文描述的杂交方法等可以鉴别和/或分离其它植物的同源基因。为了降低本发明中给定的植物的逆境耐性，可利用另一植物品种的基因或基因序列信息(例如，上述基因)，通过已知方法例如基因沉默和反义方法来抑制所需植物的靶基因的表达。因此，不需要分离也不需要鉴别目的植物的靶基因。
通过将抑制基因表达的DNA插入到合适的载体上，将该载体引入植物细胞中，由得到的转化细胞再生转基因植物能够抑制本发明中具有新黄素裂解活性的蛋白质的编码基因的表达。可以使用任何启动子，例如上述用于改进逆境耐性的启动子。例如，使用表达诱导型启动子只需在一种特定条件下就能降低逆境耐性。
作为抑制植物的特定内源基因表达的方法，本技术领域的技术人员最常使用的方法是反义技术。
反义方法是一种人工基因表达抑制方法，该方法中由靶mRNA与指定基因所转录的RNA的互补DNA分子(反义核酸)形成双链以抑制表达。1960年至1970年间建立了反义法抑制基因表达的方法，在1978年，Zamecnik等利用反义寡聚体成功地抑制了小鸡劳斯肉瘤病毒的复制和反转录酶的活性(Zamecnik，P.C.和Stephenson，M.L.，美国国家科学院院报，75280-284，1978)。
在用于引入反义DNA的方法中，将反义寡聚体直接引入细胞中，或通过将靶基因的反义DNA连结到表达载体上进行转化。下面给出的实施例对后一方法做出了说明。具体是，将具有新黄素裂解活性的蛋白质的编码基因的cDNA以反义方向连接到花椰菜花叶病毒的35S启动子下游以便将载体引进植物细胞。采用过渡基因表达方法，Ecker等通过显示植物中以电穿孔方法引进的反义RNA的反义效应首次说明了植物细胞的反义效应(Ecker，J.R.和Davis，R.W.，美国国家科学院院报，835372，1986)。此后，报道了烟草和矮牵牛植物中反义RNA的表达对靶基因表达的抑制(van derKrol，A.R.等，自然，333866，1988)。目前，反义方法被作为抑制植物中靶基因表达的好方法。用反义核酸抑制靶基因表达的模式包括通过三链的形成对转录起始产生的抑制，通过杂合体的形成对转录产生的抑制，所述杂合体含有由RNA聚合酶局部作用产生一个开环结构的位点，通过发生了合成的RNA杂合体的形成对剪接产生的抑制，通过与剪接体形成位点形成杂合体对剪接产生的抑制，通过与mRNA形成杂合体对由胞核到胞质的转移产生的抑制，通过与带帽位点或Poly(A)加入位点形成杂合体对剪接产生的抑制，通过与翻译起始因子结合位点形成杂合体对翻译的起始产生的抑制，通过与起始密码子侧翼的核糖体结合位点形成杂合体对翻译产生的抑制，通过与mRNA编码区域或多核糖体结合位点形成杂合体对肽链延伸产生的抑制，通过与核酸和蛋白之间的相互作用位点形成杂合体对基因表达的抑制等。这些抑制了转录、剪接或翻译过程，从而抑制了靶基因的表达(Hirajima和Inoue，“生物化学新实验2，核酸IV，基因的复制和表达”，日本生物化学会(编)，Tokyo-Kagakudojin，pp.319-347，1993)。
反义DNA的序列优选地是待转化的植物中与编码具有新黄素裂解活性的蛋白质的内源基因的转录物或其部分互补的序列，但是只要能够有效抑制基因的表达，但没有必要完全互补。转录RNA与靶基因的转录物优选地具有90％或更高的互补性，最优选地具有95％或更高的互补性。为了有效抑制使用反义序列的靶基因的表达，反义DNA的长度至少是15个或更多的核苷酸，优选地是100或更多的核苷酸，，更优选地是500或更多的核苷酸。通常，所使用的反义DNA短于5kb，优选地短于2.5kb。
采用编码核酶的DNA还能够抑制内源基因的表达。最近，对采用编码核酶的DNA来抑制基因的表达进行了研究。核酶是一种具有催化体内反应活性的RNA。核酶具有各种活性。针对核酶作为一种切割RNA的酶的研究使得设计一种用于在特异位点切割RNA的核酶成为可能。核酶包括I组内含子，有400或更多个核苷酸的大分子如包含在RnaseP中的M1RNA，和那些被称作锤头型和发夹型的核酶，其含有40个核苷酸长的活性结构域(Koizumi，M.，和Otsuka，E.，蛋白质，核酸和酶，352191，1990)。
例如，锤头型核酶的自切割结构域消化G13U14C15中的C15的3’位点。U14与第9位A之间碱基对的形成被认为对该活性非常重要，如果第15位核苷酸是A或U或C，那么也能被消化(Koizumi，M.等，FEBS Lett.，228225，1988)。如果核酶的底物结合位点被涉设计成能与靶位点侧翼的RNA序列互补，那么就产生了一种能够识别靶RNA中的UC，UU，或UA序列的限制酶样核酶(Koizumi，M.等，FEBS Lett.，239285，1988；Koizumi，M.，Otuska E.，蛋白质，核酸和酶，352191，1990；Koizumi，M.等，核酸研究，177059，1989)。例如，拟南芥属的AtNCED3基因的编码区存在上百个这样的位点。例如在烟草环斑病毒中的卫星RNA的负链中发现了发夹型核酶(Buzayan，J.M.，自然，323349，1986)。也显示该核酶能够被设计用来特异地切割靶RNA(Kikuchi，Y.和Sasaki，N.，核酸研究，196751，1992；Kikuchi，H.，化学和生物学，30112，1992)。
为了能在植物细胞中进行转录，将用于切割靶而设计的核酶与启动子例如花椰菜花叶病毒的35S启动子和转录终止序列连接。在转录RNA的5’端和3’端加入额外序列，就可以消除核酶的活性。在这种情况下，为了只从含有核酶的转录RNA上准确切除核酶部分，可以放置另一种在核酶部分的5端和3’端进行顺式剪切的剪切核酶(Taira，K.等，蛋白质工程，3733，1990；Dzianott，A.M.和Bujarski，J.J.，美国国家科学院院报.，864823，1989；Grosshans，C.A和Cech，R.T.，核酸研究，193875，1991；Taira，K.等，核酸研究，195125，1991)。另外，为了提高效率，将这一结构单元串联排列以切割靶基因中的多个位点(Yuyama，N.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1861271，1992)。可通过采用这类核酶来切割本发明的靶基因转录物，从而抑制其表达。优选特异地切割靶基因的转录物的核酶。可通过采用这类核酶来特异切割本发明的靶基因转录物以抑制其表达。
通过引进含有与靶基因序列相同或相似的序列的DNA而产生的共抑制也可抑制内源基因的表达。“共抑制”是指这样一种现象，其中通过转化将与内源靶基因序列相同或相似的基因引进植物来同时抑制引进的外源基因和内源靶基因的表达。还不清楚共抑制的详细机制，然而，在植物中却能经常观察到共抑制。(Curr.Biol.，7R793，1997；Curr.Biol.，6810，1996)。例如，通过制备含有具有新黄素裂解活性的蛋白质的编码基因或相似序列的载体DNA，用该载体转化目的植物，并以其中具有新黄素裂解活性的蛋白质的编码基因的表达降低这一特性对获得的植物中进行筛选以便获得其中具有新黄素裂解活性的蛋白质的编码基因的表达受到共抑制的植物。
尽管用于共抑制的基因不需要与靶基因完全相同，但是通常应具有至少70％或更高，优选地80％或更高，更优选地90％或更高的同一性。Genetyx(Software Development)，一种基因信息处理软件能被用于测定同一性或互补性。这一程序采用了Lipman-Pearson方法(Lipman，D.J.和Pearson，W.R.，科学，2271435-1441，1985)。这个方法首先比较序列数据，并计算具有高度同源性的序列之间的同一性，其中考虑了序列的缺失(GAP)。
通过采用用于本发明的上述抑制基因表达的DNA可以制备逆境耐性降低了的转化植物。具体是，通过将该DNA插入到合适的载体上，将该载体引入植物细胞中，由得到的转化细胞再生转基因植物。作为使用的载体，只要插入的基因能在植物细胞中表达，任何载体都可以以与上述增加逆境耐性时相同的方式来加以使用。任何植物细胞可以用来插入载体。植物可以是针叶树、阔叶树、双子叶植物(dicot)、单子叶植物等。本文引用的“植物细胞”包括各种形式的植物细胞，例如悬浮培养细胞、原生质体、叶子切片、愈伤组织等。
可通过采用本技术领域技术人员已知的方法，依据植物细胞的类型，以与改进逆境耐性时相同的方式将该载体引入植物细胞中并由转化细胞再生植物。一旦获得了其基因组中引进了本发明的DNA的转基因植物，通过有性或无性繁殖可由植物得到子代。或者，由植物、它的子代或克隆得到繁殖材料(例如，种籽、果实、接穗、块茎、有块茎的根、茎干、愈伤组织、原生质体等)，并且可以由它们大量制备植物。本发明涉及其中引进了本发明的DNA的植物细胞，含有该细胞的植物，植物的子代或克隆，以及植物、它的子代和克隆的繁殖材料。
与野生型植物比较，以这种方式制备的转化体植物具有降低的ABA含量。或者，与野生型植物比较，该转化体植物具有降低的逆境耐性。本发明可用于，例如杂草的有效清除。另外，采用上述的诱导型启动子，本发明的转化体植物可用于改善土质等。
本发明能够制备一种逆境耐性提高或降低的植物。逆境耐性改进的植物能够在至今植物不能生长的劣质土壤中生长。降低的逆境耐性可用于杂草而将杂草清除。本发明的方法可用于农业以扩大培育区域和提高作物产率。
将本文引用的任何专利、专利申请和公开出版物引入作为参考。
下面借助实施例来详细说明本发明，但并不是用于限制本发明。这些实施例中采用的实验条件如下所示。
豇豆的生长将豇豆种籽(Vigna unguiculata IT84S-2246-4)种植在盆中并在光周期为16小时的温室(除了自然光外，当光照不充足时补充人工光照)中生长8天，温度为25℃，浇水适量。
脱水处理为了进行脱水处理，将植物小心地从盆中拔出以免造成损伤，称重，并用3MM Whatman滤纸在室温和暗光(300lux)下大约60％的湿度下进行脱水。作为对照，将植物从盆中拔出后立刻转种在水份充足的土壤中，其中该土壤保持在与脱水处理组相同的条件下。
DNA的序列分析利用PI-100型自动质粒分离系统(Automatic Plasmid Isolation SystemModel PI-100)(KURABO)制备质粒DNA模板，并利用373A型DNA测序仪(ABI)进行测序。利用GeneWorks软件系统(IntelliGenetics，Inc.)，Sequencher 3.0(Hitachi软件)，和威斯康星大学基因计算机组(GCG)程序来分析核苷酸序列和氨基酸序列。
实施例1对应于由脱水诱导的基因的cDNA克隆的分离采用聚腺苷酸化(Poly(A)+)RNA构建cDNA文库，该聚腺苷酸化RNA是从按下述脱水逆境作用10小时后的8天龄的豇豆植物中分离出来的。
收获完整的植物，轻轻洗掉根上的土并用3MM Whatman滤纸在室温和暗光下大约60％的湿度下进行脱水。从通过上述方法脱水处理后的植物中制备全长RNA(Nagy，F.等，“转基因植物中基因表达的分析”在Gelvin和Schilperroort(编)，“植物分子生物学手册B4.，”Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，1-29页，1988)。按照参考文献(Sambrook，J.等，“分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)，将全长RNA两次通过寡脱氧胸苷酸(Oligo-dT)纤维素柱以便制备聚腺苷酸化RNA。大约2％的加样到柱上的RNA作为聚腺苷酸化RNA级分收集。利用cDNA Synthesis System Plus(Amersham Pharmacia Biotech)由聚腺苷酸化RNA合成双链cDNA。利用cDNA Cloning System(Amersham PharmaciaBiotech)由该cDNA构建cDNA文库。
采用由分离于未经逆境作用的豇豆植物的聚腺苷酸化RNA制备的cDNA和分离于经脱水逆境作用10小时的植物的聚腺苷酸化RNA制备的cDNA对cDNA文库进行示差筛选。按照参考文献(Sambrook，J.等，“分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)，通过噬菌斑杂交来从cDNA文库中筛选1×104个噬菌斑。
结果，从脱水10小时的豇豆植物中获得了与[32P]-标记的cDNA有较强杂交信号的噬菌斑。噬菌体克隆子的质粒区域进行体内切除后被用来转化大肠杆菌的细胞。利用限制性酶切图谱和该cDNA片段的边缘序列对获得的质粒cDNA片段进行分析。根据这些分析，将cDNA分组，并鉴别了称作CPRD(能应答脱水处理的豇豆)65的cDNA克隆。
通过RNA印记杂交分析经脱水诱导的对应于CPRD65克隆的基因的表达。从土壤中拔出8天龄的植物并进行不同时间的脱水处理，最长脱水时间为12个小时。作为对照，从土壤中拔出相似的豇豆植物并立刻转种到水份充足的土壤中。然后从脱水的植物和对照植物中分离出用于RNA印记杂交的全长RNA。
根据Nagy等的方法分离全长RNA(Nagy，F.等，“转基因植物中基因表达的分析”在Gelvin和Schilperoort(编)，“植物分子生物学手册B4.，”Kluwer Academic Plublishers，Dordrecht，1-29页，1988)，在含甲醛的1％的琼脂糖凝胶中进行分离，并转移到尼龙膜上(Sambrook，J.等，“分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。42℃下，在50％的甲酰胺、5X SSC、25mM的磷酸钠缓冲液(PH6.5)、10X Denhardt溶液和250μg/ml的变性鲑精DNA中将尼龙膜与[32P]-标记的CPRD65 cDNA片段进行杂交。膜在60℃下用0.1X SSC、0.1％SDS中洗涤15分钟、两次，并进行放射自显影。
图1表示对应于经脱水处理的CPRD65基因的表达的诱导过程。通过脱水逆境作用，CPRD65的表达水平明显提高。观察到开始脱水处理后的2个小时内积累了对应于CPRD65的mRNA。
脱水10小时的豇豆植物发生枯萎。转移到水分充足的土壤(再水化处理)后的4个小时内，这些枯萎的植物得到恢复。再水化后，CPRD65 mRNA的含量降低了(图1)。CPRD65基因对干旱逆境表现出典型且明显的反应，即通过脱水诱导转录和通过再水化降低其含量。这些事实表明CPRD65基因与干旱耐性有关。
实施例2CPRD65 cDNA的序列分析由于实施例1中分离到的CPRD65 cDNA片段可能不是全长，所以为了分离到全长cDNA(SEQ ID NO11)，还要以一种部分CPRD65 cDNA为探针再次筛选同一cDNA文库。由全长cDNA克隆(SEQ ID NO12)编码的氨基酸序列如图2表示。全长CPRD65 cDNA由2432个碱基对组成，包括由125个碱基对组成的5’-侧翼区和由486个碱基对组成的3’-侧翼区。在3’-侧翼区发现了一个聚腺苷酸化的共同序列(AATAAA)。这个序列具有一个编码612个氨基酸多肽的开放读框，推测该假定蛋白的分子量为67.6 kDa。如图2所示，将推测的CPRD65蛋白的氨基酸序列与蛋白数据库进行比较，结果表明与玉米(Zea mays)的VP14(61％)(Schwartz，S.H.，科学，2761872-1874，1997)和番茄(Lycopersicon esculentum)的新黄素裂解酶(69％)(Burbidge，A.等，实验植物学杂志472111-2112，1997；Burbidge，A.等，植物杂志，17427-431，1999)具有很高的同源性。就像VP14蛋白一样，推测的CPRD65在其N-末端区域似乎含有一个转运多肽。CPRD65、VP14和番茄的新黄素裂解酶的N-末端序列具有较低的序列相似性，但却具有结构相似性。
实施例3CPRD65基因的基因组SOUTHERN印迹分析为了分析与豇豆植物的CPRD65有关的基因，在两个严格的条件下进行基因组SOUTHERN印迹杂交(图3)。
按照参考文献的方法进行基因组SOUTHERN印迹分析(Sambrook，J.等，“分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。用限制酶消化10μg的基因组DNA，在1％的琼脂糖凝胶中进行分离，并印迹到尼龙膜上。在42℃条件下，滤膜与[32P]-标记的片段在30％的甲酰胺、6X SSC、5X Denhardt溶液和100μg/ml的变性鲑精DNA中进行杂交。在60℃条件下，用0.1X SSC、0.1％SDS将膜洗涤两次，各15分钟(B)或在37℃条件下，0.5X SSC、0.5％SDS洗涤两次，各15分钟(A)，并进行放射自显影。
通过测定其核苷酸序列，CPRD65 cDNA没有EcoRI和XbaI的内在限制酶切位点，而有HindIII的两个侧翼内在限制酶切位点。以CPRD65 cDNA作为探针，测出EcoRI和XbaI消化液中有一条杂交带和HindIII消化液中有两条杂交带。在上述严格的条件(A)下测出另外的一些模糊的杂交带。这些结果表明CPRD65基因与有关基因组成一个小基因家族。
实施例4CPRD65基因的RNA印迹分析分析各种环境逆境对CPRD65基因表达的影响。对于高盐浓度、ABA和水处理，以与脱水处理相同的方式将植物从土壤中拔出，并分别在含有250mM NaCl，100μM ABA和去离子水的溶液中通过含水培养进行生长。对于加热和冷处理，将盆中的植物分别转移到40℃和4℃的培养箱中。植物的各种逆境处理进行0、1、2、5、10和24小时。处理后，立刻用液氮冷冻被处理的植物，并分离RNA用于RNA印迹分析。
结果发现，这一基因的表达在高盐条件下受到很强的诱导，但不受冷或热逆境的诱导(图4A)。对于经ABA处理或水处理的情况，没有检测到CPRD65基因受到诱导。
为了确定干旱逆境下CPRD65基因表达的组织特异性，在正常或干旱条件下对从叶、茎、或根提取的全长RNA进行了RNA印迹杂交(图4B)。通过干旱处理，CPRD65转录物在茎和叶中受到强烈诱导，但在根中受到的诱导较弱。
实施例5细菌表达的CPRD65蛋白的酶活性CPRD65基因的推测氨基酸序列与由玉米VP14基因编码的新黄素裂解酶的氨基酸序列具有高度同源性(图2)。为了检验CPRD65基因是否编码新黄素裂解酶，分析在大肠杆菌中表达的重组CPRD65蛋白的生化特性。通过PCR扩增CPRD65编码区的DNA片段并利用pGEX4T-1(Pharmacia)将该片段与GST基因融合到同一读码框中来构建如下所述的嵌合质粒pGST-CPRD65。
采用引物5’-ATTGAATTCATGCCTTCAGCTTCAAAC-3’(SEQ IDNO19)和5’-ATTGGATCCCAAAAGCTACACGCTGGTCCCC-3’(SEQ IDNO20)，通过PCR扩增编码CPRD65蛋白的DNA。将PCR片段插入到pBluescript II SK+载体中的EcoRV位点上。证实插入的PCR片段的序列以测定通过PCR是否在核苷酸序列中发生了突变。利用限制酶(EcoRI和XhoI)，从pBluescript II SK+载体的核苷酸序列中没有发生任何突变的PCR片段作为DNA片段分离出，并将该片段插入到pGEX4T-1(Amersham PharmaciaBiotech)中的EcoRI至XhoI位点之间来构建pGST-CPRD65。用pGST-CPRD65或pGEX4T-1转化大肠杆菌菌株JM109的细胞并在37℃下于L肉汤培养基中进行培养。当D600达到大约0.5时，加入异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，在17℃下继续培养12小时。收集细胞，洗涤并悬浮在提取缓中液(10mM Tris-HCl(PH8.0)、5mM MgCl2，5％的甘油、0.1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和0.1mM二硫苏糖醇(DTT))中。按照GST基因融合系统的说明书手册(Amersham Pharmacia Biotech)纯化融合蛋白并用凝血酶消化。采用蛋白分析试剂盒(Bio-Rad)测定蛋白的浓度。
GST-CPRD65融合蛋白以与上述相同的方式在大肠杆菌中过表达，并利用谷胱甘肽-Sepharose 4B从细胞粗提物中纯化。对于该纯化的GST-CPRD65重组蛋白是否能消化顺-新黄素、反-堇菜黄素和顺-堇菜黄素来产生黄氧素进行了鉴定。
分析新黄素裂解酶活性的方法已被描述过了(Schwartz，S.H.等，科学，2761872-1874，1997)。从菠菜叶中制备顺-新黄素和反-堇菜黄素。从桔子皮中制备顺-堇菜黄素。反应混合物(100μl)含有100mM双-Tris(PH6.7)、0.05％的Triton X-100、10mM抗坏血酸、5mM FeSO4和蛋白样品。反应在室温下进行1小时。加入1ml水后，用正己烷(1ml x 2)萃取反应混合物后再用乙酸乙酯(1ml x 2)萃取。浓缩正己烷级分并用Nucleosil 5 C18柱(150mm长，8mm内径(i.d.))进行HPLC分析。以1.5ml/min的流速使用溶剂A(85％的乙醇)和溶剂B(氯仿和甲醇，1∶1)之间的线性梯度对柱进行洗脱。在25分钟内溶剂B的浓度从10％增加到50％，并在50％处保持5分钟。用紫外光检测仪在440nm处检测洗脱物的吸光度。在Nucleosil 5 C18柱(150mm长，8mm内径(i.d.))上，采用HPLC提纯乙酸乙酯级分。以1.5ml/min的流速采用50％的含水甲醇对柱进行洗脱，并用紫外光检测仪在260nm处检测洗脱物的吸光度。收集预测的黄氧素级分并进行GC-MS分析。每一步骤中，样品尽可能避光。
GC-MS分析如下进行。配有5890气相色谱(Hewlett Packard)的AUTOMASS质谱仪(Nippon Denshi)用于本分析。分析条件如下电离，EI70eV；柱，DB-5(15m长；0.25mmi.d.；0.25μm膜厚；J&W Scientific)；载体气体，He(1ml min-1)；进样温度，250℃；转线温度，250℃；和初始加热温度80℃。进样1分钟后开始，加热温度以30℃min-1的速率升高到200℃，接着以5℃min-1的速率进一步升高到230℃。
如图5所示，通过HPLC分析，在含有GST-CPRD65蛋白和顺-新黄素的反应混合物中检测到预测的C25-产品和黄氧素。通过GC-MS分析证实了黄氧素的存在，分析过程中观察到了黄氧素的离子特性。离子及其相对强度是m/z 250(4)，168(32)，149(77)，107(61)，和95(100)。由反-堇菜黄素没有生成黄氧素和C25-产物(没有显示数据)。这些结果不受凝血酶处理的影响，该凝血酶将GST-CPRD65重组蛋白分解成GST和CPRD65蛋白。
实施例6由拟南芥属植物制备的原生质体中作为转运肽的CPRD65蛋白的N末端区域分析CPRD65蛋白的N-末端区域具有与叶绿体导向有关的转运肽的典型结构特征。CPRD65蛋白的这一结构特征表明成熟的CPRD65蛋白定位在含有叶绿体的质体上。为了分析N-末端区域作为转运肽的作用，构建了编码CPRD65蛋白的N-末端区域(1-148)的嵌合基因35S∷CPRD65N-sGFP，该嵌合基因位于CaMV 35S启动子和水母Aequorea victoria的合成绿开花期(synthetic green florescent)蛋白(sGFP)基因之间(Chiu，W.，等，现代生物学(Curr.Biol.)，6325-330，1996)。
采用引物 5’-ATATATCTAGAATGCCTTCATCAGCTTCAAACACTTGG-3’(SEQ ID NO21)和5’-ATATAGGATCCCTCCGGCACCGGCGCGAAGTTCCCG-3’(SEQ ID NO22)，通过PCR扩增对应于CPRD65蛋白N-末端肽(1至148个氨基酸)的DNA。将PCR片段插入到pBluescript II SK+载体中并证实通过PCR没有引起序列发生突变。将该DNA片段插入到35S-启动子与过渡表达载体的sGFP基因之间的位点上(Chiu，W.，等，现代生物学，6325-330，1996)。按照上文中描述的方法进行制备、DNA转染和拟南芥属原生质体的培养(Abel，S.和Theologis，A.，植物杂志，5421-427，1994)。
通过DNA-转染方法将35S∷CPRD65-sGFP融合构建体及其对照构建体(35S∷sGFP)引进由拟南芥属制备的原生质体中(Abel，S.和Theologis，A.，植物杂志，5421-427，1994)。转化2-4天后，通过荧光显微术观察原生质体。如图6所示，当在原生质体中过渡表达35S∷sGFP构建体时，荧光定位不在质体中。另外，当引进35S∷sGFP构建体时，荧光定位不在质体中，而主要是定位在细胞质中。这些结果表明，CPRD65蛋白的N-末端区域作为转运肽起着将CPRD65蛋白导向到质体的作用。预测CPRD65蛋白定位在质体中，在质体中发挥着产生ABA的作用。
实施例7通过脱水逆境作用在8天龄的豇豆植物中的ABA积累通过脱水条件测定8天龄的豇豆植物中内源ABA含量的积累。
将样品在液氮中进行均质并用含水甲醇(20-80％)提取两次。加入[2H3]ABA之后，浓缩提取物，并进行标准溶剂分馏过程以便得到酸性-乙酸乙酯可溶级分。通过以前报道的方法(Wijayanti，L.，等，Biosci.Biotech.Biochem.，591533-1535，1995)，采用结合洗脱柱体(C18和DEA，Varian)进行纯化。然后采用Senshu PakODS-2101-N柱(100mm长，6mm的内径，SenshuScientific Co.)对从没有干燥的植物中纯化的样品进行HPLC分析。分析条件与前面所报道的相同(Wijayanti，L.，等，Biosci.Biotech.Biochem.，591533-1535，1995)。采用醚性重氮甲烷将如此纯化的样品甲基化并进行GC-SIM分析。
如图7所示，ABA在脱水后2小时内开始积累。ABA在经10小时脱水的植物中的含量比未经逆境的对照植物中的高140倍。CPRD65 mRNA积累时间比ABA mRNA积累时间要早。
在叶和茎中CPRD65基因的表达受干旱逆境的强烈诱导，而在根中受到很小的诱导作用(图4B)。检测了在干旱逆境作用下CPRD65基因的表达与内源ABA的积累之间的关系。将8天龄的豇豆植物分割成叶、茎和根，然后进行脱水。分别测定这些器官在脱水处理前或后的内源ABA含量。如图8所示，通过干旱逆境作用，叶和茎中积累了大量的内源ABA，而根中积累得很少。干旱逆境作用下的ABA积累的组织特异模式与图4B和8中所示的CPRD65基因的表达模式一致。
实施例8豇豆叶中的叶黄素的分析分析豇豆叶中的叶黄素以便发现与CPRD65蛋白有关的物质。
样品采用丙酮提取两次，浓缩提取物，溶解在80％的甲醇(1ml)中，并加样到结合洗脱C18柱上。用另外的4ml、80％的甲醇洗柱，并用5ml的甲醇-水-氯仿(71∶9∶20)洗脱叶黄素。浓缩洗脱物并采用Nucleosil 5 C18柱和Senshu Pak Silica-225 1-S柱(250mm长，6mmd内径)进行HPLC分析。ODS-HPLC采用的条件与上述相同。对于Silica-HPLC，使用的流速为1.5ml/分钟，溶剂B浓度的线性梯度是在30分钟内从10％到100％，其中溶剂A是乙酸乙酯-正己烷(1∶1)，溶剂B是乙酸乙酯。利用叶黄素的可见光谱和紫外光谱数据鉴定叶黄素。
通过可见光和紫外光分光光度分析，检测到豇豆叶中反-新黄素、反-堇菜黄素和顺-新黄素为主要叶黄素，顺-堇菜黄素为少量成分(没有显示数据)。在正常生长条件和干旱条件下，反-新黄素、反-堇菜黄素和顺-新黄素的内源含量没有明显的区别。
如上所示，豇豆干旱-诱导型CPRD65基因编码新黄素裂解酶，其产品定位于质体中。在干旱和高盐条件下，CPRD65基因主要在叶和茎中被强烈诱导。观察到在干旱条件下，叶和茎中ABA的大量积累，这表明一种类似于CPRD65基因的表达模式。这些结果有力地说明了CPRD65蛋白主要是一种与干旱逆境作用下豇豆植物中ABA的生物合成有关的酶。
实施例9编码新黄素裂解酶基因的同系物的拟南芥属cDNA克隆的分离以CPRD65为探针，筛选拟南芥属的cDNA文库(Abe H.等，植物细胞，9；1859-1868，1997)。结果，获得了许多具有强杂交信号的噬菌斑。从这些噬菌斑中分离出噬菌体克隆，用限制酶切出cDNA区域以便插入到pBluescrip SK+中并转化大肠杆菌。通过DNA序列分析，将这些克隆归为一组。将其命名为AtNCED3。该AtNCED3显示出与编码新黄素裂解酶的CPRD65具有高度的同源性(图9)。AtNCED3 cDNA的核苷酸序列和AtNCED3蛋白的氨基酸序列分别由SEQ ID NO5和6表示。
实施例10AtNCED1、2、4和5的分离，种系发生树(phylogenic tree)的分析利用CPRD65和AtNCED3的核苷酸序列搜索DNA数据库，鉴定出具有高度同源性的四个序列(登记号AL021713，AL021687，AJ005813，AB028621)。
为了分离与AL021713序列具有高度同源性的基因，以gDNA为模板和以5’-CCCGGGATCCCTCAAGCCTCTCTATACCG-3’(SEQ ID NO23)和5，-CCCGGGATCCTTTATACGGATTCTGAGGGAG-3’(SEQ ID NO24)为引物，通过PCR法扩增靶基因片段。以该片段为探针，从gDNA文库(Clontech)中分离含有靶基因的克隆。以5’-CCCGGGATCCCTCAAGCCTCTCTATACCG-3’(SEQ ID NO23)和5’-CCCGGGATCCTTTATACGGATTCTGAGGGAG-3’(SEQ ID NO24)为引物，再次通过PCR方法扩增该基因，并将该基因克隆到pBluescript II SK+(Stratagene)中EcoRV位点上来测定核苷酸序列。该基因被命名为AtNCED1。AtNCED1 cDNA的核苷酸序列和AtNCED1蛋白的氨基酸序列分别由SEQ ID NO1和2表示。
为了分离与AL021687序列具有高度同源性的基因，以gDNA为模板和以5’-ATTGAATTCATGGACTCTGTTTCTTCTTCTTCC-3’(SEQ ID NO25)和5’-ATTGAATTCTTAAAGCTTATTAAGGTCACTTTCC-3’(SEQ ID NO26)为引物，通过PCR法扩增靶基因片段。以该片段为探针，从gDNA文库(Clontech)中分离含有该靶基因的克隆。以5’-ATTGAATTCATGGACTCTGTTTCTTCTTCTTCC-3’(SEQ ID NO25)和5’-ATTGAATTCTTAAAGCTTATTAAGGTCACTTTCC-3’(SEQ ID NO26)为引物，再次通过PCR方法扩增基因，并将该基因克隆到pBluescript II SK+(Stratagene)中EcoRV位点上来测定核苷酸序列。该基因被命名为AtNCED2。AtNCED2 cDNA的核苷酸序列和AtNCED2蛋白的氨基酸序列分别由SEQ ID NO3和4表示。
为了分离与AJ005813序列具有高度同源性的基因，以gDNA为模板和以5’-AAGAATTCATGGCGGAGAAACTCAGTGATGGCAGC-3’(SEQ IDNO27)和5’-AAAAGAATTCGGCTTATATAAGAGTTTGTTCCTG G-3’(SEQID NO28)为引物，通过PCR扩增靶基因片段。以该片段为探针，从cDNA文库(Clontech)中分离含有靶基因的克隆。以5’-AAGAATTCATGGCGGAGAAACTCAGTGATGGCAGC-3’(SEQ ID NO27)和5’-AAAAGAATTCGGCTTATATAAGAGTTTGTTCCTGG-3’(SEQ ID NO28)为引物，再次通过PCR方法扩增基因，并将该基因克隆到pBluescript II SK+(Stratagene)中EcoRV位点上来测定核苷酸序列。该基因被命名为AtNCED4。AtNCED4 cDNA的核苷酸序列和AtNCED4蛋白的氨基酸序列分别由SEQ ID NO7和8表示。
为了分离与AB028621序列具有高度同源性的基因，从P1克隆MUJ8中分离DNA。以5’-CGGGATCCATGCAACACTCTCTTCGTTCTGATCTTCTTC-3’(SEQ ID NO29)和5’-CGGGATCCTCAGAAAACTTGTTCCTTCAACTGATTCTCGC-3’(SEQ ID NO30)为引物，通过PCR方法扩增基因，并将该基因克隆到pBluescript II SK+(Stratagene)中EcoRV位点上来测定核苷酸序列。该基因被命名为AtNCED5。AtNCED5 cDNA的核苷酸序列和AtNCED5蛋白的氨基酸序列分别由SEQ ID NO9和10表示。
图10显示了AtNCED1至5的氨基酸序列的对比排列。为了检测由每一序列推导出的氨基酸序列与数据库中的序列之间的关系，进行种系发生树分析(图11)。利用基因分析软件Gene Works(Intelligenetics，Inc.)构建种系发生树。公式采用UPGMA(由Nei，M.撰写的，并由Gojo，H.和Saito，N.，Baifukan翻译的Unweighted Pair Group Method with ArithmeticMeanMolecular Evolutionary genetics，252-256页，Japan)。
实施例11AtNCED基因的RNA印迹分析通过RNA印迹分析来分析各种环境逆境对每一鉴定的AtNCED基因表达的影响。
在琼脂平板上生长三周的植物被用于进行每种逆境处理。对于脱水逆境，从琼脂培养基中拔出植物，并在滤纸上风干(相对湿度为50％)。对于盐逆境、ABA处理和作为对照的水处理，从琼脂培养基中拔出植物，并放入分别含有250Mm NaCl溶液，100μM ABA溶液和蒸馏水的培养皿中，以便只将根浸入，盖上盖于室温下保持一段时间。对于冷和热逆境，将琼脂平板分别放置在4℃和40℃的恒温箱中保持一段时间。
在液氮中磨碎经上述各种逆境处理的植物，提取全长RNA(Nagy F，KaVSA和Chua N-H(1988)转基因植物中基因表达的分析。在Gelvin和Schilperoort(编)，植物分子生物学手册B4.Kluwer Academic Publishers，Dordrechrt，1-29页)，并取每一样品20μg点样到1％琼脂糖凝胶的每一泳道上进行电泳。电泳后将RNA从凝胶印迹到尼龙膜上，以[32P]-标记的cDNA为探针进行RNA印迹分析(Sambrook，J.，Fritsch EF和Maniatis T(1989)“分子克隆实验室手册”第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)。
结果发现AtNCED3基因表达受到干旱、高盐浓度和冷条件的强烈诱导。加热条件不诱导表达。另外，对于ABA或水处理，没有观察到AtNCED3基因表达受到诱导(图12)。
实施例12细菌表达的AtNCED蛋白的酶特性推导的AtNCED3基因的氨基酸序列与编码新黄素裂解酶的豇豆CPRD65基因的氨基酸序列具有高度同源性(图9)。为了检验AtNCED3基因是否编码新黄素裂解酶，分析了由大肠杆菌表达的重组AtNCED3蛋白的生化特性。
以克隆的AtNCED3 cDNA为模板，以5’-ATTGAATTCATGGCTTCTTTCACGGCAACGGC-3’(SEQ ID NO31)和5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’(SEQ ID NO32)为引物，通过PCR方法扩增编码AtNCED3蛋白的DNA。将该PCR片段克隆到pBluescript II SK+(Stratagene)中EcoRV位点上。证实插入的PCR片段以确定通过PCR合成的核苷酸序列是否产生了突变。将其中没有检测到任何突变的DNA片段以框架形式克隆到含有谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因的pGEX4T-1中的EcoRI位点上(Amersham Pharmacia Biotech)来构建嵌合质粒pGST-AtNCED3。用pGST-AtNCED3或pGEX4T-1转化大肠杆菌菌株JM109的细胞并在37℃下于L肉汤培养基中进行培养。当OD600达到大约0.5时，加入异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，在17℃下继续培养12小时。收集大肠杆菌细胞，洗涤并悬浮在提取缓冲液(10mMTris-HCl(PH8.0)、5mM MgCl2，5％d的甘油、0.1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和0.1mM二硫苏糖醇(DTT))中。使用谷胱甘肽-Sepharose 4B[GST基因融合系统(Amersham Pharmacia Biotech)]按其说明书纯化融合蛋白并用凝血酶消化。用蛋白分析试剂盒(Bio-Rad，CA，USA)测定蛋白浓度。
新黄素裂解酶活性分析的结果表明，在含有GST-AtCED3蛋白和顺-新黄素的反应混合物中检测到了预期的C25产物和黄氧素，证明AtNCED3蛋白具有新黄素裂解活性。类似的实验在AtNCED1和AtNCED5中检测到了新黄素裂解活性。
实施例13转基因植物的制备以拟南芥属(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.ecotype Columbia)作为样品。采用培养土壤在9cm-直径的塑料盆中播种野生型拟南芥属植物，以16小时的光周期在22℃下生长6星期，然后用于转化。
由含有卡那霉素抗性标记和花椰菜花叶病毒的35S启动子的pBE2113载体构建不含GUS报道基因的载体(pBE2113NOT)(Mitsuhara，I.等，植物细胞生理学，3749-59，1996)，将从拟南芥属中分离到的AtNCED3的cDNA以右向(有义方向)或反向(反义方向)连接到载体的BamHI位点。通过混合载体和细菌，将获得的载体引进土壤细菌(根癌农杆菌菌株GV3101(pMP90))中。通过卡那霉素(Km)抗性筛选含有靶基因的根癌农杆菌，采用真空渗入方法感染野生型拟南芥属植物(Bechtold，N.等，C.R.Acad.Sci.Paris，LifeSci.，3161194-1199，1993)。从感染的植物中获得干种籽，播种在加了Km的琼脂平板中进行生长以便选择转化体第一代(T1)的个体。将从转化体第一代得到的转化体第二代(T2)的种籽播种在加了Km的琼脂平板上，种植后从显示Km抗性的植物中收集第三代(T3)的种籽。此外，将第三代的种籽以类似的方式播种在加了Km的平板中，表现出抗药性的所有种籽作为T3同源株系被用于下面实验。最后，AtNCED3基因的每一有义和反义转化体分离出两个株系。
实施例14转化体中AtNCED3基因表达的评价通过Northern杂交方法评价AtNCED3基因在野生型拟南芥属和AtCED3-基因转化的植物中的表达。
培育了一个月的植物用于分析转化体中AtNCED3基因的表达。拔出植物，并在滤纸上风干(相对湿度为50％)作为干旱逆境处理。在液氮中裂解经上述环境逆境处理的植物以便提取全长RNA(Nagy F，Kay SA和Chua N.-H.(1998)转基因植物中基因表达的分析。在Gelvin和Schilperoort编，植物分子生物学手册B4.Kluwer Academic Publishers，Dordrechrt，1-29页)。RNA在1％琼脂糖凝胶中进行电泳(每一泳道20μg)，从电泳凝胶中转移到尼龙膜上，使用[32P]-标记的RNA探针进行Northern杂交(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis T.(1989)“分子克隆实验室手册”第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)。
结果，在受到干旱逆境作用前，AtNCED3基因在野生型植物中不表达，但却在有义植物中表达了。另一方面，干旱处理后，AtNCED3基因在野生型植物中受干旱诱导进行表达，但是在反义植物中即使受到干旱逆境处理也不表达(图13)。
实施例15转化体中内源ABA含量的评价测定野生型拟南芥属和AtNCED3-基因转化的植物中的内源ABA含量。
培育了一个月的植物被用于评价野生型拟南芥属和转化体中的内源ABA含量。将样品在液氮中进行均质并用液体甲醇(20-80％)提取两次。加入[2H3]ABA，浓缩提取物，并进行标准溶剂分馏过程来得到酸性-乙酸乙酯可溶级分。按照Wijayanti，L.，等，Biosci.Biotech.Biochem.，591533-1535，1995中描述的方法，采用结合洗脱柱体(C18和DEA，Varian)纯化这些级分。然后采用Senshu PakODS-2101-N柱(100mm长，6mm的内径)(SenshuScientific Co.)对从没有干燥的植物中纯化的样品进行HPLC分析。分析条件与Wijayanti，L.等，Biosci.Biotech.Biochem.，591533-1535，1995中描述的相同。采用醚性重氮甲烷将纯化样品甲基化并进行GC-SIM分析。
结果，与其野生型相比，在有义植物中ABA含量增加了，在反义植物中ABA含量降低了(图14)。
实施例16干旱耐受性的评价结果将获得的转化体植物的种籽播种在加了营养盐的琼脂平板上(Valvekens，D.等，美国国家科学院院报，855536-5540，1988)，在上述种植条件下生长两周以便进行下面的实验。
将4株上述植物转种到填满土的9cm-直径的塑料盆(蛭石∶珍珠岩＝1∶1)中，在22℃和光周期为16小时的条件下生长。播种三周后(转种后两周)，通过中止浇水，使盆脱水以便自然产生干旱逆境。开始停止浇灌后14天和17天，对植物进行拍照。其中以反义方向引进AtNCED3基因的植物在开始停止浇灌后14天枯萎(图15)。相反，以有义方向引进基因的转化体植物没有枯萎。野生株系也在开始停止浇灌后17天枯萎，然而以有义方向引进基因的转化体植物对干旱表现出很高的耐受性(图16)。
序列表<110>RIKEN<120>携带新黄素裂解酶基因的转基因植物<130>R3-102DP1<140><141><150>JP 2000-010056<151>2000-01-13<160>32<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1752<212>DNA<213>拟南芥<220><221>CDS<222>(1)..(1752)<400>1atg gtt tct ctt ctt aca atg ccg atg agt ggt ggt att aaa aca tgg 48Met Val Ser Leu Leu Thr Met Pro Met Ser Gly Gly Ile Lys Thr Trp1 5 10 15cct caa gcc caa att gat ttg ggt ttt agg ccc att aaa aga caa ccg 96Pro Gln Ala Gln Ile Asp Leu Gly Phe Arg Pro Ile Lys Arg Gln Pro20 25 30aag gtt att aaa tgc acg gtg cag atc gac gta acg gaa tta acc aaa 144Lys Val Ile Lys Cys Thr Val Gln Ile Asp Val Thr Glu Leu Thr Lys35 40 45aaa cgc caa tta ttt aca ccc aga acc acc gct act ccg ccg cag cat 192Lys Arg Gln Leu Phe Thr Pro Arg Thr Thr Ala Thr Pro Pro Gln His50 55 60aat cct ctc cgg cta aac atc ttc cag aaa gcg gcg gcg att gcg atc 240Asn Pro Leu Arg Leu Asn Ile Phe Gln Lys Ala Ala Ala Ile Ala Ile65 70 75 80gac gcg gct gag cgt gca tta atc tca cac gag caa gat tct cca ctt 288Asp Ala Ala Glu Arg Ala Leu Ile Ser His Glu Gln Asp Ser 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tcacgac1权利要求
1.一种编码具有用于改进植物逆境耐性的新黄素裂解活性的蛋白的DNA。
2.一种用于降低植物逆境耐性的DNA，其中该DNA选自下列一组DNA(a)一种编码反义RNA的DNA，该反义RNA与具有新黄素裂解活性的蛋白的编码基因转录物互补；(b)一种编码具有核酶活性的RNA的DNA，该核酶活性能裂解具有新黄素裂解活性的蛋白的编码基因转录物；和(c)一种编码RNA的DNA，其中该RNA通过共抑制效应抑制具有新黄素裂解活性的蛋白的编码基因在植物细胞中的表达。
3.如权利要求1或2所述的DNA，其中具有新黄素裂解活性的蛋白选自下列一组蛋白(a)含有SEQ ID NO2，6，10，12，14或16所示氨基酸序列的蛋白；(b)含有SEQ ID NO2，6，10，12，14或16所示氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白；和(c)由与含有SEQ ID NO1，5，9，11，13或15所示核苷酸序列的DNA在严格条件下杂交的DNA编码的蛋白。
4.如权利要求1至3中的任意一项权利要求所述的DNA，其中具有新黄素裂解活性的蛋白源于拟南芥属植物。
5.一种携带有如权利要求1至4中的任意一项权利要求所述的DNA的转化体植物细胞。
6.含有权利要求5所述的转化体植物细胞的转基因植物。
7.一种是权利要求6所述的转化体植物的子代或克隆的转基因植物。
8.如权利要求6或7所述的转基因植物，其中与其野生型相比，具有新黄素裂解活性的蛋白的编码基因表达被提高或降低。
9.如权利要求6至8中的任意一项权利要求所述的转基因植物，其中与其野生型相比，脱落酸的含量增加或减少。
10.如权利要求6至9中的任意一项权利要求所述的转基因植物，其中与其野生型相比，逆境耐性增强或降低。
11.一种如权利要求6至10中的任意一项权利要求所述的转基因植物的繁殖材料。
12.一种含有权利要求1至4中的任意一项权利要求所述的DNA的载体。
13.一种生产如权利要求6至10中的任意一项权利要求所述的转基因植物的方法，包括将权利要求1至4中的任意一项权利要求所述的DNA引进植物细胞并由该植物细胞再生植物的步骤。
14.一种用于增强或降低植物逆境耐性的方法，包括在植物细胞中表达权利要求1至4中的任意一项权利要求所述的DNA。
15.权利要求1所述的DNA用于改进植物逆境耐性的用途。
16.权利要求2所述的DNA用于降低植物逆境耐性的用途。
全文摘要
本发明提供了一种编码用于改进植物逆境耐性的新黄素裂解酶的DNA,一种通过将所述DNA引进植物来增强植物逆境耐性的方法,和一种其中引进了新黄素裂解酶基因的转基因植物。本发明还提供了一种用于降低植物逆境耐性的DNA,一种通过将所述DNA引进植物来降低植物逆境耐性的方法,和一种其中引进了所述DNA的转基因植物。本发明能够产生一种其中逆境耐性增强或降低的植物。
文档编号C12N5/10GK1307137SQ01111628
公开日2001年8月8日 申请日期2001年1月13日 优先权日2000年1月13日
发明者井内圣, 小林正智, 篠崎一雄 申请人:理化学研究所