猪肺炎支原体温度敏感型活疫苗的制作方法

专利名称：猪肺炎支原体温度敏感型活疫苗的制作方法
背景技术：
猪呼吸道疾病综合征(PRDC)是导致猪产量降低的越来越重要的一种原因，猪产量降低的特征在于猪生长迟缓、饲养效率降低、厌食、发热、咳嗽和呼吸困难。猪肺炎支原体，又称为猪肺炎霉形体，是导致猪支原体肺炎(又称为猪地方流行性肺炎、病毒性肺炎、感染性肺炎、以及前叶性肺炎)的致病病原体。猪肺炎支原体是一种小的原核微生物，比细菌小，结构比细菌简单，但比病毒复杂。与病毒不同，它们能够独立存活，尽管发现它们时通常都与真核细胞相伴随，因为它们绝对需要外源性固醇和脂肪酸，而这些物质通常在含血清的培养基中是必需生长物质。猪肺炎支原体具有细胞膜，而没有细胞壁。它们的基因组非常小，长度大约为750,000碱基对。猪是目前所知该支原体的唯一宿主。
在世界范围内的养猪国家中，支原体肺炎是一种最常见的猪呼吸道疾病。来自PigMon的监测资料显示，发生肺炎的中西部猪群占97％，其中取样动物中的流行率＞70％(Dybvig 1992)。PigMon是一项旨在评价美国上中西部牧场损失的监测项目。支原体肺炎的致死率较低，但病废率很高(30-80％)。这种疾病通常可以导致显著的经济损失，因为它可导致动物生长率减缓，效率降低以及患病。
通过感染猪喷射出的空气传播微生物，该病可以通过鼻腔在猪间传播。支原体可以深入肺脏的肺尖和心叶，在那里导致肉眼可见的暗紫色或灰色病损，进而导致动物呼吸困难，体重增加减缓。猪肺炎支原体原发感染后，还可以继发其他种类的支原体(如猪鼻支原体和絮状支原体)以及细菌病原体(如巴氏杆菌和博德特菌)感染。猪肺炎支原体导致的呼吸道疾病可以使动物在喂养增肥期间体重增加变缓。因此，感染了这种微生物的动物在屠宰时，其经济价值远远低于那些未感染动物。
尽管很多牧场业已采取了多地点饲养、改善卫生条件的措施，但肺炎的流行率并未显著降低，只是其流行病学特征发生了改变。由于猪肺炎可以导致严重的经济损失，科学家们一直在寻求针对猪肺炎支原体的疫苗和治疗方法。在猪中预防支原体一直是通过联合应用抗生素治疗和疫苗接种来达成。该方法的缺点是花费巨大，效果不可预计，采取这些措施后，很多牧场并未显示出明显改善。针对猪肺炎支原体进行疫苗接种是最近引入的一种方法，只在最近6-7年才可以在市面上购买到这些疫苗。
尽管针对猪的支原体疫苗取得了巨大的经济成功，它们在野生条件下的功效却仍然争议频多。通常情况下，这些疫苗可以在屠宰时降低这些患肺炎肺脏的平均病损评分，但却不能影响受累猪的流行率。也就是说，受累猪的数量并未发生改变，只是最终的损伤程度似乎变小了。支原体疫苗接种对症状的影响就更值得怀疑了，因为即使有这样的论文，也没有几篇论文显示，(疫苗接种)在增重或转化方面具有肯定的改善效果。
这些疫苗表现不尽如人意的原因可能与它们是灭活疫苗、以及猪中支原体感染的特性等事实有关。猪肺炎支原体是纤毛上皮细胞的非侵袭性定殖体。由于该微生物不侵袭呼吸系统，由灭活疫苗激发的循环抗体必须通过上皮屏障，分泌到气管支气管管腔，而该过程异常困难，而且效率低下。为了能够达到这种粘膜分泌，支原体疫苗必须能够刺激高水平的系统抗体。当然，这需要相对较高的抗原剂量和较强的佐剂，这样，就使这些疫苗变得价格昂贵，而且难以应用。
应用目前这些疫苗的另一个问题是需要通过两剂注射方法。这种两剂注射方法需要对猪进行严格控制，这需要对时间进行精密控制，而且会导致动物应激。由于牧场规模不断壮大，这种两剂注射疫苗接种法变得越来越不受欢迎，而需要一种替代接种方法，这种方法不需要这些严格控制。
因此，对猪肺炎支原体的安全有效疫苗存在一种持续的需求，这种疫苗必须易于应用。
发明概述本发明提供了一种分离纯化的猪肺炎支原体温度敏感型菌苗。该菌苗可以是ATCC保藏号＿＿＿＿＿。
本发明还提供了一种疫苗制剂，该疫苗制剂含有猪肺炎支原体温度敏感型活菌苗，以及生理可接受的无毒载体。该菌苗可以是ATCC保藏号＿＿＿＿＿。该疫苗制剂还可进一步含有免疫佐剂。同样，疫苗制剂还可含有至少一种其他感染致病因子。所述感染致病因子可以是病毒、细菌、真菌或寄生虫。特别是，感染致病因子可以是支气管炎博德特氏菌(Borderella bronchiseptica)，A型或D型多杀巴氏杆菌或副猪型嗜血杆菌。
本发明还提供了一种诱导免疫应答和/或保护易感猪免受猪肺炎支原体定殖或感染的方法，该方法是给猪应用有效剂量的疫苗制剂，所述疫苗制剂含有猪肺炎支原体温度敏感型活菌苗和生理可接受的无毒载体。所述疫苗制剂还可进一步含有免疫佐剂。该疫苗可以通过皮下或肌内注射、口服或鼻腔内进行给药。该疫苗制剂可以单剂应用，也可多剂应用。
发明详述本文所用术语“疫苗”的定义是其广义含义，指用来产生活性免疫的生物物质。通常，疫苗采用四类抗原中的一类通过非自然途经给予的活体微生物，减毒活体微生物，灭活微生物，以及微生物的部分、甚至单一抗原或者产物。在所有这些情况下，目的是提呈抗原，而不带来疾病。业已采用了多种不同的灭活物质和方法，包括福尔马林，叠氮化物，冻融，超声波降解，热处理，突然减压，去污剂(特别是非离子去污剂)，溶菌酶，苯酚，蛋白水解酶和丙内酯。疫苗的实例包括那些在美国专利号4,894,332，5,788,962，5,338,543和EP571,648中描述的疫苗。
对组合物或疫苗产生的免疫应答是在宿主体内发生的针对感兴趣多肽或疫苗产生的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常情况下，这样的应答包括产生抗体的物质，B细胞，辅助T细胞，抑制T细胞，和/或特异性针对感兴趣组合物或疫苗中所含抗原的细胞毒性T细胞。本发明疫苗还可包括有效剂量的免疫佐剂，所述免疫佐剂已知可以增强免疫应答。
而且，疫苗的目标是对自然感染提供保护。可以检测到的免疫应答，如产生可以检测到的抗体，可能未必能够起到保护作用。因此，尽管以前的疫苗试图保护猪免于猪肺炎支原体的感染，但尚未达到可以接受的保护水平。
对目前现存的用于猪的支原体疫苗的替代品是应用活疫苗。这种活疫苗应该具有很多优势。例如，可以应用气雾剂将疫苗直接送达粘膜部位，实现局部免疫；只需单剂疫苗；制造起来更加便宜。本发明发明者制备的温度敏感型突变株在正常猪体温的情况下不能生长，但在体外更低的温度下可以生长。
简而言之，通过将猪肺炎支原体暴露于N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍，使其突变。将突变的猪肺炎支原体生长于Friis培养基中，应用亚硝基胍处理，然后在Friis琼脂糖平板上生长10-14天。将含有分离良好集落的每个平板复制到硝化纤维素滤器上，应用表面荧光检测胞浆LDH的存在。选择不表达LDH的集落，用于动物研究。暴露于亚硝基胍的微生物生长于34℃。将集落印迹在硝化纤维素上，然后转移到琼脂平板，39℃孵育。选择能够在34℃生长但在39℃不生长的集落，保藏于ATCC(ATCC保藏号＿＿＿＿＿＿＿＿＿)。
为了制备针对猪肺炎支原体感染的保护性疫苗，本发明采用了温度敏感型活细菌。很多微生物在传代培养生长多代后，就会丧失它们的感染性，并发生抗原变异。实际上，脊髓灰质炎标准疫苗本质上就是活的脊髓灰质炎病毒，但该病毒在传代培养多代后发生变异，不能在神经或脑组织生长，因此丧失了大部分致病性。对于这种病毒，关键抗原并未发生改变。
适宜的猪肺炎支原体菌株可以自多种来源获得。菌株可以从储备处如ATCC和NRRL获得。由于该疾病的广泛传播，大多数菌株可以通过从患病动物的肺脏分泌物或组织中分离猪肺炎支原体并在适宜培养基中孵育获得。
本发明的温度敏感型活体猪肺炎支原体，又称为猪肺炎支原体“菌苗”，可以直接作为疫苗应用。有效剂量取决于种类、品种、年龄、大小、健康状况以及动物以前是否接种过针对同一微生物的疫苗。疫苗中的其他组分以及给药途经也会影响有效剂量。每个批号的疫苗都应该单独进行校准。通过不同剂量的系统试验，本领域普通技术人员可以容易地确定有效剂量。
本文所述术语“保护”当用来描述针对猪肺炎支原体导致的支原体肺炎疫苗时是指该疫苗可以预防猪肺炎支原体导致的支原体肺炎的发生，防止猪肺炎支原体的定殖，或者减轻或降低猪罹患疾病的严重程度。
根据疫苗浓度、给药途经和动物状况，可以容易地确定所用疫苗的剂量。本领域技术人员可以容易地确定有效剂量。关键因素是该剂量可以针对自然感染提供至少部分保护效应。因此，疫苗的有效剂量是足以保护猪免于罹患支原体肺炎的疫苗数量。该剂量可以在宿主动物中刺激免疫应答。
在本发明的一个优选实施方案中，确定的疫苗有效剂量大约为106-109集落形成单位(CFU)/ml，优选大约为106-107CFU/ml。活性成分的代表性范围大约为组合物的1％-95％(w/w)，如果可能，甚至可以更高或更低。应用的量取决于以下因素，如考虑接种动物的年龄、体重和身体状况。应用量还取决于动物免疫系统产生抗体的能力，以及所需保护的程度。通过常规试验建立剂量反应曲线，本领域一般技术人员可以容易地建立优选剂量。可以通过应用单剂或多剂疫苗，使受体获得免疫。在需要维持对微生物的免疫状态时，可以给予多剂疫苗。
疫苗制剂可以包括一种或多种佐剂来增强免疫应答，使其足以基本上预防自然感染。佐剂是指任何与注射的免疫原混合后，可以增强免疫应答的物质。适宜的佐剂包括但不限于表面活性剂，如十六烷胺，十八烷胺，溶血卵磷脂，溴化二甲基双十八烷基铵，N，N-双十八烷基-N’-双(2-羟乙基丙烷二胺)，甲氧基十六烷基-甘油，pluronicpolyols；polanions，如吡喃，硫酸右旋糖苷，poly IC，聚丙烯酸，carbopol；肽，如胞壁酰二肽，MPL，aimethylglycine，吞噬肽，油乳剂，明矾及其混合物。其他潜在佐剂包括大肠杆菌热不稳定毒素或霍乱毒素的B肽亚单位。(McGhee 1993)。
一种广泛应用的程序包括给予无机凝胶，如明矾，氢氧化铝或磷酸铝。一些最有效的佐剂是油包水乳剂，特别是那些其中悬浮了存活或灭活分支杆菌的佐剂，如完全性Freund’s佐剂。但是，没有分支杆菌的乳剂(不完全性Freund’s佐剂)刺激作用更小，常被应用。为了增强一种疫苗的免疫原性，可以应用含有氢氧化铝和/或DEAE右旋糖苷(二乙氨乙醚右旋糖苷)的佐剂。氢氧化铝的浓度范围可以很宽，依赖于给药途经，范围可以高达大约1.5％。浓度范围0.1-1.0％更具代表性。同样，DEAE右旋糖苷的浓度范围也很宽，例如可以应用高达大约6％的浓度。疫苗中氢氧化铝和DEAE右旋糖苷的浓度可以是，氢氧化铝大约为0.24-0.39％，DEAE右旋糖苷大约为1.5％。
可以买到的DEAE右旋糖苷具有多种分子量。尽管实施例中应用的DEAE右旋糖苷的分子量是500,000道尔顿，但作为佐剂，也可以应用不同分子量的右旋糖苷。硫酸右旋糖苷也可用作佐剂，但结果不尽如人意。
氢氧化铝和DEAE右旋糖苷的最佳浓度可以由那些应用本发明的人容易地确定，方法是在一种佐剂浓度固定的情况下改变另一种佐剂的浓度，然后确定哪个浓度最具保护效应。
菌苗，无论是否含有佐剂，都可以与可接受的载体混合进行免疫接种。众所周知的示例包括无菌水，盐水或缓冲液。还可应用能够增强在溶液中悬浮度和分散的其他物质。用于携带疫苗的多种传统载体是已知的，并在上述参考文献中有提及。根据给药途经和受体动物状况选择适宜载体，是本领域技术人员力所能及的。
免疫接种可以通过本领域技术人员众所周知的任何方法进行，如口服，鼻腔内给药，气雾剂和注射给药(IM，SC，IV，ID或其他方法)。给药途经的选择取决于将进行免疫接种的动物，免疫接种史，以及(给动物进行)疫苗接种人员的方便。优选的给药途经是鼻腔内给药。例如，疫苗可以通过气雾剂进行给药(Murphy 1993)。优选该给药途经是因为预防该病、针对猪肺炎支原体的天然保护性免疫是局部(肺部)免疫和细胞介导的免疫，而非循环抗体。将抗原(疫苗)提呈给呼吸道免疫系统可以刺激局部免疫应答。因此，局部应用疫苗可能更加有效。而且，在封闭的畜棚或空间使用气雾剂疫苗并使猪吸入，可以减少在加强生产系统中给大量动物进行免疫接种所需的人员。气雾剂免疫接种，又称为喷雾免疫接种，目前还作为商业基础用于家禽的免疫接种，可以有效预防某些疾病。
可以固定时间间隔进行重复免疫接种来增强首次免疫应答，或在最后一剂接种较长时间段后进行重复免疫。两次免疫接种之间的时间间隔根据动物的年龄和状况不同而有所差异。对于首次免疫接种，时间通常超过1周，优选大约2-3周。对于以前免疫接种过的动物，在怀孕前或怀孕期间，大约每年接种一次。
猪肺炎支原体疫苗可以单独应用，也可为了方便或加强效果，与其他疫苗联合应用。联合疫苗优选可以对多种感染提供保护。特别令人感兴趣的是猪肺炎支原体与支气管炎博德特氏菌、A型或D型多杀巴氏杆菌联合，因为这三种病原体均可导致猪患重病。此外，这种联合还不应彼此影响它们刺激保护性免疫应答产生的能力。这些其他种类的疫苗可以通过完全不同的方法进行灭活。与猪肺炎支原体疫苗联合的其他疫苗还应该与用于猪肺炎支原体疫苗中的同种佐剂相兼容。
肺脏评分或肺脏病损评分是指肺脏组织中可以检测到的病损程度。评分系统的实施如Goodwin and Whittlestone(1973)Br.Vet.J.129456-462所述。
鼻腔内制剂应包括载体，所述载体既不会导致鼻腔粘膜刺激，也不会显著干扰纤毛功能。本发明还可采用稀释剂，如水，盐水或其他已知物质。鼻腔制剂还可含有某些防腐剂，例如但不限于氯丁醇和杀藻胺。还可含有表面活性剂，增强鼻腔粘膜对蛋白质的吸收。
口服液体制剂可以采用以下形式，如水溶液或油悬液，溶液，乳剂，糖浆或酏剂，或者也可以以片剂的形式存在，或者以一种在使用前需要用水或其他适宜载体进行重建的产品的形式存在。这些液体制剂可以含有传统的添加剂，如悬浮剂，乳化剂，非水载体(可包括食用油)或防腐剂。
为了制备疫苗，需要分离活的温度敏感型猪肺炎支原体。然后将猪肺炎支原体的量调整到一个适宜的浓度，最好与适宜的疫苗佐剂结合，并包装备用。
下述实施例旨在描述而非限制本发明。
实施例实施例1制备猪肺炎支原体的温度敏感型突变株猪肺炎支原体在暴露于N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍后，发生突变。该方法业已成功用于几种支原体(Lam 1984，Lai 1990)。猪肺炎支原体生长于Friis培养基中，应用100mg/ml亚硝基胍处理，然后在Friis琼脂糖平板上生长10-14天。暴露于亚硝基胍的微生物生长于34℃。然后将集落印迹到硝化纤维素上，再转移到琼脂平板上，39℃孵育。选择能够在34℃生长但在39℃不能生长的集落备用。然后将选择的突变株克隆三次，储存于-80℃备用。分离株保藏于ATCC(ATCC保藏号＿＿＿＿)。
实施例2制备疫苗为了制备疫苗，在34℃Friis培养基中培养选择的一株突变株(ATCC保藏号＿＿＿＿＿)，直至培养基混浊，并出现酸性颜色改变。通过10倍稀释法在Friis肉汤中进行集落形成单位(cfu)的测定，每个稀释浓度采用5个复制样本。应用的疫苗是新鲜肉汤培养物，没有添加佐剂。
实施例3猪免疫接种的试验性研究为了预先评价疫苗的安全性和有效性，进行了一项小型试验性研究。为了进行这项研究，从没有支原体感染的牧场引进了16只5日龄小猪，并在明尼苏达大学兽医学院的隔离饲养单位进行喂养。
试验草案将动物随机分为两组，每组8只猪，接受下述处理组别 动物数量疫苗接种 病原体激发 尸检14鼻腔内(2剂)接种后12天 7周14肌内(1剂) 相同 7周24安慰剂(2剂)相同 相同24肌内 未进行 第1，2，3，7天这种设计可以检测疫苗的粘膜提呈(鼻腔内)和非肠道提呈(肌内)。组2包括未进行免疫接种但进行病原体激发的对照动物，以及进行免疫接种但未给予病原体激发的动物，后者可以用来评价产品的安全性。
监测的指标每周监测猪的体温以及提示支原体感染的呼吸道体征。每周还应用PCR技术(Calsamiglia 1999)对猪进行鼻腔猪肺炎支原体存在性检测。尸检时，所有动物都进行显微镜检查，并评价镜下肺脏损害。通过PCR以及气管支气管拭子细菌培养，评定猪肺炎支原体的存在。此时，还需应用标准ELISA技术评价动物体内支原体抗体的存在。
结果突变株的制备和筛选成功制备了能够在34℃生长但不能在39℃生长的温度敏感型突变株。筛选、克隆并冻存了两种突变集落。然后将其中一种突变集落(MNtemp-1)传代培养3代，检测其稳定性。该处理过程后，该突变株没有回复突变，在39℃仍然不能生长。通过PCR鉴定该突变株为猪肺炎支原体。
试验性研究疫苗安全性无论给药途经，所有免疫接种的猪均维持正常体温38.5-39.5℃。而且，这些动物在观察期内没有出现呼吸道疾患的临床症状。接受免疫接种但没有经过病原体激发的猪，观察时(接种后1、2、3和7天)在注射部位没有发现明显的大体或镜下损害。
疫苗效力疫苗接种剂量为108cfu/ml。
疫苗有效性没有一只肌内免疫接种的小猪在屠宰时出现肺炎的大体损害。这些动物中有一只(1/4)存在小的镜下损害，伴随轻度支气管周围单核细胞浸润。从该动物气管支气管灌洗液和拭子中培养出猪肺炎支原体。同样，有一只鼻腔内免疫接种的猪显示出小的肺炎大体损害(3％肺脏受累)，伴随支气管周围单核细胞浸润，以及一些心包积液。该动物在尸检时也培养出猪肺炎支原体，而且荧光抗体试验阳性。其他接受免疫接种并经病原体激发的猪(6/8)没有显示大体或镜下损害，气管支气管样本中也没有产生猪肺炎支原体阳性结果。
相反，3只未进行免疫接种但经病原体激发的动物(3/4)存在肺炎的大体损害(9，9和20％的肺脏受累)，并且所有动物均具有肺炎的镜下损害。所有动物荧光阳性，气管支气管培养产生猪肺炎支原体。这些猪在病原体激发4天后体温＞39.5℃。此外，2/4动物出现咳嗽和呼吸困难的临床症状。无论处理方法如何，应用Tween-ELISA技术进行评定，没有一只猪存在支原体血清转化。
讨论在暴露于亚硝基胍后，通过随机变异成功产生了温度敏感型突变株(MNtemp-1)。克隆后证明，在传代至少3代后，MNtemp-1菌株仍然稳定，没有回复突变为野生型。通过标准PCR鉴定确证了菌株的纯度。
在试验性研究中，应用MNtemp-1制备的活疫苗证明，在应用致命性猪肺炎支原体激发后，可以为6/8猪提供成功的完全性保护。每组中都有1只动物存在小的镜下损害，并在尸检时培养出猪肺炎支原体。这些动物中还有1只具有小的(3％)大体损害。相反，未进行免疫接种的猪存在较大病损评分，其中75％具有大体损害，100％具有镜下损害，荧光抗体试验全部阳性。而且，所有这些对照动物均从气管支气管灌洗液中培养产生了支原体。
这些结果显示，成功制备了稳定的猪肺炎支原体温度敏感型突变株。它们也提示，该突变株可以成功用作疫苗，避免该物质导致的猪肺炎。
实施例4免疫接种的扩大研究进行了一项扩大性免疫接种研究，确证试验性研究发现的结果。为了进行这项研究，从没有支原体感染的牧场引进了41只小猪，并在隔离饲养单位进行喂养。大体遵循上述实施例3中叙述的草案。动物被随机分为4组，接受下列处理减毒疫苗拮抗猪肺炎支原体的评价房间A3未进行免疫接种和病原体激发猪ID起始体重终末体重肺脏评分201 3 71 8202 4 52 5203 5 71 12204 4 50 10205 5 64 7206 4 63 8207 5 63 5208 3 51 5209 5 71 0210 3 56 9
房间A5鼻腔内免疫接种，并给予病原体激发猪ID起始体重终末体重肺脏评分4164 50 44176 68 94185 49 74195 39 04206 66 04215 50 04226 56 84237 67 04245 56 04255 64 0房间A7鼻腔内免疫接种，但未给予病原体激发猪ID起始体重 终末体重 肺脏评分401570 0402565 0403670 0404469 04054免疫接种后2周无痛 0处死4064免疫接种后2周无痛 0处死4074免疫接种后2周无痛 0处死408566 0房间A9IM免疫接种，并给予病原体激发猪ID起始体重 终末体重 肺脏评分211451 0212459 0213473 8214576 02153免疫接种后2周无痛 0处死216583 02174肛门闭锁，NA218563 2219582 02204免疫接种后2周无痛 0处死221454 0222455 4223565 0
这些结果进一步证明了减毒疫苗拮抗猪肺炎支原体的安全性和有效性。它们还显示，该突变株可以作为疫苗，成功用于避免该物质导致的猪肺炎。
所有的出版物和专利在此引入，作为参考，其程度与每篇出版物或专利申请在此具体明确地引入作为参考相同。很清楚，本领域一般技术人员可以在不背离随后所附权利要求范畴的情况下，对本发明进行多种变化和调整。
参考文献Calsamiglia，M.，Pijoan，C.and Trigo A.(1999)Application of a nested polymerasechain reaction assay to detect Mycoplasma hyopneumoniae from nasal swabs.J.Vet.Diag.Invest.11246-251Dybvig，K.，A.Woodard，Construction of recA mutants of Acholeplasma laidlawii byinsertional inactivation with a homologous DNA fragment，Plasmid，28，262-266(1992)Dybvig，K.，G.H.Cassell，Transposition of gram-positive bacterial transposon Tn916in Acholeplasma laidlawii and Mycoplasma hyorhinistransposition of Tn916 and formationof cointegrate structures，Plasmid，20，3341(1988)Friis，NF，Mycoplasms of the swineA Review，Norkisk Veterinaermedicin，27，329-36(1975)Friis，NF，Some recommendations concerning primary isolation of Mycoplasmasuipneumoniae and Mycoplasma flocculareA Survey，Norkisk Veterinaermedicin， 27，337-9(1975)Hedreyda，C.T.，K.K.Lee，D.C.Krause，Transformation of Mycoplasmapneumoniae with Tn4001 by electroporation，Plasmid，30，170-175(1993)Lai，W.C.，M.Benuet，Y.S.Lu，S.P.Pakes，Biological evaluation of Mycoplasmispulmonis temperature sensitive mutants for use as possible rodent vaccines，Infection andImmunitv，58(7)，2289-2269(1990)Lam，K.M.，J.Rosen，Temperature sensitive mutants of Mycoplasma gallisepticum，J.Comp.Pathol.，94(1)，1-8(1984)McGhee，J.R.，et al.，On vaccine development，Sem.Hemato，303-15(1993)Meynell，G.G.and E.Meynell，Theory and practice of experimental bacteriology，Cambridge University Press(1965)
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权利要求
1.一种分离纯化的温度敏感型猪肺炎支原体菌苗。
2.权利要求1的菌苗，其ATCC保藏号为＿＿＿＿＿。
3.一种疫苗制剂，含有活的温度敏感型猪肺炎支原体菌苗，以及生理可接受的无毒载体。
4.权利要求3的疫苗制剂，其中菌苗的ATCC保藏号为＿＿＿＿。
5.权利要求5的疫苗制剂，其中疫苗还可进一步含有一种免疫佐剂。
6.权利要求5的疫苗制剂，还进一步含有至少一种其他感染致病因子，其中所述感染致病因子为病毒，细菌，真菌或寄生虫。
7.权利要求6的疫苗制剂，其中感染致病因子为支气管炎博德特氏菌，A型或D型多杀巴氏杆菌或副猪型嗜血杆菌。
8.保护易感猪避免猪肺炎支原体定殖或感染的方法，包括给猪应用有效剂量的疫苗制剂，所述疫苗制剂含有活的温度敏感型猪肺炎支原体菌苗，以及生理可接受的无毒载体。
9.权利要求8的方法，其中疫苗制剂还可进一步含有一种免疫佐剂。
10.权利要求8的方法，其中疫苗制剂可以通过皮下或肌内注射、口服或鼻腔内应用进行给药。
11.权利要求8的方法，其中疫苗制剂通过鼻腔内给药。
12.权利要求8的方法，其中疫苗制剂可以单剂给药，也可以多剂给药。
13.在易感猪中诱导针对猪肺炎支原体导致的支原体肺炎的免疫应答的方法，包括给猪应用有效剂量的疫苗制剂，所述疫苗制剂含有活的温度敏感型猪肺炎支原体菌苗，以及生理可接受的无毒载体。
14.权利要求13的方法，其中疫苗制剂还可进一步含有一种免疫佐剂。
15.权利要求13的方法，其中疫苗制剂可以通过皮下或肌内注射、口服或鼻腔内应用进行给药。
16.权利要求13的方法，其中疫苗制剂通过鼻腔内给药。
17.权利要求13的方法，其中疫苗制剂可以单剂给药，也可以多剂给药。
全文摘要
本发明提供了一种针对猪肺炎支原体的温度敏感型活疫苗。本发明还提供了给猪进行免疫接种预防猪肺炎支原体定殖或感染的方法。
文档编号C12N1/20GK1461338SQ01815971
公开日2003年12月10日 申请日期2001年7月27日 优先权日2000年7月27日
发明者C·皮乔安 申请人:明尼苏达大学评议会