专利名称：抗醛糖还原酶相似蛋白多克隆抗体的制备方法
技术领域：
本发明是一种多克隆抗体的制备方法，属于生物工程开发新型肝癌诊断、治疗试剂的技术领域。
背景技术：
原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤，死亡率高，仅次于胃癌、食管癌而居第三位，五年生存率为36.6％。
肝癌有一相对长的自然发展过程，其自然病程至少为24个月出现低浓度AFP到亚临床肝癌诊断确立为早期阶段，一般为10个月；从亚临床期到出现临床症状为中期阶段，一般为8个月时间；自有临床症状到出现黄疸、腹水、远处转移或恶液质称作晚期阶段，时间大约4个月；自晚期到死亡，一般为个2月时间。
要想提高肝癌的五年生存率早期诊断非常重要，其中肝癌的血清标志物是非常有用的。近几年出现的一些肝癌标志物包括AFP、γ-GT同工酶、甲胎蛋白异质体、异常凝血酶原、血清岩藻糖苷酶、同工铁蛋白、醛缩酶同工酶、α1-抗胰蛋白酶分子异质体、丙酮酸激酶同工酶。这些肝癌标志物对肝癌的早期诊断有重要意义，但其中最有价值的是AFP。AFP是当前诊断HCC最特异的标志物，其阳性率仅70-80％。它是胎儿时期肝脏合成的一种胚胎蛋白，当成人肝细胞恶变后又可重新获得这一功能。但是，在孕妇、新生儿及生殖腺(睾丸、卵巢)胚胎瘤AFP也可出现，这说明AFP对HCC只有相对的特异性；采用高灵敏度的检测方法在部分肝炎、肝硬化及少数消化道肿瘤(胃癌、结肠癌、胰腺癌)可测得低浓度的AFP，因此对AFP的检测结果必须联系临床才有诊断意义；近年来发现AFP阴性的HCC有上升趋势，所以开发更新、更特异、更敏感的肝癌标志物成为当前紧迫的课题。
醛糖还原酶相似蛋白ARL-1(Aldose Reductase-like-1)cDNA序列，全长1.35kb，编码316个氨基酸，分子量为34.8KD。
ARL-1为醛酮还原酶大家族的成员，该家族还包括醛糖还原酶(AldoseReductase，AR)、醛还原酶(Aldehyde Reductase，ADR)、碳酰还原酶(CarbonylReductase)、成纤维生长因子调节蛋白(FR-1)、小鼠输精管蛋白(MVDP)、变易蛋白(斑块17，spot17)。就氨基酸序列而言，ARL-1分别与AR、MVDP、FR-1、中国仓鼠卵巢还原酶、spot17有70.6％、81％、82％、83％、94％的同源性。ARL-1以NADPH为辅酶，能还原各种醛类和糖类化合物。
Northern blotting显示，生理情况下ARL-1主要分布在小肠、结肠，可能与食物中醛类物质的解毒有关。ARL-1在62.5％的原发性肝癌组织中呈高水平表达，而在肝癌旁的正常组织中则检测不到该基因的表达，据推测ARL-1可能使无毒的醛类物质变为有毒致癌的物质从而有利于肝癌的发生；使含醛基的抗癌药还原为无毒性物质从而失去抗癌作用，导致肝癌产生耐药性、治疗效果不好。ARL-1在62.5％的原发性肝癌组织中呈高水平表达而在肝癌旁的正常组织中则检测不到该基因的表达，因此ARL-1有可能成为一个新的肝癌标志物。在我们的研究中，应用抗ARL-1多克隆抗体，采用ELISA方法检测外周血中ARL-1抗原(1)在80％肝癌患者检测到ARL-1抗原，在健康成人却检测不到；(2)在AFP阴性的肝癌患者能检测到ARL-1抗原；(3)在AFP阳性的非肝癌患者，如怀孕早期、生殖腺胚胎瘤等，ARL-1阴性；(4)在20％的肝癌患者，ARL-1检测不到。因此，以该多克隆抗体，检测患者外周血中ARL-1抗原，有助于肝癌的早期诊断。
早期肝癌可以采取手术根治，中、晚期肝癌采取联合治疗方案，其中导向治疗是一个非常有前景的研究方向。弹头包括化疗药物、核素、免疫毒素，但是它们对肿瘤细胞及正常细胞都有杀伤作用。因此要解决特异性杀伤问题，ARL-1作为肝癌的特异性靶分子，抗ARL-1抗体可能成为一有用的载体。本研究中采用该抗体，应用免疫印迹方法(1)能在75％的肝癌组织中检测到ARL-1蛋白，仅在25％的癌旁组织检测到该蛋白的微量表达；从表达水平来看，在62.5％的肝癌组织上调。(2)在小肠(如十二指肠)、结肠(如升结肠)、胆囊有微量ARL-1蛋白的表达；而在正常肝脏、食道、胃、直肠、腹膜、卵巢、子宫、肾、扁桃体、睾丸鞘膜、睾丸却没有ARL-1蛋白的表达。(3)在两种肝癌细胞株HEPG-2、7402和人胚肝细胞株L-02检测到ARL-1蛋白，在永生化的鳞状上皮细胞株Hacat没有检测到该蛋白。(4)在小鼠输精管、睾丸检测到ARL-1同源蛋白，在其它各种小鼠组织(包括脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、大肠、胰、输尿管、膀胱、卵巢、子宫、脊髓、甲状腺、皮肤、肌肉、胎盘、胚胎)没有检测到ARL-1同源蛋白。(5)在大鼠各种组织、成年酵母、果蝇没有检测到ARL-1的同源蛋白。因此，ARL-1作为肝癌的特异性靶分子，ARL-1抗体可能成为一有用的载体。
发明内容
1、技术问题本发明的目的在于提供一种抗醛糖还原酶相似蛋白多克隆抗体的制备方法，其多克隆抗体为一种新的肝癌早期诊断试剂，从而提高肝癌的早期诊断水平，为肝癌的早期治疗创造条件；同时还作为一种新型、高特异性的载体，为肝癌的导向治疗提供工具。
2、技术方案本发明的技术方案为醛糖还原酶相似基因(ARL-1)是一种肝癌相关基因，采用基因重组的方法表达、纯化两种ARL-1的重组蛋白ARL-(His)6、ARL-GST。将ARL-(His)6免疫家兔制备抗血清，采用亲和层析的方法，以ARL-GST为配基，从血清中纯化出抗ARL-1的多克隆抗体。
制备的工艺为a)ARL-1重组质粒构建根据GenBankTMHARLU37100已知序列，设计引物，扩增ARL-1基因，以合适的酶切位点将ARL-1 PCR(多聚酶链反应)产物插入质粒，经酶切、测序等手段证明插入子正确；b)两种ARL-1重组蛋白[ARL-(His)6、ARL-GST]的表达、纯化将重组质粒转化到大肠杆菌中，当细菌长到对数生长期时，isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside(IPTG)诱导表达ARL-1重组蛋白，收集细菌，采用超声波破碎，经离心收集上清，此为粗蛋白，粗蛋白采用亲和层析纯化，纯化产物采用SDS PAGE鉴定；c)抗ARL-1血清的制备选择健康、成年、雄性家兔进行免疫。首次免疫用纯化的重组蛋白ARL-(His)6加入等体积弗氏完全佐剂进行多点皮下注射；三周后加强免疫，共加强4-6次(每次间隔两周)，从耳缘静脉采取少量血液，经琼脂糖双向扩散试验证明阳性后，颈动脉插管收集血清，加0.1％叠氮钠-20℃保存。
d)抗ARL-1多克隆抗体的纯化以纯化的ARL-GST为配基，亲和层析纯化抗ARL-1多克隆抗体。纯化后的抗ARL-1多克隆抗体应用免疫印迹方法鉴定其纯度及效价。
3、技术效果本发明的优点是制造了一种肝癌特异性的多克隆抗体，可用作肝癌的早期诊断。应用该抗体，采用ELISA方法检测外周血中ARL-1抗原(1)在80％肝癌患者检测到ARL-1抗原，在健康成人却检测不到；(2)在AFP阴性的肝癌患者能检测到ARL-1抗原；(3)在AFP阳性的非肝癌患者，如怀孕早期、生殖腺胚胎瘤等，ARL-1阴性；(4)在20％的肝癌患者，ARL-1检测不到。
这种肝癌特异性的多克隆抗体，以ARL-1蛋白为靶分子，可用作肝癌导向治疗的载体。应用该抗体，应用免疫印迹方法(1)能在75％的肝癌组织中检测到ARL-1蛋白，仅在25％的癌旁组织检测到该蛋白的微量表达；从表达水平来看，在62.5％的肝癌组织上调。(2)在小肠(如十二指肠)、结肠(如升结肠)、胆囊有微量ARL-1蛋白的表达；而在正常肝脏、食道、胃、直肠、腹膜、卵巢、子宫、肾、扁桃体、睾丸鞘膜、睾丸却没有ARL-1蛋白的表达。(3)在两种肝癌细胞株HEPG-2、7402和人胚肝细胞株L-02检测到ARL-1蛋白，在永生化的鳞状上皮细胞株Hacat没有检测到该蛋白。(4)在小鼠输精管、睾丸检测到ARL-1同源蛋白，在其它各种小鼠组织(包括脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、大肠、胰、输尿管、膀胱、卵巢、子宫、脊髓、甲状腺、皮肤、肌肉、胎盘、胚胎)没有检测到ARL-1同源蛋白。(5)在大鼠各种组织、成年酵母、果蝇没有检测到ARL-1的同源蛋白。
本发明所述抗ARL-1多克隆抗体，可用作肝癌的早期诊断及用作肝癌导向治疗的载体。
具体实施例方式
下面是
具体实施例方式醛糖还原酶相似基因(ARL-1)是一种肝癌相关基因，采用基因重组的方法表达、纯化两种ARL-1的重组蛋白ARL-(His)6、ARL-GST。将ARL-(His)6免疫家兔制备抗血清，采用亲和层析的方法，以ARL-GST为配基，从血清中纯化出抗ARL-1的多克隆抗体。
抗ARL-1多克隆抗体制备，具体如下a)ARL-1重组质粒构建根据GenBankTMHARLU37100已知序列，设计引物。5′引物cg gaa ttc atg gccacg ttt gtg gag c(含有EcoRI酶切位点)。3′引物cg ctc gag tca ata ttctgc atc gaa ggg(含有XhoI酶切位点)。扩增ARL-1基因，以EcoRI、XhoI酶切位点将PCR产物插入pGEX-4T-1(His)6C，经酶切、测序等手段证明插入子正确。经同样的方法将ARL-1基因插入pQE-30。
b)两种ARL-1重组蛋白[ARL-(His)6、ARL-GST]的表达纯化将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside(IPTG)诱导表达ARL-1重组蛋白。具体说来，当细菌长到A600＝0.4时，加入终浓度为0.05mM的IPTG在30℃过夜，收集细菌，采用超声波破碎，经离心(12,000×g，4℃)收集上清，此为粗蛋白。粗蛋白分别采用Pharmacia Biotech公司的Glutathione sepharose 4B纯化ARL-GST、Clontech公司的TALONRmetal affinity resin纯化ARL-(His)6(参照说明)，15％SDS PAGE显示纯化后的产物只有一条带[ARL-(His)6为60.8KD、ARL-GST为35.7KD]。
c)抗ARL-1血清的制备选择健康、成年、雄性家兔进行免疫。首次免疫采用0.4mg纯化后的重组蛋白ARL-(His)6加入等体积弗氏完全佐剂进行多点皮下注射；三周后用0.16mg的ARL-(His)6加等体积的弗氏不完全佐剂加强免疫，共加强4次(每次间隔两周)，从耳缘静脉采取少量血液，经琼脂糖双向扩散试验证明阳性后，颈动脉插管收集血清，加0.1％叠氮钠-20℃保存。
d)抗ARL-1多克隆抗体的纯化以纯化的ARL-GST为配基，Pharmacia Biotech公司的CNBr-activatedsepharose 4B纯化抗ARL-1多克隆抗体(参照说明)。纯化后的抗ARL-1多克隆抗体只与ARL-1重组蛋白以及转有ARL-1基因的细菌产物显示特异性条带(34.8KD)，而分别转有上述两种空栽质粒pGEX-4T-1(His)6C、pQE-30的大肠杆菌BL21都是阴性的。
权利要求
1.一种抗醛糖还原酶相似蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于醛糖还原酶相似基因(ARL-1)是一种肝癌相关基因，采用基因重组的方法表达、纯化两种ARL-1的重组蛋白ARL-(His)6、ARL-GST，将ARL-(His)6免疫家兔制备抗血清，采用亲和层析的方法，以ARL-GST为配基，从血清中纯化出抗ARL-1的多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的抗醛糖还原酶相似蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于制备的工艺为a)ARL-1重组质粒构建根据GenBankTMHARLU37100已知序列，设计引物，扩增ARL-1基因，以合适的酶切位点将ARL-1 PCR产物插入质粒，经酶切、测序等手段证明插入子正确；b)两种ARL-1重组蛋白[ARL-(His)6、ARL-GST]的表达、纯化将重组质粒转化到大肠杆菌中，当细菌长到对数生长期时，isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside(IPTG)诱导表达ARL-1重组蛋白，收集细菌，采用超声波破碎，经离心收集上清，此为粗蛋白，粗蛋白采用亲和层析纯化，纯化产物采用SDS PAGE鉴定；c)抗ARL-1血清的制备选择健康、成年、雄性家兔进行免疫。首次免疫用纯化的重组蛋白ARL-(His)6加入等体积弗氏完全佐剂进行多点皮下注射；三周后加强免疫，共加强4-6次(每次间隔两周)，从耳缘静脉采取少量血液，经琼脂糖双向扩散试验证明阳性后，颈动脉插管收集血清，加0.1％叠氮钠-20℃保存；d)抗ARL-1多克隆抗体的纯化以纯化的ARL-GST为配基，亲和层析纯化抗ARL-1多克隆抗体。纯化后的抗ARL-1多克隆抗体应用免疫印迹方法鉴定其纯度及效价。
全文摘要
抗醛糖述原酶相似蛋白多克隆抗体的制备方法，是一种多克隆抗体的制备方法，属于生物工程开发新型肝癌诊断、治疗试剂的技术领域。采用基因重组的方法表达、纯化两种ARL－1的重组蛋白ARL－(His)
文档编号C12N15/70GK1403482SQ0213841
公开日2003年3月19日 申请日期2002年10月11日 优先权日2002年10月11日
发明者金俊飞, 谢维 申请人:东南大学