专利名称：在酵母菌中生产多肽的酵母菌表达系统、方法和相关组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及在酵母菌中产生多肽的表达系统，涉及其组成以及制造和使用该系统的方法。
背景技术：
重组DNA技术的发展使得能够用微生物生产许多各种各样有用的多肽。例如，已用包括细菌和多种酵母菌在内的各种微生物来生产人生长激素、白细胞介素、人胰岛素和人胰岛素原等真核细胞多肽。预计将来通过重组DNA技术可从各种其它微生物生产多肽。
通常采用重组DNA技术生产多肽的商品化方法集中于采用大肠杆菌作为宿主生物。然而已证明在许多情况下用大肠杆菌作宿主是不适宜的。例如，大肠杆菌含有大量有毒的致热原质，必须将其从用作药物制品的多肽中去除，当然达到这种纯化的效果随具体多肽而不同。此外，大肠杆菌的溶蛋白活性可能严重限制了某些有用产品的产量。这些和其它考虑使对其它宿主生物特别是用于生产多肽产品的真核生物的利用兴趣日益提高。
对于生产多肽，在真核系统如酵母菌中生产多肽产品相对于采用原核系统如大肠杆菌提供了明显的优点，例如，与不久前才出现的大规模大肠杆菌发酵相比，采用酵母菌大规模发酵已有几百年，酵母菌可以比细菌更高地密度生长，容易适应连续发酵过程，美国专利4,414,329描述了巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)以超高细胞密度生长，细胞密度超过每升100克。美国专利5,002,876描述了巴斯德毕赤酵母生产人肿瘤坏死因子。酵母菌宿主在生物的许多重要功能中，如细胞器中进行的氧化磷酸化中也有优点，因而不会接触该微生物因产生野生型宿主细胞外源多肽所致的可能有害作用。此外，作为真核生物，酵母菌可糖基化表达的多肽产物。这种糖基化对该多肽产物的生物活性十分重要。作为真核生物，酵母菌还可能显示高等生物同样的的密码子偏爱，从而可更有效地从哺乳动物基因，或通过逆转录从(例如)哺乳动物信使RNA(“mRNA”)获得互补DNA，产生表达产物。
已鉴定到的甲醇同化性酵母菌是用于重组表达系统的有吸引力候选菌，甲醇同化性酵母菌能利用甲醇作为碳原和能源，当用于表达系统时有几种优点。例如，某些甲醇同化酵母菌能在基础营养培养基中快速生长。此外，这些酵母菌的某些基因在诱导的或去阻遏条件下受到紧密调控和高表达，提示这些基因的启动子可用于生产有商业价值的多肽。Faber等，Yeast 111331(1995)；Cregg等，Bio/Technology 11905(1993)，二文所公开的内容整体纳入本文参考文献中。
传统上将具有甲醇同化所需生化通路的酵母菌分成4个属汉逊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属和球拟酵母属，已报道了采用毕赤巴斯德和汉逊多态酵母菌的表达系统，Faber等，Curr Genet 25305-310(1994)；Crygg等，同上；Rcmans等；Yeast2423(1992)，此三文的公开内容整体纳入本文参考文献中。然而这些属是根据细胞形态和生长特征划分，并不反映其遗传关系。此外，已显示这些属中并非所有的都能利用甲醇作为碳源和能源。另外，对几种甲醇同化性酵母菌通过185和26S核糖体RNA的部分序列作了种系发生关系调查，显示巴斯德毕赤酵母与其它毕赤酵母属有显著的碱基差异。见Yamada等，Biosci.Biotech.Biochem.59(3)439-444(1995)，其公开内容整体纳入本文参考文献。这种一菌属各菌种之间形态学和代谢的实质性差异，同一属中各成员所具有的不同特性，不易根据种系发生特征来预测。
开发这些特性了解很少的酵母菌种用于表达系统，由于缺乏对转化技术和条件，特别是各菌株具体调节区的了解，而受到严重阻挠。取决于所用的酵母菌株，获得了每毫克质粒约50-10万个转化菌的具体转化技术(见Dohmen等Yeast，7691-692(1991)。虽然酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)可用乙酸锂转化，但此法对巴斯德毕赤酵母不佳。此外，即使采用同一酵母菌株和同样的转化方法，质粒不同产生的效率也不同。开发进展缓慢部分是由于缺乏适当的材料如载体、启动子、可选择标记和宿主细胞。此外，已显示常常不能得到营养缺陷性突变体，从而妨碍了通过营养缺陷的补充进行转化体的直接选择。对于充分具有发展前景的重组DNA技术，必须设计出新的宿主/载体系统，以促进DNA的操纵和优化插入的DNA序列的表达，从而能在可控制的条件下高产量制备所需的多肽产品。
为此需要开发包括某些酵母菌株作为宿主生产多肽产品的新的表达系统。本发明就是针对此目的的，并且具有其它重要用途。
发明概述本发明涉及生产所需多肽的酵母菌表达系统。此表达系统包括选自OgataeaWickerhamii(O.Wickerhamii)、Ogataea kodamae(O.kodamae)、Ogataea pini(O.pini)、Komagataella pastoris(K.pastoris)或Zygosaccharomyces pastori(Z.pastori)的酵母菌宿主细胞和载体。此载体表达编码所需多肽的基因操作性连接于一个或多个调节区的核酸分子。在一些优选实施方案中，此酵母菌宿主细胞是K.pastoris。
本发明还涉及从酵母菌宿主细胞分离所需多肽的方法，此方法包括用含有编码所需多肽的核酸分子的表达载体转化酵母细胞，用所述表达载体转化该宿主细胞，培养扩增转化的宿主细胞和从培养物中分离所需的多肽。在一些优选实施方案中，此载体含有K.pastoris醇氧化酶基因启动子。
本发明还涉及具有核酸酶序列SEQ I NO1的启动子活性的分离的核酸分子。
相关方面，本发明涉及用所述新表达系统生产的多肽产品。本发明的这些和其它文献内容可从本文和权利要求所提供的内容得到了解。
附图简要说明
图1为SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，显示K.pastoris发酵时诱导的TNF。泳道1和7为分子量标准(从上到下为200、116.3、97.4、66.3、55.4、36.5、31、21.5、14.4、6、3.5，单位是千道尔顿)；泳道2为用甲醇诱导前；泳道3为诱导后1天；泳道4为诱导后2天；泳道5为诱导后3天；泳道6为纯化的TNF。
图2为大肠杆菌和K.pastoris纯化的TNF的SDS-PAGE。分子量标准(从上到下为200、116.3、97.4、66.3、55.4、36.5、31、21.5、14.4、6，单位是千道尔顿)。
图3为比较从大肠杆菌和K.pastoris纯化获得的TNF的L929细胞毒性试验的结果。
发明详述回顾本发明是根据以下重要发现某些酵母菌株可用作宿主表达系统来生产多肽。故本发明涉及包括某些酵母菌株作为宿主细胞的表达系统。本发明还涉及用于酵母表达系统的重组DNA分子、重组载体和调节区。这种新的表达系统可专用于生产所需多肽。在某些实施例中，这些多肽可用作工业和药物蛋白质及酶。
可用转化酵母菌细胞生产许多不同的所需多肽，包括但不限于酶、生长因子、细胞因子、免疫原性蛋白、免疫球蛋白，如单链抗体或抗体片段等，在一优选实施方案中，本发明的酵母表达系统生产脱亚氨氨酶蛋白，更优选精氨酸脱亚氨酶。
本发明的出乎意料的发现是可用本发明的K.pastoris生产这些多肽，而其它表达系统则不能，例如，可在K.pastoris中产生精氨酸脱亚氨酶(ADI)成为可溶性活性酶，然而其它表达系统不能产生活性ADI。例如在大肠杆菌中ADI胞内表达为无活性形式的包涵体。当ADI以周质蛋白在大肠杆菌中表达时，产生的蛋白缺乏活性。当采用巴斯德毕赤酵母菌株表达ADI时，只表达少量的ADI，而且表达的蛋白质缺乏酶活性。
为实施重组DNA技术，通常宿主微生物需要几种有用的成分，包括但不限于宿主细胞和含有编码所需多肽核酸分子的载体。
定义术语“表达系统”在本文中指产生所需多肽的系统组分。本发明的“表达系统”具体包含酵母菌宿主细胞和含有编码所需多肽核酸分子的载体。此载体含有操作性连接于一种或多种所需多肽的一种或多种核酸序列的调节区。此载体在操作上与酵母宿主细胞相容。
术语“操作上相容”在本文中表示该表达系统的载体能在所选宿主细胞中起作用产生所需的多肽。
术语“甲醇同化酵母菌”在本文中指能利用甲醇作为碳源和能源的那些酵母菌。非限制性的例子包括假丝酵母属、汉逊酵母属、Komagatella、Ogaatea、毕赤酵母属、球拟酵母属和Zygosaccharomyces酵母属的酵母。
术语“转化”在本文中指摄取和掺入DNA到宿主细胞中。其中导入的DNA可能改变接受细胞的表型。
术语“异源性核酸序列”在本文中指某给定宿主细胞中天然不存在的核酸序列。
术语“同源性核酸序列”在本文中指某给定宿主细胞中天然存在的核酸序列。
术语“操作性相连接”在本文中表示核酸序列的安排使得它们能协调起作用，而达到它们希望的目的。
术语“操作上相容”在本文中表示该表达系统的载体能在所选宿主细胞中起作用，产生所需的多肽。
术语“调节区”本文从专业含义指，能指导产生其它核酸序列编码的多肽的核酸序列。调节区可包括但不限于转录启动子、转录终止子、激活子序列和酵母菌复制起点。
术语“多肽”在本文中指某核酸分子的翻译产物，不论大小、是否糖基化、磷酸化或翻译后修饰。本发明的多肽例子包括氨基酸、蛋白质和肽。“所需多肽”指某核酸序列基因编码的多肽，可以是本发明核酸构建物所产生。包括功能等价物，或该肽或所选多肽的片段。
术语“异源性多肽”在本文中指本发明宿主细胞天然不表达的多肽。
术语“启动子”在本文中指提供RNA聚合酶结合和启动转录的核酸序列，启动子可含有功能为引起转录的序列元件，也可以共同的核苷酸序列为特征。这些序列元件可包括RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列、分化特异性元件、环化AMP应答元件、血清应答元件、糖皮质激素应答元件和其它转录因子如CRE/ATF、SPI、cAMP应答元件结合蛋白及八聚体因子的结合位点。适合用于本发明的启动子包括但不限于可诱导型启动子、组成型启动子和杂交启动子。
通常启动子定位于基因的5’区中，靠近该基因的转录起始位点。本发明的启动子约长100-1000个核苷酸。一优选实施方案中，该启动子约长200-800个核苷酸。
术语“可诱导启动子”在本文中指可被调节的启动子。本发明优选的可诱导启动子是可被上调的那些启动子。酵母菌衍生的可诱导启动子的例如包括但不限于Ppmp20和Ppmp47，博伊丁假丝酵母的甲醇可诱导启动子。
术语“组成型启动子”在本文中指不能被调节的启动子，即它总是处在“开”或“关”状态。
术语“杂交启动子”在本文中指含有一个以上来源的核酸序列的启动子。例如一种示范性的杂交启动子可包含一种来源启动子的一部分，和第二种来源启动子的一部分。
术语“终止子”或“转录终止子”在本文中指在转录物末端引起RNA聚合酶终止转录的核酸序列。本发明所用终止子的例子包括但不限于ios-1-细胞色素c基因转录终止子和醇氧化酶基因转录终止子。某些优选实施方案中，此终止子是K.pastoris的AOX终止子。
术语“酵母菌复制起始点”还有“复制起点”在本文中指核酸序列上引起复制的位点。能表达所需多肽的重组载体中可能需要酵母菌复制起点，以复制该载体导致所需多肽的显著表达，适合用于本发明的酵母菌复制起点的例子，在美国专利4,615,971(Kingsman等)中有所描述，包括但不限于2μ质粒复制系统或具有功能的活性部分和自主复制序列(ARS)。ARS的例子包括但不限于ABS1或ARS3。
术语“宿主细胞”在本文中指能用携带有编码所需多肽的核酸分子的载体转化的微生物。此宿主微生物中具有能表达编码所需多肽的核酸分子的细胞装置。
在本文中，术语“序列相同性百分比”或“序列同源性百分比”的计算是通过比较两个最佳排列对比的序列的相比较区域，确定两序列中核酸碱基(如A、T、C、G、D或I)相同的位置数目产生相匹配位置的数目，将相匹配位置的数目除以相比较区域的位置总数(即窗口大小)，结果乘以100，得到序列相同性百分比。术语“基本上相同”本文用于指某多核苷酸序列的特征，其中此多核苷酸与参比序列相比，在相比较区域中的序列至少有80％序列相同，优选至少85％相同，常为95-98％序列相同，更常为至少99％序列相同。
通常用本领域已知的计算机同源性程序进行同源性或相同性的测定。一种示范性的程序是Gap程序(Wisconsin Sequeuce Analysis Package.UNIX第8版，GeaeticaCanpnter Grap，University Research Park，麦迪逊，WT)其采用默认设置，运用Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Math，1981，2482-489其内容整体纳入本文参考文献)。采用GCG程序包(见Needleman Cand Wunsch 1970.J Mol Biol 48443-453)中提供的GAP软件。可采用对核酸序列的以下设置空隙产生罚分5.0，空隙延伸罚分0.3，参照以上类似核酸序列的编码区显示的相同性程度，与SEQ ID NO1所示序列宜至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同。或者可通过杂交分析测定同源性，此分析中在严谨(即高严谨)、中等严谨或低严谨条件下，使核酸序列与编码上述蛋白质的序列的互补序列杂交。
“高严谨杂交条件”在本文中指在存在50％甲酰胺时42EC杂交。第一次在65℃用含1％SDS的2×SSC液洗涤，然后第二次用0.1×SSC液65℃洗涤。
“中等严谨杂交条件”在本文中指在55℃杂交用含0.5％的6×SSC，然后用37℃1×SSC洗二次。
术语“载体”在本文中指一种核酸分子，可在该分子中插入或克隆入核酸片段DNA。载体的作用是将编码所需多肽的核酸分子转运入宿主微生物，将该核酸分子保留在宿主微生物中以及提供该核酸序列的高水平表达。
酵母菌宿主细胞在某些实施例中，酵母宿主细胞是甲醇同化酵母菌株。在一些优选实施方案中，酵母菌宿主细胞选自Ogataea Wickerhamii(O.Wickerhamii)、Ogataea kodamae(O.kodamae)、Ogataea pini(O.pini)、K.pastoris或Zygosaccharomyces pastori(Z.pastori)。在最优选实施方案中，酵母菌宿主细胞是K.pastoris。
已发现O.Wickerhamii、O.kodamae、O.pini、K.pastoris和Z.pastori是生产所需多肽的高效宿主细胞。此外，此类宿主细胞产生的多肽是糖基化的，基本上没有毒性致热原因子。另外，可用这类宿主细胞产生分泌型的所需多肽，有利于纯化。
本发明的表达系统包括酵母菌细胞作为宿主，来生产所需多肽。O.Wickerhamii、O.kodamae、O.pini、K.pastoris和Z.pastori以前不曾用于生产所需多肽，部分是因为这些菌中未鉴定到表达所需多肽的适合启动子。另外，预测这些酵母菌株是否能产生多肽，如果它们实际上可用于产生多肽，什么条件能最有效产生所需多肽，以及多肽产物是否能恰当地糖基化和/或无毒性致热原因子。
这些酵母菌可在简单的培养基上快速增殖至细胞高密度。酵母菌可在含有适当碳源、氮源和其它元素以及微量营养素的培养基中生长，优选YPD生长培养基(2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母提取物)。为生产重组蛋白优选在含甲醇的基础培养基(6.7克/升酵母氮碱基无氨基酸，0.5％甲醇。0.4微克/升生物素)上生长。
此外，这些酵母菌的某些基因的启动子受紧密调控非常强，使其能在诱导的或去阻遏条件下产生大量的重组蛋白质。这使得这些酵母菌特别可用于生产有商品价值的蛋白质和肽，而无须象用大肠杆菌作为宿主细胞那样需经过广泛的翻译后加工。见例如。Faber等，Yeast 111331(1995)；Cregg等，Bio/Technology 11.905(1993)，此二文公开内容整体纳入本文参考文献。
可用约22℃-35℃培养酵母菌，优选温度约30℃，可在液体培养基上或含琼脂的固体培养基上培养酵母菌，对于液体培养生长，必须快速摇动烧瓶或发酵罐喷气来提供充分通气。
酵母菌细胞的培养是本领域技术人员知道的，例如，可在含足够碳源、氮源和微量营养素的培养基中大约25-30℃下培养K.pastoris细胞。摇动小烧瓶或试管通风或发酵罐喷气提供液体培养。适当的培养基是本领域技术人员熟知的，一种优选培养基是YPD(2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖，Difco，底特律，美国密歇根)。细胞可通过新鲜培养基稀释传代或在冰箱中存放几天至几周。长期贮存细胞应保存在-70℃的50％甘油液中。
载体本发明还提供用于酵母菌表达系统的载体。例如，可通过转化将含有编码所需多肽的核酸序列的载体导入酵母菌宿主细胞。通过在适当条件下培养转化的酵母菌可获得大量载体。
一些优选实施方案中，本发明表达系统所含的载体含有操作性连接的元件，包括编码异源性和/或同源性多肽的核酸分子、转录启动子和转录终止子。
优选的载体宜含有酵母宿主所识别的启动子，包括但不限于质粒、噬菌体、粘粒、游离体、病毒颗粒或病毒和可整合性核酸片段(即通过同源重组可整合入宿主基因组中的片段)。优选的病毒颗粒包括但不限于腺病毒、杆状病毒、细小病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒、腺相关病毒、Semliki森林病毒、痘苗病毒和逆转录病毒。优选的表达载体包括但不限于pAO815、pGAPZ、pGAPZd、pPIC3.5K、pPIC6、pPIC6α、pPIC9、pPICZ、pPICZα、pPIC-E、pPICZ-E、pMET和pMETα，均可从Invitrogen(Carlsbad，CA)获得。宜用表达载体来产生一种或多种所需多肽，但也可单单用于扩增编码所需多肽的核酸序列。一实施例中，此载体是一种表达载体，载体中编码所需多肽的核酸分子操作性连接于一个或多个调节区。还提供掺入了编码所需多肽的核酸分子的自主复制性重组表达构建物，如质粒和病毒DNA载体。
载体可含有适当的标记物得以筛选转化的宿主细胞。可采用本领域专家熟知的和Sambrook等(同上)所述的各种技术之一进行所选宿主的转化。
扩增载体不需要表达控制结构域，但需要的只是通常由复制起点所赋予的在宿主中复制的能力和促进转化子识别的选择基因。对表达载体中调节区的需要将根据所选宿主和所选转化方法而不同。
优选载体中也可包含其它调节区。其它适合的调节区序列的优选例子由噬菌体MS-2的复制酶基因和噬菌体λ的基因cII的Shine-Dalgarno序列为代表。
一优选实施方案中，此载体是质粒。除了微生物天然产生的那些质粒外，可获得各种人造质粒或杂交载体。例如，可用一种或另一种限制性内切核酸酶或限制性酶(每一种识别某质粒上的一特异性、独特位点)特异性切割该质粒。因此，可在切割位点或毗邻该切割位点的重建位点两端，连接切割的质粒和所需的基因物质，将同源核酸分子、异源核酸或核酸分子的片段插入此质粒。这样产生的重组物质可称之为杂交载体。此外，天然产生的和杂交载体通常含有编码各种信息(包括在子代细胞中复制此质粒的信息)，即自主复制序列或复制起点。这类载体通常也编码一种或多种表型选择特征。表型选择特征使含有待识别的感兴趣质粒的宿主细胞得以克隆，并通过该细胞在选择性培养基中优先生长而选择出来。
当该核酸序列以参照控制编码核酸序列转录和翻译的载体部分正确取向插入时，所得载体可用于指导所需多肽的产生。
一些实施例中，本发明的表达系统包含适用于酵母菌的载体和启动子。某些实施例中此载体和启动子适用于甲醇同化酵母菌。本领域技术人员熟知的许多甲醇同化酵母菌基因可包括但不限于编码醇氧化酶、二羟丙酮合成酶、甲酸脱氢酶和过氧化氢酶的基因。这些基因的成分如启动子、编码序列和转录终止子等可用于表达载体中。本领域熟知的适合用于本发明的许多其它载体包括，例如pUC18、pUC19和pBR322等大肠杆菌载体。其它载体包括但不限于嗜甲烷和酿酒酵母的启动子。
某些实施例中，编码所需多肽的异源核酸分子还可含编码一选择性标记的核酸分子。此选择性标记可使转化的细胞在非转化细胞不能生长的条件下(“选择性条件”)增殖。选择的一般原理是本领域技术人员熟知的，常用的选择标记是编码氨基酸或核苷酸合成所需酶的DNA序列。这些基因中发生突变的细胞不能在缺乏特定氨基酸或核苷酸的培养基中生长，除非此突变为所选标记所补偿。采用这种选择性培养基保证异源核酸稳定保持在宿主细胞中。本发明另一实施例中，可采用优势可选择标记。优势可选择标记是那些向转化细胞提供生长优势的标记。优势可选择标记包括但不限于提供抗菌素抗性如新霉素类抗菌素(G418)抗性、潮霉素B和博来霉素/柔红霉素类如ZeocinTM(Invitrogen公司，圣地亚哥，CA)抗性的DNA序列。此外，本发明的表达系统含有的载体可含甲醇同化酵母菌自主复制序列的核酸分子片段，此片段插入载体中取代或加入该标记基因。在某些优选实施方案中，可选择标记是转座子Tn5的新霉素磷酸转移酶基因，其赋予对新霉素类抗菌素优选G418的抗性。
启动子用于本发明的启动子可以是真核、原核或病毒来源的。如上所述，启动子也可以是人造来源如杂交启动子。适用于本发明的启动子例子包括但不限于醇氧化酶基因启动子、二羟丙酮合成酶基因启动子、甲醇脱氢酶基因启动子、延伸因子1-α基因启动子、过氧化氢酶基因启动子、猿病毒40启动子、小鼠乳腺瘤病毒启动子、人免疫缺陷病毒启动子的长未端重复序列、莫洛尼病毒启动子、巨细胞病毒立即早期启动子、EB病毒启动子、罗斯肉瘤病毒启动子、人肌动蛋白启动子、人肌球蛋白启动子、人血红蛋白启动子、人肌酸启动子和人金属硫蛋白启动子。
优选的启动子是甲醇诱导启动子，宜为K.pastoris醇氧化酶基因启动子。K.pastoris AOX启动子的序列见SEQ ID NO1。其它适合用于本发明的启动子包括二羟丙酮合成酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)和过氧化氢酶(CAT)基因的启动子。编码其它菌种这些酶的基因已有描述，可获得其序列(如Janowicz等，Nuc.Acid.Res.，132043，1985；Hollenberg和Janowicz，EPO公开0299108；Didion和Roggenkamp，FEBS Lett.303133(1992)。可克隆编码这些蛋白质的基因，采用已知序列作为探针筛选K.pastoris基因组文库或排列对比已知的序列。引物根据排列对比时发现的保守序列设计，采用例如聚合酶链反应(PCR)扩增K.pastoris DNA。
本发明还包括K.pastoris AOX启动子的同类物，一般这些同类物宜与本发明的AOX启动子至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同。通常，可将候选序列中的核苷酸碱基与K.pastoris AOX启动子序列SEQ ID NO1中核苷酸相同的百分率，计算为本发明多核苷酸序列“相同性”(或“同源性”)百分率，如需要，对这些序列排列对比并导入空隙以实现最大的序列相同性百分率。
一优选实施方案中，本发明的载体所含的质粒含有K.pastoris醇氧化酶(AOX)基因启动子，其操作性连接于AOX转录终止子。AOX启动子和转录终止子之间是供插入一个或多个在AOX启动子控制下表达的异源核酸序列的多个克隆位点。此外，此质粒还含有编码转座子Tn5的新霉素磷酸转移酶基因的核酸分子，赋予了对新霉素类抗菌素(优选)G418的抗性。这使得能通过G418抗性直接筛选转化酵母菌。新霉素磷酸转移酶基因的表达受酿酒酵母延伸因子1-α基因启动子的控制，能在转化酵母菌中组成性表达新霉素磷酸转移酶。还可将酿酒酵母的iso-1-细胞色素c基因转录终止子连接于新霉素磷酸转移酶编码序列的3′端，以保证新霉素磷酸转移酶信使RNA的及时转录终止。此质粒的骨架衍生于pUC-19，含有大肠杆菌的复制起点和β-内酰胺酶基因，可用于在大肠杆菌中复制和选择此质粒。
试剂盒本发明一些实施例中，提供的试剂盒含有选自Ogataea Wickerhamii、Ogataeakodamae、Ogataeapini、Komagataella pastoris和Zygosaccharomyces pastori的酵母菌宿主细胞及载体。一些优选实施方案中，此载体是含有编码所需多肽的核酸的表达载体。其它实施例中，此载体含有供插入编码所需多肽的一个或多个核酸与一个或多个调节区操作性连接的一个或多个克隆位点。任选的，此试剂盒还可含有一样或多样以下材料用法说明书、培养酵母宿主细胞的培养基、用于选择性条件下培养的材料，用于转化酵母菌的材料、阳性结果代表性举例的照片、阴性结果代表性举例的照片、测量所表达多肽产物大小的分子量标准品。
酵母细胞的转化和培养本发明的表达系统可通过重组DNA技术获得，具体通过用编码所需多肽的核酸序列及调节该编码序列在具体酵母菌或酵母菌群中表达的一种或多种其它核酸序列转化酵母菌。重组DNA技术领域中所有的基本技术是本领域技术人员熟知的，见例如Sambrook等，“分子克隆实验手册”(Molecular CloningA Laboratory Manual)第三版，Cold Spring Habor Laboratory Press，冷泉港，NY(2001)。
本领域技术人员熟悉各种转化技术，包括将含核酸序列的游离型载体，或含还配备能被整合的核酸序列的核酸序列的载体导入微生物染色体中。见例如Maniatis等和Sambrook等。
实际上，可利用重组DNA技术创造出能完整表达异源多肽(即在所述微生物中通常没有的或不能产生的多肽)的微生物—所谓的“直接表达”。或者可将其表达为融合蛋白质即异源多肽融合于同源多肽(即野生型非转化宿主微生物中具有的或产生的多肽)—所谓“间接表达”。采用间接表达，最初获得的融合多肽产物在开始使用时无活性，直到该相互依赖的同源/异源多肽在特殊环境中(常为细胞外)被切断时才有活性。
酵母细胞可用多种类型核酸分子，包括但不限于DNA、RNA或mRNA转化。酵母细胞也可用核酸文库和合成的核酸分子转化。本发明因此特别提供基因多样性文库的表达。产生的产物可用于筛选新的生物学活性、基因工程改造的细胞用作筛选化合物文库的靶细胞，和基因修饰细胞以提高其在其它加工中的用途。
较佳的是编码某多肽的核酸序列应可调节，即“开”或“关”，因为当需要时可通过选择适当的底物增加生物量的产生。例如，这种调节当需要时可通过采用甲醇或甲醇和/或其它碳源混合物而得以产生此多肽。因为甲醇是一种便宜的底物，因而多肽的生产可能极其经济。因此本发明的表达系统还可含有一种核酸分子，该核酸分子含某特定基因的转录启动子，而此核酸分子基本上没有该特定基因的编码序列。
可通过许多已知方法的一种将异源核酸导入酵母宿主细胞的基因中，这些方法包括但不限于原生质球状体转化(Beggs，Nature 275104，1975；Cregg等，Mol.Cell.Biol.53376，1985)、锂转化(Hiep等，Yeast 91189-1197，1993；Bogdanova等，Yeast 11343，1995)、聚乙二醇转化(Kleve等，Gene，25333-341，1983；Dohmen等，Yeast 7691-692，1991)或电穿孔。本发明某些优选实施方案中，采用聚乙二醇转化(Dohmen等，Yeast 7691-692(1991)将DNA导入酵母宿主细胞中。用于转化酵母宿主细胞的DNA分子常制备成双链环形质粒，在转化前线性化。虽然在以下实施例中给出了K.pastoris转化的细节，也可用类似技术转化其它酵母宿主细胞。
一个在K.pastoris中直接选择G418抗性的实施方案中，将YPD肉汤加入转化混合物中，在30℃以200-250rpm摇动培养该混合物一段时间。然后取等份转化液直接接种在含G418的YPD的琼脂培养基上，25-32℃培养该平板1-6天，或直到出现菌落。一优选实施方案中，在约30℃培养平板约6天。
许多情况下，多个拷贝的重组基因整合入酵母菌可提高所需多肽的表达(Cregg等，Bio/Technology，11905-910(1993)；Romanos等，Curr.Opin.Biotech 6527-533(1995)；Scorer等，Bio/Technology，12181-184(1994)。筛选对高水平G418的抗性可鉴定含多拷贝插入物的转化酵母菌。对G418的抗性水平大约对应于整合入酵母菌染色体中新霉素抗性基因的数目。对高水平G418有抗性的转化菌应含有多拷贝的表达盒，可能显示出所需蛋白质的增加表达。可直接筛选能产生该重组蛋白质的G418抗性转化菌，可在作为唯一碳源的甲醇存在时，培养用携带甲醇可诱导启动子(连接于编码所需多肽的核酸)的表达载体转化的酵母宿主细胞。可在含甲醇的基础培养基(6.7克酵母氮碱基、无氨基酸(Difco)、5克/升甲醇、0.4微克/升生物素)的摇瓶中30℃强振摇培养转化的酵母细胞2-4天。
对于大规模生产，可在发酵罐中高密度培养酵母宿主细胞。用YPD在摇瓶中30℃强烈旋转培养细胞1-2天产生接种物，用接种物接种发酵罐中含有盐、甘油、微量元素和生物素的适当培养基，30℃、pH5.0、溶氧＞30％。使发酵罐中的细胞增殖直到耗尽所有甘油。然后启动甘油进料进一步增加培养生物量。完成甘油进料后，开始甲醇进料以诱导重组蛋白的表达。甲醇进料通常持续1-4天，获得的细胞密度约200-400克/每升湿细胞浆。
多肽的回收可用本领域技术人员熟知的方法回收多肽，本发明的表达系统也可提供引导所需多肽进入过氧化物酶体的核酸序列。过氧化物酶体是甲醇生长酵母菌细胞中大量存在的胞内小体。这些胞内小体的作用可能是将掺入的多肽产物与胞内液体和酶如蛋白酶分隔开。
本发明的表达系统还可提供所需多肽的分泌。有许多理由需要所需多肽的分泌。分泌到培养基中可使该多肽的纯化更容易，因为不需要破裂打开宿主细胞和从宿主细胞蛋白中纯化得到此多肽。由于相当少的宿主细胞蛋白是分泌性的，这使得从所需多肽中去除污染的宿主细胞蛋白更简单费用更少。某些情况下，当重组多肽对宿主细胞可能有毒时，分泌到培养基中可阻止该多肽在细胞内的毒性作用。此外，某些多肽直到分泌后才能产生活性形式。
为了让宿主细胞分泌多肽，可能需要在成熟的分泌多肽的N端连接一信号肽，宿主细胞的转运机制能识别该信号肽，此信号肽可使蛋白质通过宿主细胞膜分泌出来。在成熟蛋白质被释放入培养基的转运加工时，通常切除此信号肽。将重组蛋白的编码序列与信号肽的核苷酸序列连接可实现重组蛋白质的分泌。
实施例本发明通过以下实施例进一步说明，实施例的目的是阐明本发明而非限制本发明的范围。
实施例1分离K.pastoris的AOX基因片段采用PCR分离K.pastoris的AOX启动子、AOX编码序列部分和AOX转录终止子。PCB引物是根据发表的巴斯德毕赤酵母的AOX1启动子序列、编码序列和AOX1转录终止子(GenBank登录号E00913，GenBank登录号U96967)设计。分离AOX启动子的引物具有以下序列MOfor15′-GGAGCTCGCTCATTCCAATTCC-3′(SEQ ID NO2)AOrev 5′-GTGTGGTCACCGAAGAA-3′(SEQ ID NO3)为分离AOX转录终止子AOTTfor5′-GTGAAGCTTCAAGAGGATGTCAGAATGCC-3′(SEQ ID NO4)AOTTrev5′-CACACATGTGTGGGAAATACCTTGAAAAACATC-3′(SEQ IDNO5)用分离自K.pastoris(ATCC 28485)的基因组DNA和MOfor(SEQ ID NO2)与AOrev(SEQ ID NO3)引物进行PCR，分离AOX启动子和5’编码序列。反应物含有1XExTaq PCR缓冲液(TaKaRa)、100ng纯化的K.pastoris基因组DNA、0.2MmNTPS、1μM各引物和1.25U的ExTaq聚合酶(TaKaRa)。PCR条件如下94℃2分钟，然后35轮94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟，35轮后72℃10分钟。PCR产生了1958bp的产物。将此PCR产物亚克隆入pCR2.1，产生pCR2.1AOX-1(Invitrogen)，并测序此AOX产物。此产物的序列和随后的排列对比揭示与巴斯德毕赤酵母的AOX1启动子(GenBank登录号E00913)同源性约90％。
用分离自K.pastoris(ATCC28485)的基因组DNA和AOTTfor(SEQ ID NO4)与AOTTrev(SEQ ID NO5)引物进行PCR，分离K.pastoris醇氧化酶基因转录终止子。反应物含有1XExTaq PCR缓冲液(TaKaRa)、100ng纯化K.pastoris基因组DNA、0.2Mm NTPS、1μM各引物和1.25U的ExTaq聚合酶(TaKaRa)。PCR条件如下94℃2分钟，然后35轮94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟，35轮后72℃10分钟。PCR产生了234bp的产物。将此PCR产物亚克隆入pCR2.1(Invitrogen)，并测序。此PCR产物的序列对应于该转录终止子(SEQ ID NO7)，揭示与巴斯德毕赤酵母的AOX1转录终止子(GenBank登录号U96967)同源性约100％。
实施例2G418抗性盒的构建构建了G418抗性盒并用于选择具有G418抗性的转化酵母菌。此盒由新霉素磷酸转移酶基因、延伸因子1-α基因启动子和iso-1-细胞色素c基因转录终止子组成。用PCR分离酿酒酵母的延伸因子1-α(tef-1)基因启动子和iso-1-细胞色素c(cyc-1)基因转录终止子。此PCR所用的引物序列如下为分离新霉素磷酸转移酶编码序列KANfor5′-GTGACTAGTATGATTGAACAAGATGG-3′(SEQ ID NO8)KANrev5′-CACGCGGCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAG-3′(SEQ ID NO9)为分离tef-1启动子TEFfor5′-GTGAATATTCCCACACACCATAGCTTC-3′(SEQ ID NO10)TEFrev5′-CACACTAGTAAACTTAGATTAGATTGC-3′(SEQ ID NO11)为分离cyc-1转录终止子CYCTTfor5′-GTGGCGGCCGCGGCCCCTTTTCCTTTGTCG-3′(SEQ ID NO12)CYCTTrev5′-CTCAATATTAAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGC-3′(SEQ IDNO13)用含有Tn5新霉素磷酸转移酶基因作为模板和KANfor(SEQ ID NO8)与KANrev(SEQ ID NO9)引物的大肠杆菌细胞悬浮液进行PCR，分离新霉素磷酸转移酶编码序列。这些引物将SpeI限制性内切核酸酶位点安置在新霉素磷酸转移酶的5’端，将NotI位点安置在其3′端。用分离自酿酒酵母的基因组DNA作为模板和TEFfor(SEQ ID NO10)与TEFrev(SEQ ID NO11)引物进行PCR，分离tef-1启动子。这些引物将SspI和SpeI限制性内切核酸酶位点分别安置在tef-1启动子序列的5’端和3′端。用分离自酿酒酵母的基因组DNA作为模板和CYCTTfor(SEQ IDNO12)与CYCTTrev(SEQ ID NO13)引物进行PCR，分离CYC-1转录终止子。用这些引物将SspI和SpeI限制性内切核酸酶位点分别安置在cyc-1转录终止子序列的5’端和3′端。分离G418抗性盒三种组分的PCR含有1XExTaq PCR缓冲液(TaKaRa)、100ng纯化酿酒酵母基因组DNA、0.2Mm NTPs、1μM各引物和1.25U的ExTaq聚合酶(TaKaRa)。PCR条件如下94℃2分钟，然后94℃30秒，50C30秒，72℃1分钟30轮。30轮后72℃10分钟。PCR产生了815bp的新霉素磷酸转移酶编码序列产物、428bp的tef-1启动子产物和296bp的cyc-1转录终止子产物。将所有三种PCR产物亚克隆入pCR2.1(Invitrogen)进行测序。
为构建G418抗性盒，从各pCR2.1载体切下tef-1启动子和cyc-1转录终止子，并如下连接入含有新霉素磷酸转移酶编码序列的pCR2.1载体中。首先必须选择具有以正确取向插入的新霉素磷酸转移酶编码序列的pCR2.1载体，以保证亚克隆的限制性位点的正确定位。培养新霉素磷酸转移酶编码序列pCR2.1亚克隆产生的几个转化子并分离各自的质粒。用NotI消化这些质粒测定新霉素磷酸转移酶编码序列的取向。含理想取向的新霉素磷酸转移酶编码序列的pCR2.1载体在NotI消化时将释放33bp的片段。选出一个这样的质粒pCR2.1KAN，用Bam HI和SpeI消化。也用Bam HI和SpeI消化pCR2.1TEF，将含tef-1启动子的409bp片段连接入pCR2.1KAN，产生pCR2.1TEF-KAN。还必须选择含有特定取向的cyc-1转录终止子的pCR2.1亚克隆，以保证用于亚克隆的限制性内切核酸位点的正确定位。用Bam HI和SpeI消化测定cyc-1转录终止子的取向。用Bam HI和SpeI消化质粒pCR2.1CYC和理想取向的cyc-1转录终止子，将约300bp的片段连接入pCR2.1TEF-KAN的NotI-EcoRV位点。产生的质粒pCR2.1TEF-KAN-CYC含有在tef-1启动子控制下的新霉素磷酸转移酶编码序列，和该编码序列3′端的cyc-1转录终止子。
实施例3如下构建酵母菌表达载体。用Sac I消化pUC19，用Klenow片段处理以除去被消化质粒的3′突出端，然后再连接。这样从pUC19的多个克隆位点除去了ScaI位点。用Hind III和AflII消化从pCR2.1AOXTT切下AOX转录终止子，连接入已用相同二种限制性内切核酸消化的pUC19中。产生的质粒命名为pPX-1。
用PCR将Nde I和EcoR I限制性内切核酸酸酶位点分别安置在K.pastoris的AOX启动子的5’和3′端。此PCR的正向和反向引物具有以下序列MOfor25′-GTGCATATGTGGAGCTCGCTCATTCCAAT-3′(SEQ ID NO14)
MOrev5′-CACGAATTCTTCGAATAATTAGTTGTTTTTTG-3′(SEQ ID NO15)PCR含有1XExTaq PCR缓冲液(制造商)、10ng纯化pCR2.1AOX-1作为模板、0.2mM NTPS、1μM各引物和1.25U的ExTaq聚合酶(TaKaRa)。PCR条件如下94℃2分钟，然后30轮94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟，30轮后72℃培育10分钟。PCR产生了755bp的产物。将此PCR产物亚克隆入pCR2.1(Invitrogen)，产pCR2.1PAOX。
用Nde I和EcoR I从pCR2.1PAOX切下AOX启动子，连接入pPX-1的NdeI-EcoR I位点。产生的质粒pPX-2含有连接于AOXTT后pUC19的多个克隆位点的AOX启动子。插入该多克隆位点的基因将在AOX启动子的控制下被表达。AOX转录终止子的存在保证了转录物3′端正确终止。为插入G418抗性盒，用Nde I消化和Klenow聚合酶处理pPX-2产生平头DNA，然后用碱性磷酸酶处理。用SstI从p-CR2.1TEF-KAN-CYC切下G418抗性盒，连接入pPX-2。G418抗性盒可能有二种取向。此连接产生了两个质粒，命名为pPENX-1(SEQ ID NO16)和pPENX-2(SEQ ID NO17)。此二质粒中pPENX-1和pPENX-2之间的唯一差别是相反取向的G418抗性盒。G418抗性表达盒的存在使得能用pPENX-1或pPENX-2选择转化的酵母菌。
实施例4将成熟的人肿瘤坏死因子(TNF)编码序列连接入pPENX-1和pPENX-2用PCR将EcoR I位点安置在成熟的人TNF编码序列的5’端和将Bam HI位点安置在其3′端。用于此PCR的引物序列如下TNFforE5′-CTCGAATTCACCATGGTCAGATCATCTTC-3′(SEQ ID NO18)TNFrevB5′-GAGGGATCCTCACAGGGCAATGATCC-3′(SEQ ID NO19)PCR含有1XExTaq PCR缓冲液(TaKaRa)、10ng纯化pCR2.1AOX-1作为模板、0.2mM NTPs、1μM各引物和1.25U的ExTaq聚合酶(TaKaRa)。PCR条件如下94℃2分钟，然后30轮94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟，30轮后72℃培育10分钟。PCR产物用EcoR I和Bam HI消化，连接入已用相同的二种限制性内切核酸酶消化的和用碱性磷酸酶处理的pPENX-1和pPENX-2。产生的质粒命名为pPENX1-TNF(SEQ ID NO20)和pPENX2-TNF(SEQ ID NO21)。
实施例5感受态酵母菌的制备和转化在100ml YPD中培养K.pastoris至OD600为1.0。3000g离心5分钟沉降细胞，重悬于50mi 1M山梨醇、10mM N-二(羟乙基)甘氨酸-NaOH(pH 8.3)、3％乙二醇、5％二甲基亚砜中。3000g离心5分钟沉降细胞，重悬于2ml 1M山梨醇、10mM N-二(羟乙基)甘氨酸-NaOH(pH 8.3)、3％乙二醇、5％二甲基亚砜中。用Sac I消化pPENX1-TNF和pPENX2-TNF至完全。取3微克消化的质粒与100微升感受态K.pastoris 37℃培育5分钟。将1ml 40％聚乙二醇(MW1000)、0.2M N-二(羟乙基)甘氨酸-NaOH(pH 8.3)加入转化混合物中，37℃培育1-2小时。3000g离心5分钟沉降细胞，重悬于1ml 10mM N-二(羟乙基)甘氨酸-NaOH(pH 8.3)、0.15M NaCl中。再3000g离心5分钟沉降细胞，重悬于100微升10mM N-二(羟乙基)甘氨酸-NaOH(pH 8.3)、0.15NaCl中。加入1mL YPD培育细胞30℃一小时。离心沉降细胞，重悬于100μl YPD，取100微升接种于含G418(500μg/mL)的YPD琼脂板。30℃培育该板5天。通过在含G418(500μg/mL)的YPD琼脂培养基上划线再核查所选出的菌落，证实其对G418的抗性。
实施例6在酵母菌中培养和表达TNF1.检测表达TNF的转化菌为核查TNF表达水平，在培养摇床中含20mL基础培养基(6.7g/L无氨基酸的酵母氮碱基、1％甘油、0.4μg/L生物素)的摇瓶中30℃ 250rpm培养G418抗性转化株过夜。第二天3000g离心5分钟沉降细胞，沉淀重悬于2mL含甲醇的基础培养基中。用重悬细胞接种20mL含甲醇的基础培养基使初始OD600达到0.8-1.0。30℃250rpm培养摇瓶4天。在设定的时间(至少每天)取1mL培养物样品，小离心机离心细胞冻存于-20℃直到分析TNF产量。各培养物中每天加入新的甲醇至最终浓度0.5％。重悬细胞于冷的500微升20mM Tris/Cl(pH 8.0)、40mM NaCl、1mM EDTA中。向微离心管中的各沉淀加入大约等量的400-600微米酸洗玻璃珠并振荡4分钟。离心试管5分钟，将上清液转移至一洁净试管中。用考氏兰染色SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和抗人TNF抗体作Western印染分析各上清液等份。
2.细胞高密度发酵生产TNF通过细胞高密度发酵广泛分析了摇瓶培养的转化菌显示最高水平的甲醇诱导的TNF表达。强烈旋转30℃在250mLYPD肉汤中培养转化菌1-2天，然后用于接种5升发酵罐(BioFlow 3000；New Brunswick Scientific有限公司，Edison，N.J.)。发酵罐装有矿物盐(2.3g CaSO4·2H2O，45.5g K2SO4，37.0g MgSO4·7H2O)、67mMH3PO4、10.3gKOH、100g甘油和12mL防沫剂B(J.T.Baker)。加水至体积2.5升，用30％氢氧化铵调培养基pH至5.0。用液体循环灭菌发酵罐35分钟，冷却后加入10mL微量元素。
表1
进行三期发酵甘油分批期，甘油进料期和最后甲醇诱导期。定时从发酵罐取样细胞，随后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。接种发酵罐，发酵罐运行设置30℃、pH5.0和溶氧＞30％。发酵过夜(23小时)甘油被培养物耗尽。此期获得湿细胞沉淀产量110克/升。以每升培养物56mL/小时速度进料含10mL/升微量元素的50％甘油开始甘油进料第二期。此期用掉总共500mL甘油。如甲醇开始诱导前发酵罐溶氧含量增加证实的那样，细胞消耗掉了甘油。此第二期获得湿细胞沉淀产量243克/升。以每遮1.5mL进料速度开始进料含10mL/升微时元素的100％甘油。此进料速度维持17小时，然后提高进料速度至6mL/小时/每升24小时。此进料速度维持31小时后收获细胞。获得350克/升湿细胞沉淀的最终产量。
实施例7酵母菌中生产的TNF的纯化和特征分析1.纯化酵母细胞产生的TNF生产重组TNF作为K.pastoris的可溶性(酶促活性)蛋白质。将从发酵收获的细胞沉淀重悬於20mL Tris-Cl，pH8.5，1mM EDTA中。使细胞两次通过微流体器裂解细胞，离心除去颗粒物质。产生的上清液与硫酸铵混合(30％湿重/体积)，离心再次除去不溶性物质。然后以10倍体积20mM Tris-Cl，pH8.5液透析TNF组分，使溶液通过阴离子交换柱，用20mM柠檬酸缓冲液，500mM氯化钠，pH5.0洗脱结合于阴离子交换柱的TNF。用10倍体积的10mM磷酸钠pH7.0透析该TNF组分并通过羟基磷灰石柱，TNF结合于羟基磷灰石柱。用100mM磷酸钠pH7.0液洗脱污染蛋白质，然后用200mM磷酸钠pH7.0液洗脱。
2.TNF细胞毒试验用L929细胞细胞毒试验测定从酵细胞纯化的TNF的活性。TNF-敏感的L929细胞培养在添加有10％胎牛血清的D-MEM培养基中。将0.1mL等份的L929细胞(5.0×105细胞/mL)分配到96孔微滴板(Corning，Corning，NY)的诸孔中，培养18小时，并接触不同浓度的重组TNF48小时。为测定细胞死亡程度，用0.5mg/mLMTT(93-[4，5-二甲基噻唑-2基]-2，5-溴化二苯基四唑)处理细胞4小时，除去培养基，加0.1mL二甲基亚砜裂解细胞。在微滴板读数仪上分析各块板540nm显色(MlecularDevices，Sunnyvale，CA)，如下计算对应于TNF处理组细胞的细胞死亡程度细胞死亡率＝[TNF处理细胞OD/对照细胞OD]×100从K.pastoris纯化的TNF获得的IC50为52pg/mL，相当於从大肠杆菌纯化的TNF(133pg/mL)的IC50。
实施例8TNF的分泌将酿酒酵母的α配因子的前导序列连接于pPENX1和pPENX2的EcoR I-Kpn I位点分别产生pPENX-3(SEQ ID NO22)和pPENX-4(SEQ ID NO23)。pPENX-3和pPENX-4能表达插入这些载体中的重组基因，并且宿主酵母菌细胞可分泌该重组基因产物蛋白质到培养基中。
用PCR分离酿酒酵母基因组DNA的α配因子的前导序列，该PCR的引物序列如下AfacforE5′-CTCGAATTCACCATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC-3′(SEQ IDNO24)和AfacrevK5′-GAGGGTACCCATATGAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCGAGAGATACCCCTTC-3′(SEQ ID NO25)分离α配因子前导序列的PCR反应含有1X Vent PCR缓冲液(New EnglandBiolabs)、100ng纯化的酿酒酵母基因组DNA、0.2mM dNTPs、1μM各引物和1.25U的Vent聚合酶(New England Biolabs)。PCR条件如下94℃2分钟，然后30轮94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟，30轮后72℃培育10分钟。琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物并用EcoR I和Kpn I消化。pPENX-1和pPENX-2用EcoR I和KpnI消化并用碱性磷酸酸酶处理。将α配因子前导序列连接入pPENX-1和pPENX-2，分别产生pPENX-3和pPENX-4。
用聚合酶链反应将Xho I位点置于成熟的人TNF编码序列的5’端，将Bam HI位点置于其3′端。该PCR所用的引物如下TNFforX5′-GTGCTCGAGAAAAGAGTCAGATCATCTTCTCGAACC-3(SEQ IDNO26)TNFrevB5′-GAGGGATCCTCACAGGGCAATGATCC-3′(SEQ ID NO27)此PCR反应含有1X Vent PCR缓冲液(New England Biolabs)、10ng纯化的pET-TNF作为模板、0.2mM NTPs、1μM各引物和1.25U的Vent聚合酶(NewEngland Biolabs)。PCR条件如下94℃2分钟，然后30轮94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟，30轮后72℃培育10分钟。将PCR产物亚克隆入pCR2.1(Invitrogen)中。用Xho I和Bam HI消化pCR2.1得到TNF PCR产物，连接于已用相同的二种限制性内切酸核酸酶消化的和用碱性磷酸酶处理的pPENX-4。产生的质粒命名为pPENX4-TNF。
用Sac I消化的pPENX4-TNF转化K.pastoris，接种在含G418的YPD琼脂平板上，如实施例5所述。
为检测TNF分泌水平，在培养摇床中含20mL基础培养基(6.7g/L酵母氮碱无氨基酸、1％甘油、0.4μg/L生物素)的摇瓶中30℃ 250rpm培养G418抗性转化菌株过夜。第二天取培养物样品离心沉降细胞，将上清液转移至一洁净试管中，与沉淀保存于-20℃供分析用将上清液转移至一洁净试管中，与沉淀一起保存于-20℃供分析用。淀3000g 5分钟离心培养物，细胞沉淀重悬于2mL含甲醇的基础培养基中。用重悬细胞接种20mL含甲醇的基础培养基使初始OD600达到0.8-1.0。30℃250rpm培养摇瓶4天。在设定的时间(至少每天)取1mL培养物样品，小离心机离心沉淀细胞，细胞沉淀和上清冻存于-20℃直到分析TNF产量。各培养物中每天加入新的甲醇至最终浓度0.5％。用考氏兰染色SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和抗人TNF抗体作Western印染分析各上清液样品等份。SDS-聚丙烯酰胺凝胶染色显示在甲醇诱导的样品中存在分子量大小正确的TNF蛋白质条带，其在预先诱导的样品中未能看见。用TNF特异性抗体的Western印染表明在诱导的样品中存在成熟的人TNF分子量大小正确的蛋白质条带，其在预先诱导的样品中未能看见。这些结果表明可工程改造K.pastoris使其分沁异源性重组蛋白质。
实施例9ADI在不同系统中的表达ADI在大肠杆菌中的表达1.细胞内表达为在大肠杆菌中表达ADI基因，采用表达载体pQE70(Qiagen)。pQE-70含有噬菌体的T5强启动子和二个毗邻此启动子的lac操纵子区。其结果受LacI阻抑蛋白的调节，培养基中加入IPTG可诱导ADI基因的表达。为将ADI基因插入pQE70，用PCR将SnaBI位点置于ADI编码序列的5’端，将Hind III位点置于3′端。
正向引物序列为5′-CTCTACGTATGTCTGTATTTGACAGTAAATTTAA-3′(SEQID NO28)和反向引物序列为5′-GTGAAGCTTTTACCACTTAACATCTTTACGTG-3′(SEQ IDNO29)PCR条件是94℃30秒，50℃30秒，72℃45秒，30轮。
用SphI消化pQE70，用Klenow片段处理产生平头，然后用Hind III消化和碱性磷酸酶处理。用SnaB和Hind III消化ADI PCR产物并连接入pQE70中。用EcoRI和Ava I从pBR322中切下四环素抗性基因，用Klenow处理产生平头连接入pQE70中bla(氨苄青霉素抗性)基因的Bgl I位点。Tet抗性基因的取向通过用Bam HI作限制性内切核酸酶图谱确定。产生的质粒将赋予转化大肠杆菌四环素抗性而非氨苄青霉素抗性。产生的含ADI和tet抗性基因的质粒命名为pPHX-8。
为表达ADI，在仿四环素(12.5g/mL)的LB培养基中培养含pPHX-8的大肠杆菌JM101细胞至OD600为0.5-0.8。加入最终浓度1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)以诱导ADI的表达。再细胞培养2小时，离心收获细胞。不难在SDS-PADE上看见细胞裂解液中的ADI为一47000MW蛋白质条带。ADI约占大肠杆菌产和的总细胞蛋白质的10％。大肠杆菌以无活性形式表达的重组ADI为不溶性包涵体，在粗提取物中未能测出ADI的酶活性。为获得活性酶，必须用5M的盐酸胍变性该蛋白质。将大肠杆菌细胞悬浮于10mM pH7.2的磷酸钠液中，用微流体器破碎。然后用Triton X-100和离心调细胞均浆至4％(v/v)。用含5M盐酸胍的50mM pH7.2磷酸钠液溶解产生的颗粒组分。通过用100倍体积的50mM pH7.2磷酸钠缓冲液快速稀释复性此重组ADI。用Poros HQ树脂(Perseptive Biosystems，波士顿，MA)作阴离子交换层析，以含0-1M NaCl线性梯度的10mM pH7.2磷酸钠液纯化该复性蛋白质。ADI洗脱在大约200mM NaCl处有一尖峰。此方法产生的纯化ADI比活性为19-21IU/mg蛋白。
II.周质表达将ADI的编码序列化融合于pET-22b(+)(Novagen)中的pelB前导序列，以引导ADI进入大肠杆菌的周质间隙。用PCR将Msc I和Sal I限制性内切核酸酶位点分别置于ADI编码序列的5’和3′端。用Msc I和Sal I消化此PCR产物并连接入pET-22b(+)(Novagen)。这样将ADI编码序列安置在含pelB前导序列的正确读框中。用产生的表达质粒pETADI转化BL21(DE3)以表达ADI。分离自BL21(DE3)转化菌的大多数质粒不具有如限制性图谱所确定的正确结构(用Xba I+Sal I消化应产生5393、1086和244bp片段)。少数转化菌含有的质粒根据限制性内切核酸酶消化看来具有正确的结构，将它们用于试验诱导以核实ADI表达。将转化菌在含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中37培养至OD600为0.5-0.7，此时在培养基中加入1mM最终浓度的IPTG。再培养细胞3小时，离心收获细胞。检测细胞裂解液中存在的ADI，用考马氏兰染色SDS-PAGE或Western印染未能观察到任何一株这些转化菌产生了ADI。
用pETADI表达质粒转化BL21(DE3)pLysS，后者是当用pET载体时能更紧密调节表达的菌株。此时发现转化菌含有的质粒具有正确的结构(根据限制性内切核酸酶消化)。如上所述培养转化菌和测试诱导，除了细胞培养在含氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(35μg/mL)的LB培养基中外。在细胞周质间隙中或全细胞提取物中未能测到ADI活性。被诱导转化菌提取物的Western印染上有二条免疫反应带，一条为47000(天然ADI)，第二条略高于ADI的MW(pelB前导序列仍结合于ADI)。考马氏兰染色SDS-PAGE未能显示任何ADI大小蛋白质的明显诱导，提示只产生低水平的ADI。
在巴斯德毕赤酵母中表达ADI将ADI编码序列连接入pPIC3.5的Bam HI-Sna BI位点，产生的质粒命名为pPIC3.5ADI，以Sac I线性化，用于转化巴斯德毕赤酵母GS115或KM71。接种无组氨酸的基础培养基选择组氨酸阳性转化菌。按实施例6所述对转化菌进行诱导试验并制备细胞裂解液。用抗ADI抗体作Western印染和ADI酶活性试验筛检细胞裂解液的ADI表达。Western印染显示存在47000MW的免疫反应蛋白，为ADI的正确大小。为检测ADI活性进行血尿素氮试验。ADI将精氨酸转变为瓜氨酸，与BUN试剂反应产生粉红色。为进行此酶试验，将样品与含精氨酸(10μM)的pH7.2磷酸缓冲液37℃培养10分钟。将血尿素氮试剂(BUN试剂，Sigma)加入反应中，再加热至100℃10分钟。用分光光度计(A595)测定并与瓜氨酸标准杯比较定量测定产生的瓜氨酸量。即使Western印染中所见的免疫反应性蛋白大小正确，但任何这些裂解液中没能测到ADI酶活性。
在Komagataella pastoris中表达ADI用PCR将Kpn I位点置于精氨酸脱亚胺酶(ADI)编码序列的5’端和将Bam HI位点置于其3′端。所用引物序列如下ADIforK--5′-CYCGGYACCATGGCTGTATTTGACAGTAAAT-3′(SEQ ID NO30)ADIrevB--5′-GAGGGATCCTTACCACTTAACATCTTTACG-3′(SEQ ID NO31)此PCR反应含有1X Vent PCR缓冲液(New England Biolabs)、10ng纯化的pPHX8 DNA、0.2mM NTPs、1μM各引物和1.25U的Vent聚合酶(New EnglandBiolabs)。PCR条件如下94℃2分钟，然后30轮94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟。30轮后加入1.25UTaq聚合酶(Stratagene)72℃培育10分钟。PCR产生一1250bp产物用Kpn I和Bam HI消化。用Kpn I和Bam HI 37℃消化pPENX21小时然后用牛小肠碱性磷酸酶37℃处理30分钟。将ADI PCR产物连接入pPENX-2。如实施例5所述，产生的质粒pPENX2ADI用Sac I消化后用于转化K.pastoris。如实施例6所述进行转化菌的试验诱导和制备细胞裂解液。用抗ADI抗体作Western印染和ADI酶活性试验筛检细胞裂解液的ADI表达。Western印染显示存在47000MW的免疫反应蛋白，为ADI的正确大小。为检测ADI活性进行血尿素氮试验。ADI将精氨酸转变为瓜氨酸，与BUN试剂反应产生粉红色。为进行此酶试验，将样品与含精氨酸(10μM)的pH7.2磷酸缓冲液37℃培养10分钟。将血尿素氮试剂(BUN试剂，Sigma)加入反应中，再加热至100℃10分钟。用分光光度计(A595)测定并与瓜氨酸标准杯比较，定量测定产生的瓜氨酸量。ADI酶试验表明，粗裂解液中存在活性ADI。
本文所述的各项项专利、专利申请和出版物的整体内容纳入本文参考文献中。
本领域技术人员在阅读了以上描述后会明白，除了本文所述之外可对本发明作各种修改，这些修改都属于本发明的专利保护范围之内。
序列表<110>菲尼克斯药物股份有限公司(DesigneRx Pharmaceuticals，Inc.)<120>在酵母菌中生产多肽的酵母菌表达系统、方法和相关组合物<130>PHOE-0189<150>PCT/US02/23586<151>2002-07-25<150>US 09/915,815<151>2001-07-26<160>31<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>737<212>DNA<213>Komagataella pastoris<400>1tggagctcgc tcattccaat tccctttgtt aggctactaa gaccacgact ttattagcct 60gtccattctg gttcctggcg agacttattc ttgtttgttt attttcgaat gcaacaaagc120tccgcattac atccgaacat cactttagat gagggctttc tgagtgtggg gtcgaatagt180ttcatgttcc cccaatggcc caaaactgac actttaaacg ctgtcttcga acttaatatg240gcaaaagcgt gatctcatcc aagacgaact aagtttggtt cgttgaaatg ctaacggcca300gttggtcaaa aagaaacttc caaaagtcgg catatcgttt gtcttgtttg gtattcatag360acgaatgctc aagaatattc tcattaatgc ttagcgcagt ctctgtatcg cttctggacc420ccggtgcagt tgtgccgaaa cgcaaatggg gaaacacccg cttttcggat gattatgcat480tgtctccaca ttgtatgctt ccaagattct ggtgggaata ctactgatag cctaacgttc540atgatcaata tcaaactgtt ctaaccccta cttgaactgc aatatataaa caggaggaaa600cttcccagtc gaaaaccttc tttcatcatc attattagct tactttcata attgtgactg660
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<223>PCR产物<400>6tggagctcgc tcattccaat tccctttgtt aggctactaa gaccacgact ttattagcct 60gtccattctg gttcctggcg agacttattc ttgtttgttt attttcgaat gcaacaaagc120tccgcattac atccgaacat cactttagat gagggctttc tgagtgtggg gtcgaatagt180ttcatgttcc cccaatggcc caaaactgac actttaaacg ctgtcttcga acttaatatg240gcaaaagcgt gatctcatcc aagacgaact aagtttggtt cgttgaaatg ctaacggcca300gttggtcaaa aagaaacttc caaaagtcgg catatcgttt gtcttgtttg gtattcatag360acgaatgctc aagaatattc tcattaatgc ttagcgcagt ctctgtatcg cttctggacc420ccggtgcagt tgtgccgaaa cgcaaatggg gaaacacccg cttttcggat gattatgcat480tgtctccaca ttgtatgctt ccaagattct ggtgggaata ctactgatag cctaacgttc540atgatcaata tcaaactgtt ctaaccccta cttgaactgc aatatataaa caggaggaaa600cttcccagtc gaaaaccttc tttcatcatc attattagct tactttcata attgtgactg660gttccaattg acaagctttt gattctaacg acttttaacg acaatttgag aagatcaaaa720acaactaatt attcgaaacg atggctatcc ctgaagagtt tgatatcctt gttttaggtg780gtggatccag tggatcctgt attgccggaa gattggccaa cttggaccac tccttgaaag840ttggtcttat cgaggcaggt gagaacaacc tcaacaaccc atgggtttac cttccaggta900
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<223>引物<400>8gtgactagta tgattgaaca agatgg26<210>9<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
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<213>人工序列<220>
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<223>引物<400>15cacgaattct tcgaataatt agttgttttt tg 32<210>16<211>4573<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>质粒<400>16tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca60cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180accaattccc acacaccata gcttcaaaat gtttctactc cttttttact cttccagatt 240ttctcggact ccgcgcatcg ccgtaccact tcaaaacacc caagcacagc atactaaatt 300ttccctcttt cttcctctag ggtgtcgtta attacccgta ctaaaggttt ggaaaagaaa 360aaagagaccg cctcgtttct ttttcttcgt cgaaaaaggc aataaaaatt tttatcacgt 420ttctttttct tgaaattttt ttttttagtt tttttctctt tcagtgacct ccattgatat 480ttaagttaat aaacggtctt caatttctca agtttcagtt tcatttttct tgttctatta 540caactttttt tacttcttgt tcattagaaa gaaagcatag caatctaatc taagtttact 600agtatgattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta 660ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg 720tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa 780
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<210>31<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>31gagggatcct taccacttaa catctttacg 30
权利要求
1.一种用于生产所需多肽的酵母菌表达系统，其特征在于，所述表达系统包含选自Ogataea Wickerhamii、Ogataea kodamae、Ogataea pini、Komagataella pastoris和Zygosaccharomyces pastori的酵母菌宿主细胞以及一表达载体，所述载体含有编码所需多肽的核酸分子，其中所述核酸分子操作性连接于一个或多个调节区。
2.如权利要求1所述的表达系统，其中，所述酵母菌宿主细胞是Komagataellapastoris。
3.如权利要求1所述的表达系统，其中，所述载体是质粒。
4.如权利要求1所述的表达系统，其中，所述载体还包含选自醇氧化酶基因启动子、二羟丙酮合成酶基因启动子、甲酸脱氢酶基因启动子、延伸因子1-α基因启动子、过氧化氢酶基因启动子、猿病毒40启动子、小鼠乳腺瘤病毒启动子、人免疫缺陷病毒启动子的长未端重复序列、莫洛尼病毒启动子、巨细胞病毒立即早期启动子、EB病毒启动子、罗斯肉瘤病毒启动子、人肌动蛋白启动子、人肌球蛋白启动子、人血红蛋白启动子、人肌酸启动子和人金属硫蛋白启动子。
5.如权利要求4所述的表达系统，其中，所述启动子是Komagataella pastoris醇氧化酶基因启动子。
6.如权利要求4所述的表达系统，其中，所述启动子具有SEQ ID NO1的序列。
7.如权利要求1所述的表达系统，其中，所述载体还包含转录终止子。
8.如权利要求7所述的表达系统，其中，所述转录终止子选自ios-1-细胞色素c基因转录终止子和醇氧化酶基因转录终止子。
9.如权利要求1所述的表达系统，其中，所述载体还包含编码可选标记的核酸分子。
10.如权利要求9所述的表达系统，其中，所述编码可选标记的核酸分子编码转转座子Tn5的新霉素磷酸转移酶。
11.如权利要求1所述的表达系统，其中，所需多肽是二亚胺酶。
12.如权利要求11所述的表达系统，其中，所述二亚胺酶是精氨酸二亚胺酶。
13.如权利要求1所述的表达系统，其中，所需多肽选项自酶、生长因子、细胞因子、免疫原性蛋白和免疫球蛋白。
14.如权利要求13所述的表达系统，其中，所需多肽是细胞因子。
15.如权利要求14所述的表达系统，其中，所述细胞因子是TNF。
16.如权利要求1所述的表达系统，其中，所述载体还包含甲醇同化酵母菌自主复制序列的DNA片段。
17.如权利要求1所述的表达系统，其中，所述载体还包含甲醇同化酵母菌自主复制序列的DNA片段和编码可选标记的核酸分子。
18.一种从选自Ogataea Wickerhamii、Ogataea kodamae、Ogataea pini、Komagataella pastoris和Zygosaccharomyces pastori的酵母菌宿主细胞分离所需多肽的方法，其特征在于，所述方法包括用含编码所需多肽的核酸分子的表达载体转化所述酵母菌宿主细胞，培养扩增所述转化的酵母菌宿主细胞，并从所述培养物中分离所述需要的多肽。
19.如权利要求18所述的表达系统，其中，所述酵母菌宿主细胞是Komagataellapastoris。
20.如权利要求18所述的表达系统，其中，所述载体还包含编码可选标记的核酸分子。
21.如权利要求18所述的表达系统，其中，所述载体是质粒。
22.如权利要求18所述的表达系统，其中，所述载体是病毒颗粒。
23.如权利要求22所述的表达系统，其中，所述载体选自腺病毒、杆状病毒、细小病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒、腺相关病毒、Semliki森林病毒、痘苗病毒和逆转录病毒。
24.如权利要求18所述的方法，其中，所述核酸分子操作性连接于选自醇氧化酶基因启动子、二羟丙酮合成酶基因启动子、甲酸脱氢酶基因启动子、延伸因子1-α基因启动子、过氧化氢酶基因启动子、猿病毒40启动子、小鼠乳腺瘤病毒启动子、人免疫缺陷病毒启动子的长未端重复序列、莫洛尼病毒启动子、巨细胞病毒立即早期启动子、EB病毒启动子、罗斯肉瘤病毒启动子、人肌动蛋白启动子、人肌球蛋白启动子、人血红蛋白启动子、人肌酸启动子和人金属硫蛋白启动子的启动子。
25.如权利要求18所述的方法，其中，所述酵母菌宿主细胞被裂解并从所述酵母菌宿主细胞的裂解液中回收所述需要的多肽。
26.如权利要求18所述的方法，其中，通过纯化培养基而不是裂解所述酵母菌宿主细胞回收所述需要的多肽。
27.按权利要求18制造的分离的多肽。
28.一种具有启动活性的分离的核酸分子，其特征在于，所述分子具有SEQ IDNO1的核苷酸序列。
29.如权利要求28所述的分离的核酸分子，其具有SEQ ID NO1的约200-800个核苷酸并具有启动子活性。
30.一种具有启动活性的分离的核酸分子，其特征在于，该分子能在严谨条件下结合于SEQ ID NO1的互补序列。
31.如权利要求28所述的分离的启动子，其中，所述分离的启动子操作性连接于编码所需多肽的核酸分子。
32.一种在选自Ogataea Wickerhamii、Ogataea kodamae、Ogataea pini、Komagataella pastoris和Zygosaccharomyces pastori的酵母菌宿主细胞中表达所需多肽的方法，其特征在于，所述方法包括用载体转化所述酵母菌宿主细胞，所述载体含油Komagataella pastoris醇氧化酶基因启动子和编码所需多肽的核酸序列分子。
33.如权利要求32所述的方法，其中，所述酵母菌宿主细胞是Komagataellapastoris。
34.如权利要求32所述的方法，其中，所述启动子含有SEQ ID NO1的核酸分子。
35.一种表达载体，其特征在于，所述载体含有与编码所需多肽的核酸分子操作性相连的如权利要求28所述分离的启动子。
36.一种生产所需多肽的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤a)将权利要求35所述的表达载体导入选自Ogataea Wickerhamii、Ogataeakodamae、Ogataea pini、Komagataella pastoris和Zygosaccharomyces pastori的酵母菌宿主细胞；b)在表达所述需要多肽的条件下培养所述酵母菌宿主细胞；和c)回收所述需要的多肽。
37.如权利要求36所述的方法，其中，所述宿主细胞是Komagataella pastoris。
38.如权利要求36所述的方法，其中，所述酵母菌宿主细胞被裂解并从所述酵母菌宿主细胞的裂解液中回收所述需要的多肽。
39.如权利要求36所述的方法，其中，通过纯化培养液而不是裂解所述酵母菌宿主细胞回收所述多肽。
全文摘要
本发明提供在某些酵母菌株中生产所需多肽的新的表达系统。本发明还提供此表达系统生产多肽产品的方法。本发明还提供与此相关的组合物。
文档编号C12N1/19GK1556858SQ02818505
公开日2004年12月22日 申请日期2002年7月25日 优先权日2001年7月26日
发明者M·A·克拉克, M A 克拉克 申请人:德瑞新药研发股份有限公司