专利名称：微生物催化法生产丙烯酰胺的制作方法
技术领域：
本发明属微生物技术领域。具体涉及一种微生物催化法生产丙烯酰胺。
背景技术：
丙烯酰胺是一种用途广泛的有机化工原料。
1964年美国的氰氨公司首先开发了硫酸水合法生产丙烯酰胺的技术，实现了丙烯酰胺的工业化生产。但该技术存在工艺复杂、产品精制困难、环境污染严重等问题。70年代初日本和美国同时开发了以铜为主的各类催化水合方法来生产丙烯酰胺，它和硫酸法相比有不少优点，产品纯度、转化率都有较大提高，环境污染少，成本低。
1985年，日本日东公司采用日本京都大学山田研究室的成果，建造了世界上第一个微生物法生产丙烯酰胺的工业性试验装置。上海市农药研究所也在1986年从泰山的土壤中找到了一株产腈水合酶的菌株，并开始了微生物法生产丙烯酰胺的研究。微生物法较铜催化法具有较大优势，在整个生产工艺中微生物法可省去丙烯腈回收工段和铜分离工段，而且反应在常温常压下进行，降低了能耗，提高了生产过程的安全性，丙烯腈的转化率可达99.99％，几乎没有副产物。
发明内容
本发明所属解决的技术问题在于克服上述不足之处，设计一种应用微生物技术制备丙烯酰胺的方法。
本发明提供了一种微生物催化法生产丙烯酰胺的方法，该方法是通过发酵生产含有腈水合酶的丙酸棒杆菌或其诱变菌株细胞，在一定条件下用游离细胞法或者固定化细胞法催化丙烯腈水合成丙烯酰胺，而后通过较为简单的后处理获得高纯度的丙烯酰胺产品。
本发明的具体实施方式
如下
(1)产酶细胞的制备先进行发酵种子的培养，在三角瓶或种子罐中装入适量的种子培养基(10-70％)，灭菌后接入一定量的菌种(1-10％)，在20-40℃下，旋转式摇床中(100-400rpm)振荡培养30-120小时，或者用50L-2M3的种子罐，实罐灭菌后接入斜面种子，空气通量在1∶0.2-1∶1(V.V.M)，搅拌速度为10-400rpm，罐压保持在0.03-0.06mPa，温度为20-40℃，培养30-200小时。然后在50L-20m3的发酵罐其发酵培养基装入量为40％-70％，实罐消毒后接入2-7％的种子液，在通气量1∶0.2-1∶1(V.V.M)；搅拌转速50-400rpm；罐压0.03-0.06MP；温度20-40℃。发酵30-200小时；种子培养基组成0.5-2％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.05-0.15％Nacl，0.05-0.3％K2HPO4，0.01-0.03％MgSo4，尿素0.1-1％，PH7.0-7.5；发酵培养基1-2.5％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.1-2％尿素，0.03-0.1％K2HPO4，0.03-0.1％KH2PO4，0.03-0.1％MgSO4，2-20ppmCoCl2，味精0.04-0.2％，PH6.5-7.5；(2)细胞固定化工艺将发酵液离心去上清，与海藻酸钠溶液配制成含菌量为10-35％，海藻酸钠为0.5-4％的均匀浆料，经造粒器滴入0.1-0.5M的氯化钙溶液，在低温下经24小时固化后，用蒸馏水清洗2-4次，即成固定化细胞，直径约1-5mm，在4℃下低温了冷藏保存；(3)游离细胞催化水合生产过程将发酵液在分离因素≥3000，离心分离，去上清液，将细胞悬浮于去离子水或者纯净水或PH7.0-8.0的缓冲液中，发酵液与反应液的比例维持在≥1％，在5-55℃的温度下，50-300rpm的搅拌速度下进行酶催化反应，反应过程中，通过流加丙烯腈使底物浓度控制在0.001％-10％，经过1-24h的反应，获得浓度在10％以上的丙烯酰胺溶液。它的产物溶液累积到一定浓度后(≥10％)一次性出罐，最终转化率为≥99％，溶液中丙烯酸、丙烯醛浓度≤0.0001％；
(4)固定化细胞催化水合生产过程将获得的固定化细胞加入到去离子水或者纯净水或PH7.0-8.0的缓冲液中，固定化细胞和水溶液的比例维持在≥1％，在5-55℃的温度下，50-300rpm的搅拌速度下进行酶催化反应，反应过程中，通过流加丙烯腈使底物浓度控制在0.001％-10％，经过1-24h的反应，获得浓度在10％以上的丙烯酰胺溶液。它的产物溶液累积到一定浓度后(≥10％)一次性出罐，最终转化率为≥99％，溶液中丙烯酸、丙烯醛浓度≤0.0001％。
本发明使用丙酸棒杆菌及其诱变菌种产生的腈水合酶将丙烯腈转化成丙烯酰胺，其操作过程简单、反应条件温和、减少环境污染，且分离提纯简单，产品纯度高。
本发明与现有技术相比具有下列特点现有技术用于催化腈成酰胺的菌株主要是红球菌属的细菌，本发明采用的是丙酸棒杆菌及其经诱变的菌种。该菌种由本所在含腈的土壤中分离获得，经初步鉴定为丙酸棒杆菌。该菌株已于2003年1月23日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记入册编号为CGMCC No.0886.本菌株的分类命名为接近棒杆菌Corynebacterium propinguum。该菌株产酶能力强，在本发明的发酵条件下能获得较高的生物量，最高可达40毫克/毫升发酵液，因而其单位体积发酵液的总酶活也较高，最高可达2400万单位/毫升发酵液。(注酶活单位定义，在一小时里将1微克的丙烯腈转化为丙烯酰胺的酶量，单位微克/小时)。
具体实施例方式实施例1、在1m3的种子罐中加入60％的培养基，实罐消毒后，接入1茄子瓶的斜面菌种，发酵前期的通气量为1∶0.3，搅拌速度为50rpm，后期的通气量为1∶0.5，搅拌速度为100rpm，罐压0.05mp，温度28℃，培养50小时。
在10m3的发酵罐中加入60％的发酵培养基，实罐消毒后接入5％的种子液，在通气量1∶0.5(V.V.M)；罐压0.05MP；搅拌转速前期180rpm，后期100rpm；温度28℃。发酵60小时。
种子培养基组成0.6％葡萄糖，0.4％酵母膏，0.05％K2HPO4，0.05％MgSo4，0.05％KH2PO4，尿素0.1％，PH7.2发酵培养基2.1％葡萄糖， 0.4％酵母膏，0.9％尿素，0.05％K2HPO4，0.05％KH2PO4，0.1％MgSO4，10ppm CoCl2，味精0.075％，PH7.5实施例2、将1吨发酵液在分离因素为3500，离心分离。去上清液，获得约150kg(湿重)的细胞。将细胞悬浮于去离子水中，发酵液与反应液体积的比例维持在5％(v/v)。在20℃的温度下，80rpm的搅拌速度下进行酶催化反应。通过流加丙烯腈使底物浓度维持在0.1％左右。在反应的收尾阶段，不再补加底物从而使底物浓度逐渐降低，趋向于零。反应结束后，得到的丙烯酰胺溶液浓度为32％(w/v)，转化率为99.99％。
实施例3、将1吨发酵液在分离因素为3500，离心分离。去上清液，获得约150kg(湿重)的细胞。将细胞和海藻酸钠混合配制成含菌量22％，海藻酸钠2％的均匀浆料。经造粒器滴入0.2M氯化钙溶液，在4℃下保温24小时，而后用蒸馏水洗涤两次，去除残留的氯化钙，4℃低温冷藏保存。
实施例4、将获得的固定化细胞加入去离子水中，固定化细胞与去离子水的比例维持在3.6％。在20℃的温度下，80rpm的搅拌速度下进行酶催化反应。通过流加丙烯腈使底物浓度维持在0.1％左右。在反应的收尾阶段，不再补加底物从而使底物浓度逐渐降低，趋向于零。反应结束后，得到的丙烯酰胺溶液浓度为32％(w/v)，转化率为99.99％。
权利要求
1.一种微生物催化法生产丙烯酰胺的方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)产酶细胞的制备先进行发酵种子的培养，在三角瓶或种子罐中装入10-70％的种子培养基，灭菌后接入1-10％的菌种，在20-40℃下，旋转式摇床中，100-400rpm，振荡培养30-120小时，或者用50L-2M3的种子罐，实罐灭菌后接入斜面种子，空气通量在1∶0.2-1∶1，V.V.M，搅拌速度为10-400rpm，罐压保持在0.03-0.06mPa，温度为20-40℃，培养30-200小时，然后在50L-20m3的发酵罐其发酵培养基装入量为40％-70％，实罐消毒后接入2-7％的种子液，在通气量1∶0.2-1∶1，V.V.M；搅拌转速50-400rpm；罐压0.03-0.06MP；温度20-40℃，发酵30-200小时；种子培养基组成0.5-2％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.05-0.15％Nacl，0.05-0.3％K2HPO4，0.01-0.03％MgSo4，尿素0.1-1％，PH7.0-7.5；发酵培养基1-2.5％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.1-2％尿素，0.03-0.1％K2HPO4，0.03-0.1％KH2PO4，0.03-0.1％MgSO4，2-20ppmCoCl2，味精0.04-0.2％，PH6.5-7.5；(2)游离细胞催化水合生产过程将发酵液在分离因素≥3000，离心分离，去上清液，将细胞悬浮于去离子水或者纯净水或PH7.0-8.0的缓冲液中，发酵液与反应液的比例维持在≥1％，在5-55℃的温度下，50-300rpm的搅拌速度下进行酶催化反应，反应过程中，通过流加丙烯腈使底物浓度控制在0.001％-10％，经过1-24h的反应，获得浓度在10％以上的丙烯酰胺溶液，它的产物溶液累积到一定浓度后，≥10％，一次性出罐，最终转化率为≥99％，溶液中丙烯酸、丙烯醛浓度≤0.0001％。
2.一种微生物催化法生产丙烯酰胺的方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)产酶细胞的制备先进行发酵种子的培养，在三角瓶或种子罐中装入10-70％的种子培养基，灭菌后接入1-10％的菌种，在20-40℃下，旋转式摇床中，100-400rpm，振荡培养30-120小时，或者用50L-2M3的种子罐，实罐灭菌后接入斜面种子，空气通量在1∶0.2-1∶1，V.V.M，搅拌速度为10-400rpm，罐压保持在0.03-0.06mPa，温度为20-40℃，培养30-200小时，然后在50L-20m3的发酵罐其发酵培养基装入量为40％-70％，实罐消毒后接入2-7％的种子液，在通气量1∶0.2-1∶1，V.V.M；搅拌转速50-400rpm；罐压0.03-0.06MP；温度20-40℃，发酵30-200小时；种子培养基组成0.5-2％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.05-0.15％Nacl，0.05-0.3％K2HPO4，0.01-0.03％MgSo4，尿素0.1-1％，PH7.0-7.5；发酵培养基1-2.5％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.1-2％尿素，0.03-0.1％K2HPO4，0.03-0.1％KH2PO4，0.03-0.1％MgSO4，2-20ppm CoCl2，味精0.04-0.2％，PH6.5-7.5；(2)细胞固定化工艺将发酵液离心去上清，与海藻酸钠溶液配制成含菌量为10-35％，海藻酸钠为0.5-4％的均匀浆料，经造粒器滴入0.1-0.5M的氯化钙溶液，在低温下经24小时固化后，用蒸馏水清洗2-4次，即成固定化细胞，直径约1-5mm，在4℃下低温了冷藏保存；(3)固定化细胞催化水合生产过程将获得的固定化细胞加入到去离子水或者纯净水或PH7.0-8.0的缓冲液中，固定化细胞和水溶液的比例维持在≥1％，在5-55℃的温度下，50-300rpm的搅拌速度下进行酶催化反应，反应过程中，通过流加丙烯腈使底物浓度控制在0.001％-10％，经过1-24h的反应，获得浓度在10％以上的丙烯酰胺溶液，它的产物溶液累积到一定浓度后，≥10％，一次性出罐，最终转化率为≥99％，溶液中丙烯酸、丙烯醛浓度≤0.0001％。
3.一种丙酸棒杆菌，其特征在于该菌株的分类命名为接近棒杆菌，Corynebacterium propinguum，保藏登记入册编号为CGMCC No.0886。
全文摘要
本发明属微生物技术领域。本发明提供了一种微生物催化法生产丙烯酰胺的方法。本发明的方法通过发酵生产含有腈水合酶的丙酸棒杆菌或其诱变株细胞，然后用游离细胞法或固定化细胞法催化丙烯腈水合成丙烯酰胺，经后处理得高纯度的丙烯酰胺产品。
文档编号C12P13/00GK1524962SQ0311553
公开日2004年9月1日 申请日期2003年2月27日 优先权日2003年2月27日
发明者薛建萍, 沈寅初 申请人:上海市农药研究所, 沈寅初, 薛建萍