专利名称：微生物连续催化法生产丙烯酰胺的制作方法
技术领域：
本发明属微生物技术领域。具体涉及一种微生物连续催化法生产丙烯酰胺。
背景技术：
丙烯酰胺是一种用途广泛的有机化工原料。
目前生物催化法生产丙烯酰胺主要是采用游离细胞或固定化细胞间歇式生产方法，这些方法均存在生产效率较低、工人的劳动强度较高特别是生物酶催化剂和设备的利用率较低等缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，设计一种便于产业化的生产方法。
本发明提供了一种微生物连续催化法生产丙烯酰胺的方法，该方法是通过发酵生产含有腈水合酶的丙酸棒杆菌或其诱变菌株细胞，在一定条件下用游离细胞连续法催化丙烯腈水合成丙烯酰胺，而后通过较为简单的后处理获得高纯度的丙烯酰胺产品。
本发明的具体实施方式
如下(1)产酶细胞的制备先进行发酵种子的培养，在三角瓶或种子罐中装入适量的种子培养基(10-70％)，灭菌后接入菌种(1-10％)，在20-40℃下，旋转式摇床中(100-400rpm)振荡培养30-120小时，然后在50L-20m3的发酵罐其发酵培养基装入量为40％-70％，实罐消毒后接入2-7％的种子液，在通气量1∶0.2-1∶1(V.V.M)；搅拌转速50-400rpm；罐压0.03-0.06MP；温度20-40℃，发酵30-200小时；种子培养基组成0.5-2％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.05-0.15％Nacl，0.05-0.3％K2HPO4，0.01-0.03％MgSo4，尿素0.1-1％，PH7.0-7.5；
发酵培养基1-2.5％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.1-2％尿素，0.03-0.1％K2HPO4，0.03-0.1％KH2PO4，0.03-0.1％MgSO4，2-20ppmCoCl2，PH6.5-7.5；(2)连续催化水合生产过程将发酵液在分离因素≥3000，离心分离，去上清液，获得产腈水合酶细胞；将细胞悬浮于去离子水或者纯净水或PH7.0-8.0的缓冲液中，加入到反应釜中，发酵液与反应液体积的比例维持在≥1％。在5-55℃的温度下，50-300rpm的搅拌速度下进行酶催化反应。当产物浓度≥5％时，开始通过膜过滤系统出产物，同时开始补加丙烯腈和水，该类膜过滤系统让产物通过，并达到去除蛋白质及其它杂质，而能使游离细胞重新返回反应釜参与反应。通过调节丙烯腈和水的流加速度和产物丙烯酰胺溶液的流出速度，从而使流出的产物丙烯酰胺溶液浓度保持在设定的范围，底物丙烯腈的浓度最低可小于30ppm，最终转化率为≥99.9％；本发明使用丙酸棒杆菌及其诱变菌种产生的腈水合酶将丙烯腈转化成丙烯酰胺，其操作过程简单、反应条件温和、减少环境污染，且分离提纯简单，产品纯度高。
本发明与现有技术相比具有下列特点1)现有技术用于催化腈成酰胺的菌株主要是红球菌属的细菌，本发明采用的是丙酸棒杆菌及其经诱变的菌种。该菌种由本所含腈的土壤中分离获得，经初步鉴定为丙酸棒杆菌。该菌株已于2003年1月23日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记入册编号为CGMCC No.0886.本菌株的分类命名为接近棒杆菌Corynebacterium propinguum。该菌株产酶能力强，在本发明的发酵条件下能获得较高的生物量，最高可达40毫克/毫升发酵液，因而其单位体积发酵液的总酶活也较高，最高可达1000万单位/毫升发酵液。(注酶活定义，在一小时里将1微克的丙烯腈转化为丙烯酰胺的酶量，单位微克/小时)。
2)本发明的催化水合使用的工艺是游离细胞膜分离连续反应。与传统的批式反应相比，连续反应大大提高了生产效率，减轻了劳动强度，提高了生物酶催化剂及设备的利用率；同时本发明相对固定化细胞生产，减少了工艺流程，减少了三废，降低了生产成本，生产过程中减少了传质阻力提高了生产效率。
具体实施例方式实施例1、在1m3的种子罐中加入60％的培养基，实罐消毒后，接入1茄子瓶的斜面菌种，发酵前期的通气量为1∶0.3，搅拌速度为50rpm，后期的通气量为1∶0.5，搅拌速度为100rpm，罐压0.05mp，温度28℃，培养50小时。
在10m3的发酵罐中加入60％的发酵培养基，实罐消毒后接入5％的种子液，在通气量1∶0.5(V.V.M)；罐压0.05MP；搅拌转速前期180rpm，后期100rpm；温度28℃。发酵60小时。
种子培养基组成0.6％葡萄糖，0.4％酵母膏，0.05％K2HPO4，0.05％MgSo4，0.05％KH2PO4，PH7.2发酵培养基2.1％葡萄糖，0.4％酵母膏，0.9％尿素，0.05％K2HPO4，0.05％KH2PO4，0.1％MgSO4，10ppm CoCl2，PH7.5实施例2、将1吨发酵液在分离因素为3500时，离心分离。去上清液，获得产腈水合酶的细胞。将细胞悬浮于去离子水溶液中，发酵液与反应液体积的比例是15％。在20℃的温度下，80rpm的搅拌速度下进行酶催化反应。丙烯腈以2.0M3/小时的流加速度流加一小时，一小时后丙烯酰胺的浓度达到25％，而后产物丙烯酰胺溶液(约25％)以2.0M3/h的速度通过膜过滤系统，进入分离纯化工艺，同时18.5％的丙烯腈溶液以2.1M3/h的速度流加进入连续式反应罐。96小时后终止反应，共有48吨的丙烯腈转化为丙烯酰胺，转化率为≥99％。
权利要求
1.一种微生物连续催化法生产丙烯酰胺的方法，其特征在于该方法，包括下列步骤(1)产酶细胞的制备先进行发酵种子的培养，在三角瓶或种子罐中装入10-70％的种子培养基，灭菌后接入1-10％菌种，在20-40℃下，旋转式摇床中100-400rpm，振荡培养30-120小时，然后在50L-20m3的发酵罐其发酵培养基装入量为40％-70％，实罐消毒后接入2-7％的种子液，在通气量1∶0.2-1∶1，V.V.M；搅拌转速50-400rpm；罐压0.03-0.06MP；温度20-40℃，发酵30-200小时；(2)连续催化水合生产过程将发酵液在分离因素≥3000，离心分离，去上清液，获得产腈水合酶细胞；将细胞悬浮于去离子水或者纯净水或PH7.0-8.0的缓冲液中，加入到反应釜中，发酵液与反应液体积的比例维持在≥1％，在5-55℃的温度下，50-300rpm的搅拌速度下进行酶催化反应，当产物浓度≥5％时，开始通过膜过滤系统出产物，同时开始补加丙烯腈和水，该类膜过滤系统让产物通过，并达到去除蛋白质及其它杂质，而能使游离细胞重新返回反应釜参与反应，通过调节丙烯腈和水的流加速度和产物丙烯酰胺溶液的流出速度，从而使流出的产物丙烯酰胺溶液浓度保持在设定的范围，底物丙烯腈的浓度最低可小于30ppm，最终转化率为≥99.9％。
2.根据权利要求1所述的一种微生物连续催化法生产丙烯酰胺的方法，其特征在于其中所述的步骤(1)产酶细胞的制备中，种子培养基组成0.5-2％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.05-0.15％Nacl，0.05-0.3％K2HPO4，0.01-0.03％MgSo4，尿素0.1-1％，PH7.0-7.5；发酵培养基1-2.5％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.1-2％尿素，0.03-0.1％K2HPO4，0.03-0.1％KH2PO4，0.03-0.1％MgSO4，2-20ppmCoCl2，PH6.5-7.5。
3.一种丙酸棒杆菌，其特征在于该菌株的分类命名为接近棒杆菌，Corynebacterium propinguum，保藏登记入册编号为CGMCC No.0886。
全文摘要
本发明属微生物技术领域。本发明公开了一种微生物连续催化法，生产丙烯酰胺。本发明应用丙酸棒杆菌，并实施游离细胞分离连续反应，提高生产效率、减少环境污染、降低成本，产品纯度高，宜于规模生产。
文档编号C12P13/00GK1524961SQ0311553
公开日2004年9月1日 申请日期2003年2月27日 优先权日2003年2月27日
发明者薛建萍, 沈寅初, 李还宝, 夏春良 申请人:上海双建生化技术发展有限公司, 薛建萍, 沈寅初