专利名称：乙肝基因的植物表达载体质粒、乙肝基因转基因细胞系及其工业化生产应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物转基因技术领域。更具体地，本发明涉及构建表达乙型肝炎病毒表面抗原的转基因人参愈伤组织细胞系，获得乙型肝炎病毒表面抗原，将其用于乙肝疫苗的制备。
背景技术：
乙型肝炎是目前我国流行最广泛、危害最严重的传染病之一。目前全球乙肝携带者大约有3.5亿人，我国乙肝携带者就有1.2亿以上，且有3000万慢性乙型肝炎的现症患者在社会上流动，每年有200多万例的急性肝炎发生，每年因肝病死亡的人数约35万，其中一半是原发性肝癌。严重地影响了我国的社会稳定及国民经济的发展。
防止乙肝病毒感染仍将取决于疫苗的有效作用。乙肝疫苗在我国的普种是非常必要的，乙肝疫苗的需求量极大。但是，我国现有的生产能力因表达系统(CHO苗及酵母苗)限制表达量低，远远满足不了社会需求(每年有3000万支的市场份额空缺)，亟需寻求一种全新的表达系统。
随着植物组织和细胞的培养技术，尤其是植物细胞的悬浮培养技术的发展，通过规模化发酵培养植物组织细胞的技术平台，显示出十分广阔的发展前景。
通过人参愈伤组织细胞的工业化发酵培养，规模化生产新型乙肝基因工程疫苗，这在表达量大幅提高、简化产品的后期提纯制备工艺、开发新的优秀剂型、产品的安全性、降低生产成本等诸多方面体现出极大的技术优势。转基因植物组织细胞作为生物反应器具有广阔的应用前景。本发明首先在该领域获得了突破，为利用组织培养人参愈伤组织细胞表达和生产医用重组蛋白提供我国独有的技术平台。这在产品的安全性、简化产品的后期提纯制备工艺、开发新的优秀剂型、降低生产成本等诸多方面体现出极大的技术优势。
发明内容
本发明涉及一种包含乙型肝炎病毒表面抗原基因的基因构建体，其中在所述乙肝病毒表面抗原基因的5’端组装了能使其在植物细胞中高效表达的启动子，在所述乙肝病毒表面抗原基因的3’端组装了增强表达的终止子。优选所述启动子为CaMV 35S启动子。优选所述终止子为nos终止子。本发明的基因构建体可以用于在植物细胞中表达乙型肝炎病毒表面抗原。
本发明还涉及含有上述基因构建体的转基因植物细胞系。特别是，本发明涉及转基因人参细胞系，优选所述人参细胞来自人参愈伤组织。在一个优选实施方案中，本发明的转基因植物细胞系还包含一种筛选标记，优选该标记是NPT II，这种标记可用于原核细胞卡那霉素筛选和真核细胞卡那霉素、新霉素、G418筛选。
本发明还涉及制备本发明转基因植物细胞系的方法，包括1)将本发明的含有乙肝病毒表面抗原基因的构建体或载体引入植物细胞；和2)使所述植物细胞表达乙肝病毒表面抗原蛋白。
在一个实施方案中，乙肝病毒表面抗原基因利用包含乙肝病毒表面抗原基因的载体引入植物细胞。在这种载体中，乙肝病毒表面抗原基因的5’端组装了能使该基因在植物细胞中高效表达的启动子，优选为CaMV 35S启动子；而乙肝病毒表面抗原基因的3’端组装了增强表达的终止子，优选为nos终止子。所述载体特别优选pBIBSa或pBIBSb。
本发明的构建体或载体可通过诸如农杆菌感染法、基因枪法、花粉导入法、病毒介导法、PEG介导法、电击诱导法、显微注射法、激光转化法、超声波转化法、或脂质体转化法等方法引入植物细胞。优选地，在制备本发明的转基因植物细胞系的方法中，通过用携带乙肝病毒表面抗原基因的农杆菌感染植物细胞，从而引入乙肝病毒表面抗原基因。更优选所述乙肝病毒表面抗原基因通过上述构建体或载体引入农杆菌，再用农杆菌感染植物细胞来引入到植物细胞中。在本发明的一个实施方案中，所述农杆菌感染通过将植物细胞的悬浮细胞与农杆菌共培养来进行。进行农杆菌感染时，可通过酚类化合物来诱导激活农杆菌Vir区基因，以便增强农杆菌的转化效率。所述酚类化合物选自儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、原儿茶酸、草香醛、乙酰丁香酮、或羟基乙酰丁香酮，特别优选乙酰丁香酮(AS)。
本发明的转基因植物细胞系可用于制备乙肝病毒表面抗原蛋白，进而用于制备乙肝疫苗。
本发明还涉及一种表达乙肝病毒表面抗原蛋白的植物细胞表达系统，其中所述细胞包含一种构建体，该构建体包含乙肝病毒表面抗原基因、能使该基因在植物细胞中高效表达的启动子、以及能增强该基因表达的终止子。优选所述启动子为CaMV 35S启动子；还优选所述终止子为nos终止子。在本发明的表达系统中，还可包含一种筛选标记，优选为NPT II，这种标记可用于原核细胞卡那霉素筛选和真核细胞卡那霉素、新霉素、G418筛选。这种标记也可以包含在本发明的构建体中。优选本发明的植物表达系统是人参的表达系统。特别优选是来源于人参愈伤组织的表达系统。
本发明还涉及制备上述表达系统的方法，包括1)将本发明的包含乙肝病毒表面抗原基因、能使该基因在植物细胞中高效表达的启动子、以及能增强该基因表达的终止子的构建体引入所述表达系统；和2)使所述表达系统表达乙肝病毒表面抗原蛋白。
其中所述启动子优选为CaMV 35S启动子，所述终止子优选为nos终止子。
在本发明的一个具体实施方案中，所述构建体包含在载体中，优选所述载体是pBIBSa或pBIBSb。
可通过农杆菌感染法、基因枪法、花粉导入法、病毒介导法、PEG介导法、电击诱导法、显微注射法、激光转化法、超声波转化法、或脂质体转化法将上述构建体或载体引入植物细胞，优选农杆菌感染法。
或者，可将本发明的上述构建体直接引入农杆菌中，并借助农杆菌引入所述表达系统。
无论是借助载体，或者是通过直接引入农杆菌的方式将本发明的构建体引入植物细胞，都可通过将悬浮的植物细胞与农杆菌共培养的方式来实现。在此过程中，可通过酚类化合物来诱导激活农杆菌Vir区基因，以便增强农杆菌的转化效率。所述酚类化合物选自儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、原儿茶酸、草香醛、乙酰丁香酮、或羟基乙酰丁香酮，优选为乙酰丁香酮(AS)。
本发明的上述表达系统优选源自人参，更优选源自人参愈伤组织。这种表达系统可用于制备乙肝病毒表面抗原蛋白，进而用于制备乙肝病毒疫苗。
因此，本发明涉及植物细胞表达载体质粒的构建，增强基因转化效率的方法，转基因细胞系的筛选建立以及开发应用。
成功的基因转化依赖于良好的植物受体系统的建立。具体条件如下1.用于植物基因转化的受体细胞，必须易于再生，有很高的再生频率，并且具有良好的稳定性和重复性；2.植物受体系统应有较高的遗传稳定性，接受外源DNA后应不影响其分裂和分化，并且能够稳定地将外源基因遗传给后代，保持遗传的稳定性；3.要建立一个高产的组织培养再生系统并能应用于基因转化，还需要稳定的受体细胞来源。植物基因转化的频率很低，需要多次反复实验，所以受体细胞应容易得到并且可以大量提供；4.一般通过抗生素抗性筛选来淘汰非转化细胞或植株，所以必须选择对抗生素敏感的非转化细胞作为受体细胞；5.可利用农杆菌为载体介导植物的基因转化，但这种方法具有宿主范围的局限性。不同的植物甚至同一植物的不同组织细胞对农杆菌侵染的敏感性也有差异，所以在选择农杆菌转化系统前必须测试受体系统对农杆菌侵染的敏感性。
此外建立一种植物基因转化的受体系统还应注意到是否具有经济价值或潜在的生产应用价值。为此，在本发明的一个实施方案中，构建了乙肝病毒表面抗原植物细胞表达载体以及用该载体转化的乙肝病毒表面抗原转基因人参愈伤组织细胞系。
本发明用乙肝病毒表面抗原基因替换植物细胞表达载体pBI121质粒中的GUS基因，构建成pBIBS载体质粒。将该载体导入农杆菌LBA4404感受态细胞中，利用农杆菌感染人参愈伤组织细胞，进而将pBIBS载体质粒导入植物细胞，利用NPTII基因表达产物在G418筛选培养基上获得抗性细胞株。提取抗性细胞株内染色体鉴定乙肝病毒表面抗原基因整合情况。提取抗性细胞株内蛋白质，鉴定乙肝病毒表面抗原表达情况。
pBI121质粒中GUS基因5’端和CaMV35S启动子之间有Xba I、BamH I和Sma I三个酶切位点可以利用，在GUS基因3’端和nos终止子之间有Sst I一个酶切位点可以利用。在乙肝病毒表面抗原基因序列中含有Xba I和BamH I酶切位点，所以在pBIBS构建过程中只能选择5’端Sma I位点和3’端Sst I位点。由于Sma I的碱基序列是CCCGGG，GC含量过高影响PCR扩增的特异性。利用Sma I位点的粘末端特点，可以解决这一问题。本发明在5’端引物设计时用其它的酶切位点替代Sma I位点。可以直接引入平滑末端位点与Sma I酶切消化后进行连接；可以引入粘性末端位点，用绿豆核酸酶或T4DNA聚合酶作用造成平滑末端再与Sma I酶切消化后进行连接；还可以引入粘性末端位点后，将其导入中间载体，利用中间载体上的平滑末端位点进行连接反应。
pBIBS质粒保留了pBI121质粒上的NPT II(新霉素磷酸转移酶基因)基因，该基因是植物基因转化中最广泛应用的选择标记，它编码的产物对卡那霉素、新霉素和G418等氨基糖苷类抗生素具有抗性。其中某些原核细胞和真核细胞对卡那霉素较敏感，新霉素和G418只对真核细胞起作用。pBIBS质粒的NPT II基因编码产物的特性使该载体可以在大肠杆菌、农杆菌以及植物细胞的筛选中广泛应用。
大肠杆菌XL-I blue不具有卡那霉素抗性，在转化pBIBS载体质粒后，获得了卡那霉素抗性，可以在载体构建过程中筛选抗性克隆。农杆菌LBA4404不具有卡那霉素抗性，在转化pBIBS载体质粒后，使其获得了卡那霉素抗性，能够在卡那霉素抗性培养基中生长，以筛选携带抗性质粒的农杆菌。人参愈伤组织细胞不具有卡那抗性和G418抗性，感染携带抗性质粒的农杆菌后，能够在卡那抗性或G418抗性培养基上生长，以筛选转基因人参愈伤组织细胞。
一些植物中常见的酚类化合物可以诱导激活农杆菌Vir区基因，从而增强农杆菌的转化效率。这类化合物包括儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、原儿茶酸、草香醛、乙酰丁香酮(AS)、或羟基乙酰丁香酮。其中诱导效果最佳的是乙酰丁香酮。本发明在农杆菌预培养，以及与植物细胞共培养过程中加入乙酰丁香酮来提高农杆菌感染效率。
在一个实施方案中，本发明植物基因转化的受体是人参愈伤组织细胞系。该人参愈伤组织细胞系是已经保持了28年稳定生长的传代细胞系，可以传代扩大培养提供足够的细胞进行基因转化。愈伤组织由已分化的细胞回复到脱分化的分生细胞水平，具有易于接受外源基因的能力，可以提高转化效率。非转化人参愈伤组织细胞对卡那霉素和G418均敏感，其中G418的抑制作用更明显。所以可选用G418作为转基因细胞筛选标记。
本发明的方法获得了带有乙肝病毒表面抗原基因的植物细胞表达载体pBIBSa和pBIBSb(图)；并进一步获得了乙肝病毒表面抗原转基因人参愈伤组织细胞系。
具体实施例方式
实施例1乙肝病毒表面抗原基因植物细胞表达载体的构建1.C28细胞染色体DNA的提取取80％以上贴壁的C28细胞(含有乙肝病毒表面抗原S基因)，用PBS缓冲液洗涤细胞，25％胰酶消化，TBS缓冲液重悬细胞，离心收获细胞。用TE(pH8.0)重悬细胞使浓度为5×107/ml，取1ml加入10ml抽提缓冲液(10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，0.1mol/L EDTA(pH8.0)，20ug/ml胰RNA酶，0.5SDS)，37℃1小时。加蛋白酶K至终浓度为100ug/ml，50℃3小时。冷却至室温，加等体积平衡酚抽提，离心收集水相。加两倍体积无水乙醇，混合后，离心弃上清，用75％乙醇洗涤DNA沉淀，离心弃上清，干燥收集DNA沉淀。500ul TE(pH8.0)溶解DNA，4℃保存。
2.乙肝病毒表面抗原基因的获得设计一对引物，P15’-ACTCGAGACATGGAGAACACAG-3’；P25’-ACGTCGAGCTCAAATGTATAC-3’，以C28细胞染色体DNA为模板，进行PCR扩增反应。得到上游含有Xho I位点和ATG起始密码子，下游含有Sst I和TGA终止密码子的约700bp的扩增片段。
3.克隆载体的构建a.利用PCR扩增片段两端突出A碱基与pMD18-T载体两端突出T碱基进行连接反应。得到S基因上游含有HindIII、Sph I、Pst I、Sal I、Xho I位点，下游含有Sst I、Xba I、BamH I、Sma I、Kpn I、Sac I、EcoR I位点的克隆质粒pMDBS。
b.将质粒pMDBS和pBluescript II SK+用Pst I和Sst I双酶切，琼脂糖凝胶回收S基因和pBluescript II SK+载体片段，连接得到S基因上游含有Kpn I、Apa I、Xho I、Sal I、HindIII、EcoRV、EcoR I、Pst I位点，下游含有Sst I位点的克隆质粒pSKBS。
4.两种方法构建表达载体用Sma I和Sst I双酶切pBI121质粒，琼脂糖凝胶回收得到pBI121载体片段。
a.用Xho I单酶切pMDBS质粒，琼脂糖凝胶回收后，用T4DNA聚合酶作用补平粘性末端，再用Sst I单酶切，琼脂糖凝胶回收得到S基因片段。与pBI121载体片段连接得到含有乙肝基因的植物细胞表达载体质粒pBIBSa。
b.用EcoRV和Sst I双酶切pSKBS质粒，琼脂糖凝胶回收得到S基因片段。与pBI121载体片段连接得到含有乙肝基因的植物细胞表达载体质粒pBIBSb。
实施例2表达载体转化农杆菌1.农杆菌LBA4404感受态细胞的制备接种农杆菌LBA4404单菌落于5ml YEP液体培养基中，28℃220rpm培养过夜。取2ml过夜培养菌液转入50ml YEP液体培养基中，28℃220rpm培养至OD600为0.5左右，冰浴30分钟，4℃5000rpm离心5分钟，弃上清。加入20ml 50mmol/L的CaCl2重悬菌体，4℃5000rpm离心5分钟，弃上清。加入2ml 50mmol/L的CaCl2重悬菌体，每管200ul分装，-80℃保存。
2.转化农杆菌取20ng纯化的质粒pBIBS，加入200ul农杆菌感受态中，混匀，冰浴5分钟，转入液氮冷冻8分钟，迅速置于37℃温育5分钟。加入800ul YEP液体培养基，28℃220rpm培养4～5小时。将菌液转移至含有50mg/L卡那霉素的YEP固体培养基表面，均匀涂布于整个平板。28℃培养1～2天。
3.转化农杆菌的筛选鉴定筛选抗性菌落于5ml含有50mg/L卡那霉素YEP液体培养基中，28℃220rpm培养1天，离心，提取质粒，酶切电泳检测片段大小。
实施例3
植物细胞抗性敏感预实验在以下四种培养基中培养人参愈伤组织细胞，每25ml培养基中加入.1.5g人参愈伤组织固体培养细胞。
1.氨苄青霉素抗性组在25ml 67V固体培养基中分别加入50mg/ml的氨苄青霉素60ul、120ul、180ul、240ul、360ul、500ul。
2.卡那霉素抗性组在25ml 67V固体培养基中分别加入50mg/ml的卡那霉素5ul、10ul、25ul、50ul、75ul、100ul、150ul。
3.G418抗性组在25ml 67V固体培养基中分别加入50mg/ml的G4185ul、10ul、25ul、50ul、75ul、100ul、150ul。
4.对照组25ml 67V固体培养基。
比较一个月内的生长情况4组不同抗性浓度与1组之间没有明显差异，人参细胞从1.5g生长到6～7g，说明人参细胞可以在高浓度氨苄青霉素存在下正常生长，可以应用氨苄青霉素在筛选过程中抑制农杆菌生长，同时不影响人参愈伤组织细胞生长。2组和3组都表现出低浓度使人参细胞生长受到抑制，高浓度使人参细胞死亡；同样浓度下人参细胞对G418比卡那霉素更敏感，所以G418更适合转基因人参细胞筛选。培养4天时，G418150ul的细胞开始有部分死亡，10天时细胞几乎全部死亡；培养12天时，G418 25ul的细胞开始有部分死亡，30天时细胞几乎全部死亡。G41825ul(50mg/L)的浓度比较适合转基因人参细胞筛选。
实施例4农杆菌感染植物细胞1.农杆菌的预培养取农杆菌单菌落于3ml YEP液体抗性培养基中，28℃220rpm培养至OD600为0.9左右。取50ul菌液于3ml AB培养基中，28℃220rpm培养至OD600为0.9左右，4℃5000rpm离心10分钟。菌液悬浮于50ml AB预诱导培养基(AB-AS)中，28℃220rpm培养12～15小时，4℃5000rpm离心10分钟。20ml 67V-AS培养基重悬。
2.农杆菌和植物细胞的共培养将人参愈伤组织细胞置于三角瓶中，倒入预培养的菌液，摇匀，静置15～20分钟，倒掉菌液，转移到67V-AS共培养固体培养基上，25℃闭光培养48～72小时。将共培养物转移至三角瓶中，用67V培养基洗3次，500mg/L氨苄青霉素洗1次，转移至67V固体培养基，25℃闭光培养一周。
实施例5转基因植物细胞的筛选鉴定1.抗性筛选将共培养细胞转移到含有300mg/L的氨苄青霉素和50mg/L的G418的67V固体培养基上，四周后长出抗性愈伤组织，每两周传代一次。三个月后换成不含氨苄青霉素的35ml/L G418的67V固体培养基继续筛选。
2.筛选细胞的鉴定1)外源基因整合的PCR检测分别取50-200mg抗性筛选细胞和阴性对照细胞，经液氮冷冻后，研磨成粉。加入900ul提取缓冲液(100mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，50mmol/LEDTA(pH8.0)，500mmol/LnaCl，10mmol/L α-巯基乙醇)，混匀。加入100ul10％SDS，混匀，65℃温育15分钟。加入160ul 5mol/L乙酸钾，混匀，冰浴30分钟，4℃12000r/min离心15分钟。转移上清，加入等体积氯仿/异戊醇，4℃8000r/min离心10分钟。转移上清，加入2/3体积预冷的异丙醇，混匀，放置30分钟。4℃8000r/min离心10分钟，弃上清，80％乙醇洗涤沉淀，干燥。加入含有RNase酶的200ul TE缓冲液溶解沉淀，37℃温育1小时。加入等体积的氯仿/异戊醇，4℃8000r/min离心10分钟。转移上清，加入2/3体积预冷的异丙醇，混匀，放置30分钟。4℃8000r/min离心10分钟，弃上清，80％乙醇洗涤沉淀，干燥。加入100ul TE溶解DNA。得到抗性筛选细胞和阴性对照细胞的染色体DNA。分别取1ul作为模板进行PCR扩增反应。抗性筛选细胞的PCR产物得到约700bp的扩增片段，阴性对照细胞的PCR扩增反应没有特异扩增片段。
2)外源基因表达的ELISA检测分别取抗性筛选细胞和阴性对照细胞0.5g，置液氮中冷冻后，研磨成粉。加入0.5ml提取缓冲液(50mmol/L Tris.Cl，0.029％NaN3(pH9.5))，混匀，4℃抽提过夜。14000r/min离心5分钟。分别取上清液50ul，用乙肝病毒表面抗原ELISA检测试剂盒检测抗原表达。抗性筛选细胞检测到抗原表达，阴性对照细胞没有检测到抗原表达。
权利要求
1.一种包含乙型肝炎病毒表面抗原基因的构建体，其中在所述乙肝病毒表面抗原基因的5’端组装了能使其在植物细胞中高效表达的启动子，在所述乙肝病毒表面抗原基因的3’端组装了增强表达的终止子。
2.权利要求1的构建体，其中所述启动子为CaMY 35S启动子和/或所述终止子为nos终止子。
3.权利要求1的构建体，其中还包含一种筛选标记，优选该标记是NPT II。
4.含有权利要求1-3之一的构建体的载体，所述载体优选为pBIBSa或pBIBSb。
5.含有权利要求1-3之一的构建体或权利要求4的载体的农杆菌，优选该农杆菌为农杆菌LBA4404。
6.含有权利要求1-3之一的构建体或权利要求4的载体或权利要求5的农杆菌的转基因植物细胞系，优选其为人参细胞系，更优选人参愈伤组织的细胞系。
7.制备权利要求6的转基因植物细胞系的方法，包括1)将权利要求1的构建体或权利要求4的载体引入植物细胞；和2)使所述植物细胞表达乙肝病毒表面抗原蛋白。
8.权利要求7的方法，其中所述构建体或载体通过农杆菌感染法、基因枪法、花粉导入法、病毒介导法、PEG介导法、电击诱导法、显微注射法、激光转化法、超声波转化法、或脂质体转化法引入植物细胞，优选农杆菌感染法。
9.权利要求8的方法，其中所述构建体或载体通过使包含该构建体或载体的农杆菌与植物细胞的悬浮细胞共培养来引入植物细胞。
10.权利要求8的方法，其中在进行农杆菌感染的过程中，通过选自儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、原儿茶酸、草香醛、乙酰丁香酮、或羟基乙酰丁香酮的酚类化合物来诱导激活农杆菌Vir区基因，以便增强农杆菌的转化效率，优选所述酚类化合物为乙酰丁香酮(AS)。
全文摘要
本发明涉及表达乙肝病毒表面抗原的转基因植物细胞系以及植物细胞表达系统。本发明还涉及制备上述细胞系或表达系统的方法，以及上述细胞系或表达系统在制备乙肝病毒表面抗原蛋白中的应用。本发明所公开的细胞系或表达系统可用于制备乙肝病毒的疫苗。
文档编号C12N15/82GK1532287SQ0312098
公开日2004年9月29日 申请日期2003年3月26日 优先权日2003年3月26日
发明者盛军, 刘丹, 刘晓宇, 郭桥, 于海鹏, 李鹃, 回悦君, 王志武, 张雪梅, 盛 军 申请人:长春生物制品研究所