专利名称：草酸青霉固态发酵生产果胶酶的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵领域。
果胶酶是一种工业用酶制剂，它的主要性质是降解果胶物质。果胶酶这一性质主要应用于果汁加工和果酒酿造。此外，果胶酶在茶和咖啡的发酵、桔子脱囊衣、麻料脱胶、废水处理、造纸、榨油等领域也有应用。作者最近申请的一项发明专利成功地将其应用于诱导植物抗病。
目前生产果胶酶的培养基主要包括诱导物、碳源、氮源和微量元素。其中诱导物主要是果胶或富含果胶质的生物质，碳源以糖类和麦麸为主，氮源主要有蛋白胨、酵母膏、玉米汁及无机氨盐。本发明以作者从环境中筛选的果胶酶高产菌株草酸青霉BZH-2002为生产菌，以废弃生物质和无机氮源为原料进行固态发酵生产果胶酶。该方法主要特点如下1.含果胶质的废弃生物质作为诱导物和碳源；2.无机氮作氮源；3.自来水为水分；4.接种草酸青霉BZH-2002，于温度30℃左右、环境湿度70％左右、接触空气条件下，静置培养72小时左右达到产酶高峰。5.经水浸提，即得果胶酶液。6.脱胶法测定酶活力，果胶酶产率达到1.2×105单位/克甜菜渣。该方法制备果胶酶所用原料价廉，酶产率高，发酵周期短，工艺简单，具有很高的工业化开发价值。
本发明所述的果胶酶制备方法内容如下1.本发明所用草酸青霉BZH-2002菌株是从环境中分离、筛选获得。该菌株保存于PDA培养基。
2.产酶培养基组成比例(w/w)如下甜菜渣24％，硫酸铵2％，自来水74％，少量磷酸盐。
3.固态发酵操作方法如下按2所述的原料比配制备培养基；培养基分装于500mL的三角瓶中，每瓶30g，于0.1Mpa压力下蒸气灭菌20分钟，也可直接用生料发酵；接种1所述方法制备的菌种，于温度30℃左右、环境湿度70％左右、接触空气条件下，静置培养72小时，用水浸提，即得果胶酶液。
4.果胶酶测定采用脱胶法，测定方法如下取5mL当天配制的1％果胶溶液(用pH4.8的0.05M柠檬酸/柠檬酸三钠缓冲液和柑橘果胶配制)置于25×250mm的试管中，加入pH4.8的0.05M柠檬酸/柠檬酸三钠缓冲液10mL，试管于40℃恒温水浴预热平衡5分钟，加入5mL稀释一定倍数的酶液，并立即开始计时，反应3分钟后取样1mL放入试管，立即加入2滴1％I2/KI溶液，摇匀，再加入2mL异丙醇，转动试管，观察沉淀是否消失，准确记录脱胶时间。酶活力单位定义在上述操作条件下，30分钟使1毫克果胶完全脱胶所需的酶量为一个酶活力单位。
实施例1不同菌种固态发酵产酶实验用上述的菜渣产酶培养基，分别实验了草酸青霉、黑曲霉、大毛霉、灰霉等菌种，各菌种的产酶情况见表1。
表1
实施例2不同氮源对产果胶酶的影响菌种草酸青霉BZH-2002保存于冰箱内4℃PDA培养基，半年转接1次。使用前转接到新配置的斜面。
固态发酵产酶实验分别添加各种无机氮源和有机氮源制备产酶培养基，各培养基的配比都是甜菜渣24％(w/w)，氮0.55％(w/w)，水分74％(w/w)左右，少量磷酸盐。接种草酸青霉BZH-2002进行固态发酵，结果见表2。
表2
实施例3不同废渣固态发酵果胶酶的产率分别以葵花盘、甜菜渣、苹果渣、橘皮、香蕉皮为碳源，以硫酸铵为氮源配制产酶培养基，各培养基的配比(w/w)都是废渣24％，硫酸铵2％，水78％，少量磷酸盐。接种草酸青霉BZH-2002进行固态发酵，结果见表3。
表3
本发明的生物材料样品保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，100080；保藏日期2003年3月14日；保藏编号CGMCC No.0907；分类命名草酸青霉(Penicillium oxalicum)。
权利要求
1.以含果胶质的废弃生物质作为碳源，以无机氮作为氮源，加入3倍水，接种草酸青霉BZH-2002菌株，在一定的温度、湿度、通风条件下进行固态发酵，发酵产物用水浸提，过滤，滤液即果胶酶液。
2.在权利要求第1项所述的方法中，草酸青霉BZH-2002菌株为产果胶酶的唯一菌株，该菌株从环境中分离、筛选获得，其发酵产酶效率因原料不同，控制条件不同而变化。
3.在权利要求第1项所述的方法中，制备果胶酶的碳源包括甜菜渣、葵花盘和果渣等富含果胶质的废弃生物质。所述的甜菜渣是指甜菜糖生产过程中产生的废渣(又称甜菜废粕或颗粒粕)，加工成含水12％以下的；葵花盘是向日葵去掉葵花子后加工成含水12％以下的颗粒状态；果渣是指水果加工过程产生的果皮和废渣，加工成含水12％以下的颗粒状态。在发酵培养基中，碳源占培养基总重量的25％左右(w/w)。
4.在权利要求第1项所述的方法中，氮源可以用较高氨氮含量的废水(如味精废水)，也可用无机铵盐(如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵等)。在发酵培养基中，氨氮的含量占培养基总重量的0.5％左右(w/w)。
5.在权利要求第1项所述的方法中，固态发酵的温度为30℃左右，环境相对湿度为70％左右，适用范围较大，不用严格控制。
6.在权利要求第1项所述的方法中，果胶酶液可根据使用要求，减压浓缩成高浓度果胶酶溶液或冷冻干燥成粉剂；也可以通过盐析、超滤、柱层析等分离纯化方法得到纯度较高的酶制剂。
全文摘要
本发明为一种以含果胶质的废弃生物质和无机氮源为原料用草酸青霉固态发酵制备果胶酶的方法，属于微生物发酵领域。发明以甜菜废渣作为碳源，以硫酸氨作为氮源，接种草酸青霉BZH－2002菌株，在接触空气条件下，于温度30℃左右，环境相对湿度70％左右固态发酵，培养72小时左右达到产酶高峰。用水浸提培养物，过滤，滤液即果胶酶液。经脱胶法测定酶活力，果胶酶产率达到1.2×10
文档编号C12N9/24GK1456666SQ0312079
公开日2003年11月19日 申请日期2003年3月20日 优先权日2003年3月20日
发明者张洪勋, 白志辉 申请人:中国科学院生态环境研究中心