专利名称：飞蝗中气味分子结合蛋白在原核系统中的高效表达的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，是一种通过原核细胞表达重组蛋白的方法。具体涉及通过将构建载体转化到大肠杆菌(E.coli)中表达昆虫气味分子结合蛋白的方法。另外，本发明也涉及一种新的编码OBP的核酸序列。
背景技术：
飞蝗是我国乃至全世界范围内的重要害虫，发生面积大、危害严重，其取食、交配、产卵、迁飞等行为都与飞蝗发达的嗅觉密切相关。在飞蝗嗅觉感受器官的淋巴液中存在一类在信号传递中具有重要作用的蛋白，这类蛋白称为气味分子结合蛋白(Odorant binding proteins，OBPs)，以高浓度存在于脊椎动物鼻黏膜液和昆虫感受器淋巴液中(Pelosi，1998；Steinbrecht，1998)。等电点低，分子量较小(15～20kDa)，可逆地结合气味分子。最初关于昆虫中气味分子结合蛋白(OBP)的研究，都集中于鳞翅目蛾类中。这种蛋白的分离纯化方法一般采用凝胶过滤层析、超滤、透析、离子交换层析等方法。这些方法尽管能够得到比较纯化的目的蛋白，但蛋白的损失量都较大，很难达到深入研究所需的蛋白量。何况有许多种昆虫触角较小，从中分离纯化出的气味分子结合蛋白的量更是不能满足于进一步的研究工作。因此建立一种高效大量表达蛋白的体系势在必须。昆虫中目前关于重组OBP的原核表达，也主要集中于鳞翅目、双翅目等昆虫中，在半变态昆虫中也有相关报道研究。20世纪90年代以来，随着生物化学和分子生物学技术的飞速发展和广泛应用，目前已经可以通过异质系统得到异源蛋白的表达，进而对昆虫气味分子结合蛋白的功能、结构和生化特性等方面的研究成为可能，为探索昆虫气味感受机理，进而揭示脊椎动物嗅觉传导机制提供材料。
发明内容
国内外都对蛋白在原核系统中的表达，尤其在昆虫嗅觉传导中起协同运送外界化学信息物作用的气味分子结合蛋白的原核表达方法及其条件进行了研究。但其表达量大约在10～20mg/L之间，且以包涵体的形式存在，需要利用超声波破碎或较强的变性剂溶解蛋白，仍不能简便快捷地为昆虫嗅觉机理的研究提供高丰度蛋白。本发明目的之一是实现气味分子结合蛋白在原核系统中的高效大量表达(表达量达40mg/L)，为OBP生理功能及昆虫嗅觉机理的研究提供保证。本发明目的之二是提供从飞蝗Locusta migratoria触角中克隆测序所得到的新序列(SEQ ID NO.1)gacgtgaaca tgaaacttac tgggcgcatt atggatgctg caaaagaagt ggaccacaca 60tgccgctcat ctactggggt tccaagagac atgctccata gatatgctga aggtcaaact120gtagatgatg atgatttcaa gtgttacctg aagtgtatta tggttgagtt taattcactc180tcagatgatg gagtttttgt tttagaagaa gaattagaaa atgttcctcc agaaataaag240gaagaaggcc atagggttgt acacagctgc aaacacataa atcatgatga agcttgcgaa300acagcttacc agatccatca gtgctataaa cagagtgatc ctgagttgta cagcctggta360gttcgtgcat ttgatgcaac cattggtgac taataggaag ttgttactgc aggcagctta420cagtgaaagg actgtcaagc tgtctatntg aggtgcgaag tattacaaag gtgctttcct. 480aaatgatttt agtgaagtgt gttgcaccat atgctgaaat taatatctgt acnccncaat540aatatgacca aataaacaat ggcatcncaa agtacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 599其中n＝a或c或g或t
本发明在原有原核系统表达重组蛋白的基础上，从感受态细胞的制备条件入手，摸索出不同于原有表达系统所适用的条件，大幅度提高了重组蛋白的表达量，为蛋白质纯化和生理功能的深入研究提供充足的蛋白量。采用该方法表达蛋白质程序较为简单、省时。本发明在原核系统中的高效大量表达重组OBP的技术方案包括以下步骤1.感受态细胞的制备制备感受态细胞E.coli BL21将其在37℃培养到OD600为0.4～0.6时，离心，弃上清，将沉淀用0.1M CaCl2溶解。再次离心，弃上清，用0.1M CaCl2再次溶解沉淀，分装，0.1ml/管，-70℃贮存备用。
2.载体构建将表达载体pET-5b进行双酶切，与目的片段相混合，在室温下过夜连接，得到构建后载体。
3.转化到感受态细胞将构建后载体转化到感受态细胞将构建后载体与感受态细胞相混合，冰浴30min后42℃热激45～90s，37℃孵育1hr，涂板，37℃孵育过夜。
4.挑单菌落大量培养，并对其进行诱导表达挑单菌落大量培养，并对其进行诱导表达挑单菌落在LB培养液中大量培养，在OD600达到0.4～0.6时加入IPTG，其终浓度为0.2uM，25～28℃培养1～3hr。
5.电泳检测表达结果取诱导表达产物和未诱导表达的菌液，离心后得到沉淀，用SDS-PAGE样品缓冲液溶解沉淀，100℃沸水浴5min，然后进行SDS-PAGE电泳以检测表达结果。
6.、重组蛋白的裂解纯化富集沉淀后，于大肠杆菌中加入裂解缓冲液在37℃以重悬沉淀，取上清，将沉淀进一步进行超声波破碎。用Superose-12及Mono-Q分离纯化上清。
裂解缓冲液10mM Tris，8M Urea，1mM PMSF
图1.重组气味分子结合蛋白在原核系统E.coli中表达及纯化过程的示意2.表达质粒的图谱以下结合附图和具体的实施方案对本发明进行进一步的说明，其无意于以任何方式限制本发明所要求的范围。
实施例1感受态细胞的制备①从37℃培养16～20hr的新鲜平板中挑取一个大肠杆菌菌株E.coli BL21(购自Promega公司)的单菌落，接种于5mL LB培养液中，37℃震荡过夜。
②1mL菌液转移到100mL LB培养液中，震荡培养至OD600为0.4～0.6。
③在无菌条件下，将菌液转移到一个灭菌离心管中，置冰上10min，使培养物冷却至0℃。
④4000rpm离心10min，倒去上清，加入10mL灭菌预冷的0.1mol/L CaCl2轻轻悬浮沉淀，置冰上10min。
⑤4000rpm离心10min，倒去上清，加入2mL预冷的0.1mol/LCaCl2轻轻悬浮沉淀，100μL分装，置冰上备用或-70℃保存。
实施例2载体构建将表达载体pET-5b用NdeI、EcoRI进行双酶切，与末端分别为NdeI、EcoRI序列的目的片段在室温下过夜连接，得到构建后载体。
实施例3将含有目的片段的载体转化到感受态细胞①加1μL连接产物于100μL大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min。
②42℃水浴热激90s，立即置冰上5min。
③加入400μL LB培养基，37℃培养60min。
④涂布LB/agar平板(含有100μg/mL Amp，20μg/mL X-gal和IPTG)，置于37℃培养箱中培养16～18hr。
实施例4诱导表达挑单菌落大量培养，并对其进行诱导表达挑单菌落在LB培养液中大量培养，在OD600达到0.4～0.6时加入IPTG，其终浓度为0.2uM，25～28℃培养3hr。
实施例5电泳检测表达结果分别取200ul诱导表达后的菌液和未诱导表达的菌液，离心后得到沉淀，用30ul SDS-PAGE样品缓冲液溶解沉淀，100℃沸水浴5min，进行SDS-PAGE电泳。通过Marker蛋白对照检测表达结果。
实施例6重组蛋白的裂解纯化富集沉淀后，每克大肠杆菌(湿重)加入3ml裂解缓冲液在37℃重悬沉淀，取上清，将沉淀进一步进行超声波破碎。用Superose-12及Mono-Q分离纯化上清。裂解缓冲液10mM Tris，8MUrea，1mMPMSF。
比较实施例通过传统方法表达重组蛋白并与本发明的实施方案相比较，除下列条件外，其它的条件和操作均相同。
从上表可见，与原有表达重组蛋白的原核系统相比，本发明新表达系统大幅度增加了重组蛋白的表达量，使得OBP的表达量提高至原有表达系统的四倍。
序列表<110>Organizationming，xing<120>飞蝗中气味分子结合蛋白在原核系统中的高效表达<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>599<212>DNA<213>Locusta migratoria<223>n＝a或c或g或t<400>1gacgtgaaca tgaaacttac tgggcgcatt atggatgctg caaaagaagt ggaccacaca 60tgccgctcat ctactggggt tccaagagac atgctccata gatatgctga aggtcaaact120gtagatgatg atgatttcaa gtgttacctg aagtgtatta tggttgagtt taattcactc180tcagatgatg gagtttttgt tttagaagaa gaattagaaa atgttcctcc agaaataaag240gaagaaggcc atagggttgt acacagctgc aaacacataa atcatgatga agcttgcgaa300acagcttacc agatccatca gtgctataaa cagagtgatc ctgagttgta cagcctggta360gttcgtgcat ttgatgcaac cattggtgac taataggaag ttgttactgc aggcagctta420cagtgaaagg actgtcaagc tgtctatntg aggtgcgaag tattacaaag gtgctttcct. 480aaatgatttt agtgaagtgt gttgcaccat atgctgaaat taatatctgt acnccncaat540aatatgacca aataaacaat ggcatcncaa agtacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 599
权利要求
1.一种通过原核生物表达系统制备气味分子结合蛋白(Odorantbinding proteins，OBPs)的方法，包括步骤a).将原核生物制备感受态细胞；b).将编码OBP的核酸序列与表达载体相连；c).用b)中获得的重组表达载体转化到a)中的感受态细胞，冰浴0.5hr后42℃热激45～90s，37℃孵育1hr，涂板，37℃孵育过夜；d).在培养液中用诱导剂诱导表达并纯化重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备气味分子结合蛋白(OBP)的方法，其特征在于诱导剂为0.2uM的IPTG，诱导温度为25～28℃，诱导时间为1～3hr。
3.根据权利要求1或2所述的制备气味分子结合蛋白(OBP)的方法，其特征在于原核生物为E.coli BL21。
4.根据权利要求1或2所述的制备气味分子结合蛋白(OBP)的方法，其特征在于编码OBP的核酸序列为SEQ ID NO.1。
5.一种编码气味分子结合蛋白的核酸分子，其含有序列SEQ IDNO.1。
全文摘要
本发明公开了一种在原核细胞中表达昆虫的重组气味分子结合蛋白(Odorant binding proteins，OBPs)的方法，其是通过用含有目的核酸序列的载体转化到感受态原核生物细胞进行的。另外，本发明也公开了获自飞蝗Locusta migratoria触角的编码OBP的新的核酸序列。
文档编号C12N15/63GK1782073SQ20041000996
公开日2006年6月7日 申请日期2004年12月3日 优先权日2004年12月3日
发明者张龙, 班丽萍, 于艳雪 申请人:中国农业大学