专利名称：猪慢收缩型肌钙蛋白编码基因tnni1作为猪生产性状的遗传标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及猪的分子生物学技术及育种领域，具体涉及猪的与生产性状相关基因TNNI1基因第3内含子的突变位点的检测方法。
背景技术：
通过生产性状的表型值估算出的育种值进行动物选择性育种，已大大促进了家畜生产性状的遗传改良。九十年代以来，随着分子生物学技术的进步以及在猪领域中的应用，逐步出现了以分子标记为核心的分子标记辅助选择和渗入等分子育种技术，这些技术与常规育种相结合，大大加速了猪育种进程。能够应用于分子标记辅助选择的基因或标记必须对目标性状具有较大的遗传贡献率，即主效基因或标记，因此寻找这些主效基因和与之紧密连锁的分子标记成为分子标记辅助选择的前提和基础，也是当前和今后一段时间猪分子生物学领域的研究重点和急需解决的问题。
目前已有多个位于功能基因内部的与生产性状紧密连锁的分子标记被发现并申请专利。例如，在传统的猪育种计划中，由于消费者对瘦肉的兴趣，因此选择主要强调降低脂肪。脂肪降低主要以背膘厚降低来衡量。然而，背膘厚下降同样导致了肌内脂肪的下降，脂肪最后的沉积部位是肌肉，因此肌内脂肪与味道以及肌肉的接受程度呈正相关。为防止肌内脂肪进一步的下降，必须找到影响此性状的分子标记，因为肌内脂肪是很难在活体中度量的。Gerbens等证实了位于猪6号染色体上肌肉组织特异候选基因心脏脂肪酸结合蛋白与猪中肌内脂肪含量和其它生产性状的关系，该基因已被申请专利，其专利号为WO 97/35878；另外，Rothschild等发现了leptin受体基因内与瘦肉率有关的分子标记，其专利号为US.Pat.Nos.5972621。
根据ATP酶组化法，肌纤维被分为I型(慢收缩型)和II型(快收缩型)肌纤维两大主要类型(Staronet al.1986.Correlation between myofibrillar ATPase activity and myosin heavy chain composition in rabbitmuscle fibers.Histochemistry.8619-23)。I型纤维肌浆肌红蛋白和细胞色素多，肌纤维周围的血管分布密度大，具有较高线粒体酶浓度，而肌原纤维ATP酶和磷酸化酶活性低，仅能进行有氧氧化代谢，与红肌纤维对应；II型中IIA型纤维既能进行酵解，又能进行有氧氧化，为中间型；IIB型纤维仅能进行酵解代谢，与白肌纤维对应(Karlsson et al.1999.Skeletal muscle fibres as factors for pork quality.Livest Prod Sci.3255-269)。I型(红肌纤维)较II型(白肌纤维)纤维细，产酸能力弱，pH值和脂肪含量较高，提高肌肉I型纤维比例有利于提高肉色、嫩度与多汁性。
肌钙蛋白复合体属于独立的多基因家族，它与原肌球蛋白和肌动蛋白-肌凝蛋白肌原纤维相互作用参与了Ca2+介导的横纹肌收缩。这个复合体包括3个紧密联系的蛋白质肌钙蛋白C(TnC)、肌钙蛋白I(TnI)和肌钙蛋白T(TnT)，其表达产物都表现出肌纤维特异性。TnI为肌动蛋白结合蛋白，TnI基因家族包括3个亚型2个骨骼肌亚型，即TnI-快收缩型和TnI-慢收缩型，1个心肌亚型，即TnI-心脏型。Wade等(1990.cDNA sequence，tissue-specific expression，and chromosomal mapping of the hunan slow-twitchskeletal muscle isoform of troponin I.Genomics.7346-357)首先分离出了人慢收缩骨骼肌TNNI1基因的cDNA全长序列，用该cDNA为探针检测啮齿类动物和人成肌细胞中的组织特异性调控和发育调控，结果发现TNNI1信号似乎只局限在含有慢收缩型骨骼肌肌纤维的肌肉组织中。
生物学上，生产性状体现在动物的特定组织中，比如，肌肉组织对应于瘦肉生产。因此，在动物育种计划中，各种水平的选择压力都会施加于不同组织中。而关于不同组织中特异表达基因与个体生产性能之间的关系还没有完全揭示出来。本发明提供了肌肉特异表达基因-慢收缩型肌肉肌钙蛋白(TNNI1)编码基因第3内含子内的遗传变异与猪生长、胴体和肉质生产性状间的关系。
发明内容
本发明的目的在于克隆猪TNNI1基因的部分基因组DNA序列，寻找TNNI1基因的突变位点以及基因多态性的检测方法，为猪的分子育种提供辅助选择方法。
本发明提供了大白猪、长白猪、通城猪、清平猪和二花脸猪包括猪TNNI1基因第3内含子的455bp的基因组核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5所示；通过5个猪种〔大白猪、长白猪、通城猪、清平猪和二花脸猪)的上述序列进行Cluster W比对提供了位于该455bp扩增片段内部的5处单核苷酸多态性(SNP)，其SNP位点如图1所示。
制备该基因片段的步骤如下选择三个中国地方品种(通城猪、清平猪和二花脸猪)和2个外来(国外)品种(大白猪、长白猪)为试验材料，从猪血液中提取DNA，根据猪TNNI1基因cDNA序列(GeneBank登录号AY282922)，设计引物，其序列分别如序列表SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示，PCR扩增，PCR产物纯化、克隆测序，序列比较分析。
本发明提供了鉴定上述序列383bp处C/T变异的XbaI-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法。其步骤包括根据猪TNNI1基因cDNA序列(GeneBank登录号AY282922)和所获得的上述SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5序列，设计引物，其引物序列分别如序列表SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9所示，在猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR扩增片段XbaI酶切分型及检测。
本发明进一步提供了利用XbaI-RFLP方法确定的不同基因型个体与生产性状间的相关关系。
序列表
1、序列表SEQ ID NO.1是外来猪种“大白猪”的核苷酸序列；2、序列表SEQ ID NO.2是外来猪种“长白猪”的核苷酸序列；3、序列表SEQ ID NO.3是中国猪种“通城猪”的核苷酸序列。
4、序列表SEQ ID NO.4是中国猪种“清平猪”的核苷酸序列。
5、序列表SEQ ID NO.5是中国猪种“二花脸猪”的核苷酸序列。
6、序列表SEQ ID NO.6是制备SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5特异基因片段所用的正向引物。
7、序列表SEQ ID NO.7是制备SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5特异基因片段所用的反向引物。
8、序列表SEQ ID NO.8是实施猪TNNI1基因第3内含子C/T变异XbaI-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的正向引物。
9、序列表SEQ ID NO.9是实施猪TNNI1基因第3内含子C/T变异XbaI-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的反向引物。
图1五个猪种TNNI1基因序列比对结果和SNP位点。
图2包括猪TNNI1基因第3内含子的基因片段琼脂糖凝胶电泳图谱。
琼脂糖凝胶浓度为1.5％；M泳道DNA Marker DL2,000；泳道1-4代表序列表SEQ ID NO.6和SEQID NO.7所示引物在不同猪种中的扩增片段，片段大小为455bp。
图3TNNI1基因XbaI-RFLP检测结果。
琼脂糖胶浓度为2.5％；泳道M为DL 2000 Markers；1、4、5、8、9泳道为AA基因型，188bp；3、7泳道为AB基因型，188bp，111bp，77bp；2、6泳道为BB基因型，111bp，77bp。
根据本发明的方法可以用于开发成诊断方法或试剂盒，从而在育种计划中利用这些方法来选择携带有利等位基因的猪，从而可以达到较好的选择效果。
具体实施例方式
实施例1；基因片段的获得及多态性检测方法的建立选择2个外来猪种(大白猪、长白猪)和3个中国猪种(通城猪、清平猪、二花脸猪)为试验材料，根据猪TNNI1基因cDNA序列(GeneBank登录号AY282922)，设计以下引物，引物序列如下正向引物F1TCACTGCCTCCCGCAAACT反向引物R1GAGCCTTCTCAGCCTCTCGC用此引物在五个猪种(大白猪、长白猪、通城猪、清平猪和二花脸猪)基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系为25μl，其中模板DNA为50ng，dNTPs浓度为200μmol/L，每条引物浓度为0.4μmol/L，3U的Taq DNA聚合酶(Biostar International，Canada)，加去离子水至总体积25μl；PCR反应程序94℃预变性4min；然后94℃变性50s、64℃退火50s、72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。
不同猪种的PCR产物经纯化(UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物技术公司)、克隆后，进行序列测定，序列测定由上海生工生物技术公司完成。不同猪种的PCR产物序列经ClusterW软件进行序列比对，序列间比对结果见图1。上述扩增片段大小为455bp，共存在5个碱基变异，其中位于该片段的383bp处的C/T变异表现了中、外猪种间差异，并引起了XbaI酶切位点(↓TCTAGA)多态性。据此，设计以下引物，并采用XbaI-RFLP方法进行SNP分型，引物序列如下正向引物F2GAGTGGTAGGAGATTGACGGA反向引物R2GTAGCGAGCCTTCTCAGCCPCR反应体系为20μl，其中模板DNA为50ng，dNTPs浓度为200μmol/L，每条引物浓度为0.5μmol/L，1U的Taq DNA聚合酶(Biostar International，Canada)，加去离子水至总体积25μl；PCR反应程序为94℃预变性4min；然后94℃变性50s、60℃退火50s、72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。
取8.5μl PCR产物加入0.5μl(10U/μl)限制性内切酶和1μl 10×buffer(含10×BSA)，37℃ XbaI酶切4h，取5μl酶切产物用琼脂糖或聚丙烯酰胺胶电泳检测，在紫外灯下或银染后观察并记录酶切结果。此扩增片段大小为188bp，XbaI酶切多态性位点位于该片段的111bp处，若111bp处的碱基为C，则不存在Xbal酶切位点，用XbaI酶切检测结果只有一条188bp片段(A等位基因)，当该位点为T时，结果导致一个Xbal酶切位点的产生，酶切得到两个片段，长度分别为111bp和77bp(B等位基因)。
实施例2分子标记在不同猪群中的多态性分布在3个国外猪群(大白猪、长白猪、杜洛克猪)和6个中国猪群(通城猪、清平猪、八眉猪、淮南猪、梅山猪、二花脸猪)中检测猪TNNI1第3内含子的XbaI-RFLP多态性，检测结果如表1所示。在所检测的几个猪种中，大白、长白和杜洛克猪群占优势的A等位基因的基因频率分别为0.804、0.825和0.883，而二花脸、梅山、清平和八眉猪中优势的B等位基因的基因频率分别为1、0.865、0.679和0.636，在通城猪和淮南猪中A等位基因和B等位基因的频率接近，A等位基因的基因频率分别为0.522和0.52。
表1 TNNI1基因XbaI酶切多态性在不同猪种中的分布结果
实施例3分子标记与生产性状的关联分析为了确定TNNI1基因多态性与猪表型差异是否相关，选择华中农业大学农业部猪遗传育种重点实验室组建的295头大白×梅山F2代资源群体为试验材料，采用实施例2所建立的XbaI-RFLP方法进行多态性检测，并分析猪TNNI1基因XbaI-PFLP不同基因型与猪生产性状的相关关系。采用SAS统计软件(SASInstitute Inc，Version 8.0)glm程序进行单标记方差分析，同时采用reg程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验，所采用模型为Yijkl＝μ+Gi+Fj+Sk+Yl+bijklXijkl+eijklYij为性状表型值，μ为平均值，Gi为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用-1，0和1分别代表AA、AB和BB基因型，显性效应用1，-1和1分别代表AA、AB和BB基因型)；Sk、Yl、Fj为固定效应，分别为性别、年度、家系效应，bijkl为屠宰体重或屠宰日龄的回归系数，胴体性状以屠宰体重为协变量，肉质性状以屠宰日龄为协变量，生长不考虑协变量；eijkl为残差效应。
在所检测的295头大×梅F2代个体中，AA基因型有74个，AB基因型有154个，BB基因型有67个。不同基因型与生产性状间的统计分析结果总结于表2和3。
由表2可以看出，XbaI-RFLP基因型不同时，初生重、皮率、骨率、肥肉率、瘦肥比率、眼肌高、眼肌面积、背膘厚性状存在显著或极显著差异。该位点在初生重、皮率、骨率、肥肉率、瘦肥比率、眼肌面积、6-7腰椎间背膘厚和胸腰椎间背膘厚主要以加性作用方式为主，但效应方向与品种间的表型效应并不完全一致。来源于大白品种的A等位基因在降低肥肉率、6-7腰椎间背膘厚和胸腰椎间背膘厚的同时，提高了初生重和瘦肥比率，这与大白品种表型效应方向是一致的，而在皮率、骨率、眼肌面积性状上却与品种效应方向相反。该位点在肩部背膘厚和眼肌高性状上显性效应显著，分别为-0.099±0.041和-0.142±0.047。
表2 TNNI1基因XbaI-RFLP基因型与生长、胴体性状的统计分析表
注以上数值为最小二乘均值±标准误；含有相同字母表示差异不显著，小写字母表示差异显著，大写字母表示差异极显著；加性效应负值表示B等位基因降低性状表型值*表示p＜0.05，**表示p＜0.01(下表同)。
由表3可以看出，TNNI1基因XbaI-RFLP不同基因型时，股二头肌pH值和背最长肌色值差异显著，背最长肌pH值差异极显著性。对于背最长肌肌肉pH值，该位点加性效应和显性效应均显著，分别为-0.031±0.016和0.022±0.011；背最长肌肌肉色值加性效应显著，其值为0.558±0.257；来源于大白品种的A等位基因提高了背最长肌肌肉pH值，同时降低了背最长肌肌肉色值。
表3 TNNI1基因XbaI-RFLP基因型与肉质性状的统计分析表
序列表SEQUENCE LISTING<110>华中农业大学<120>猪慢收缩型肌钙蛋白编码基因TNNI1作为猪生产性状的遗传标记<130>
<141>2004-06-25<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>455<212>DNA<213>猪(Sus scrofa)<220>
<221>gene<222>(1)..(455)<223>
<400>1tcactgcctc ccgcaaactc ctgctgaagg tgtgctgggt cctggttttg gggagatgtc 60caggggaggc agaggggcac agggcagcct tgggggttgg gggaagggtc atgggagggt120gacagggggc caaagcctgg gaggaggcag gaccagcttc agggcacaat cccccatctc180ccgatctccc aatctcccaa tctcccagtg ggagcctggg agaagagctt tattttgcta240agagtctttg aagctctggg ggcgcaaaga gagtggtagg agattgacgg acaggagaga300
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<221>gene<222>(1)..(19)<223>
<400>9gtagcgagcc ttctcagcc19
权利要求
1.包含猪慢收缩型肌钙蛋白编码基因TNNI1第3内含子的特异基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述DNA序列，获得该DNA序列的引物序列如序列表SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
3.根据权利要求1所述DNA序列，其特征在于序列表SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5序列383位碱基处有一个碱基突变C383-T383，导致Xba I-RFLP多态性。
4.一种筛选猪生产性状的分子标记的方法，按照以下步骤从猪血液中提取基因组DNA，根据猪TNNI1基因cDNA序列和序列表SEQID NO.1-SEQ ID NO.5所示的序列设计引物，该引物的序列如序列表SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.9所示，用该引物在猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR扩增片段XbaI酶切分型及检测。
5.权利要求1-4任一项所述的猪生产性状相关基因TNNI1在猪标记辅助选择中的应用。
全文摘要
本发明属于猪的分子生物学技术与育种领域，具体涉及猪慢收缩性肌钙蛋白(Troponin 1，Slow－twitch skeletal muscle isoform，TNNI1)编码基因第3内含子的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)检测技术领域。其步骤包括从猪血液中提取基因组DNA，设计引物，PCR扩增，PCR产物克隆、测序，序列比较分析，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)检测，标记与性状间相关性分析。本发明公开了猪TNNI1基因第3内含子的DNA序列和SNP分型的检测技术，为猪的分子标记辅助选择提供了新的标记。
文档编号C12Q1/68GK1715408SQ20041001338
公开日2006年1月4日 申请日期2004年6月29日 优先权日2004年6月29日
发明者熊远著, 左波, 邓昌彦 申请人:华中农业大学