专利名称：离子钙含量测定方法及离子钙诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种离子钙含量测定方法，同时本发明还涉及用以实现该方法的离子钙诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
总钙的测定方法很多，概括起来有滴定法(包括氧化还原滴定法、络合滴定法)，比色法(最常用又便于自动化操作的有邻甲酚酞络合酮法、甲基麝香草酚蓝法、偶氮胂III法等)，火焰光度法、原子吸收分光光度法、同位素稀释质谱法。国际临床化学联合会(IFCC)推荐的钙测定决定性方法为同位素稀释质谱法(IDMS)，参考方法为原子吸收分光光度法。世界卫生组织(WHO)推荐的中等实验室用的常规方法为邻甲酚酞络合酮法(O-CPC)。
血清离子钙亦称游离钙，是具有生理活性的钙。它比总钙更能反映机体内钙的代谢状态，对疾病具有更高的诊断价值(1)离子钙的测定对较大的外科手术意义重大，如开胸的心脏手术，肝移植及其他需大量输入柠檬酸盐抗凝血的手术或术后脓毒血症。反复测定总钙已经没有什么意义，而离子钙对指导这些病人的正确治疗非常重要。(2)当怀疑有新生儿患低钙血症时，应测定离子钙，如果出现并发症，更有必要经常测定。(3)肾脏疾病肾移植病人，或进行血液透析的病人，钙代谢经常改变而且有时很激烈。因此在做血透时维持轻微的正钙平衡对保持良好的心脏功能是重要的，而离子钙的测定是对此监测的最好的手段。(4)原发性甲状旁腺功能亢进的病人，90％以上的病例离子钙升高，甲状旁腺功能减退者离子钙显著偏低。
目前离子钙的主要测定方法大致有酶比色法、生物学法、透析法、超滤法、金属指示剂法、离子选择性电极法。以前，受限于技术上的原因，离子钙的测定仅限于少数研究部门，临床实际应用很少。最近十年来的研究开发，提出采用钙—汞合金电极的钙离子选择性电极法。此方法简便、迅速、重复性好，正确和敏感性高。测定结果不受血浆蛋白质的影响，能反映机体钙代谢的实际情况。但是成本高昂。而酶比色法测定离子钙——比离子选择性电极法更简便、更迅速、更经济、特异性专一及成本更低廉等特点。结合我国的具体实际，应以酶法测定较为实用。
检索中国专利仅发现申请号为03131931.9、申请日为2003.06.19名称为《三抗法快速定量测定心肌肌钙蛋白I》之类的专利，而测定心肌肌钙蛋白与测定钙离子无关。这从一个侧面说明，我国此方面的研究还比较欠缺。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种可以克服以上现有技术缺点的离子钙诊断试剂盒，采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行离子钙含量测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。同时本发明还提出相应的离子钙含量的测定方法。
本发明测定离子钙含量的步骤如下1)、将样品与主要由磷脂、磷脂酶(需钙离子激活)、胆碱、氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应磷脂+水磷脂酶-D/Ca++磷脂酸+胆碱胆碱+2氧+水胆碱氧化酶甜菜碱+2过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水2)、检测最终反应物在主波长400--600nm吸光度上升的速度，测算出离子钙含量的大小。
通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长400--600nm吸光度上升的速度，测算出离子钙含量的大小。
以上样品与试剂的混合比例按体积为1/10到1/250，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。
本发明应用磷脂酶(一种需要钙离子激活的酶)偶联胆碱氧化酶、过氧化物酶反应比色法。磷脂酶在钙的辅助下酶解磷脂产生胆碱，偶联胆碱氧化酶及过氧化物酶等酶偶联反应以及还原型色原体(Chromogen)组合系统，将无色的还原型色原体组合氧化成有颜色的醌亚胺色原(Quioneimine)或者吲嗒胺色原(Indamine)染料，因此测量染料含量的高低(不同染料吸收波长不同，介于400--600nm之间)可以直接反映离子钙含量的大小。这个酶偶联反应系统的优点有(1)它利用将无色的还原型色原体组合氧化成有颜色的醌亚胺色原或者吲嗒胺色原染料来反映离子钙含量，有精确度好的优点。(2)这个酶偶联反应系统组成的反应成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试结果精确。
用于实现本发明方法的离子钙诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液 40--200mmol/l磷脂1--50mmol/l
磷脂酶(需钙离子激活) 5000--500000U/l胆碱氧化酶500--50000U/l过氧化物酶500--50000U/l稳定剂10--80％(总体积)还原型色原体组合 0.1--20mmol/l以上还原型色原体组合可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙(3-methyl-2-benzothiazolinone-hydrszone简称MBTH)或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒(4-aminoantipyrine)与0.1--20mmol/l以下十四种成分之一组合而成石碳酸(phenol)N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-m-anisidine简称ESPAS)N，N-双乙基-m-甲苯胺(N，N-Diethyl-m-toluidine)2，4-双氯石碳酸(2，4-Dichloriphenol)2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸(2，4，6-Tribromo-3-hydroxy-benzenesulfonic acid简称TBHB)3，5-双氯石碳酸磺酸(3，5-Dichlorophenolsulfonic acid)3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸(3，5-Dichloro-2-hydroxy-benzenesulfonicacid简称DHBS)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐(N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine sodium简称TOOS)仨溴羟基苯甲酸(Tribromohydroxybenzoic acid)双甲基苯胺(Dimethylaniline简称DMA)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine简称EHSPT)
2，2′-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)(2，2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)简称ABTS4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(Vanillic acid(4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid)简称HMB)3-甲基-乙基-羟基苯胺(3-methyl-ethyl-hydroxyaniline简称MEHA)也可以将以上单剂配成如下双剂，更有利于消除内、外源胆碱污染试剂I缓冲液 40--200mmol/l胆碱氧化酶 500--50000U/l过氧化物酶 500--50000U/l稳定剂 10--80％(总体积)还原型色原体组合(一) 0.1--20mmol/l还原型色原体组合(一)可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒二者中之一。
试剂II缓冲液 40--200mmol/l磷脂 l--50mmol/l磷脂酶(需钙离子激活) 5000--500000U/l稳定剂 10--80％(总体积)还原型色原体组合(二) 0.1--20mmol/l还原型色原体组合(二)可以是0.1--20mmol/l以下十四种成分之一石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-双乙基-m-甲苯胺、2，4-双氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸、3，5-双氯石碳酸磺酸、3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐、仨溴羟基苯甲酸、双甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羟基苯胺。
双剂的配方不仅限于上述配方，还原型色原体组合(一)及(二)可以互换位置。试剂II其中的成分，磷脂或磷脂酶也可以放在试剂I，如此可以形成多种配方，不在此一一详述。
还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源胆碱污染，还更有利于试剂的稳定试剂I缓冲液 40--200mmol/l稳定剂 10--80％(总体积)还原型色原体组合(一) 0.1--20mmol/l还原型色原体组合(一)可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒二者中之一。
试剂II缓冲液 40--200mmol/l胆碱氧化酶 500--50000U/l过氧化物酶 500--50000U/l稳定剂 10--80％(总体积)试剂III缓冲液 40--200mmol/l磷脂 1--50mmol/l磷脂酶(需钙离子激活) 5000--500000U/l稳定剂 10--80％(总体积)还原型色原体组合(二) 0.1--20mmol/l
还原型色原体组合(二)可以是0.1--20mmol/l以下十四种成分之一石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-双乙基-m-甲苯胺、2，4-双氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸、3，5-双氯石碳酸磺酸、3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐、仨溴羟基苯甲酸、双甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羟基苯胺。
三剂的配方不仅限于上述配方，还原型色原体组合(一)及(二)可以分开放在试剂I、II或III的任何位置。试剂II其中的成分，胆碱氧化酶、过氧化物酶等也可以放在试剂I中，试剂III其中的成分，磷脂或磷脂酶等也可以放在试剂I或试剂II中，如此可以形成多种配方，不一一详述。
缓冲剂的pH范围可以是6.0～11.0。缓冲剂可以是三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐(Phosphate)缓冲液、三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液、咪唑(Imidazole)缓冲液或双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液等，但不仅限于这些缓冲液。
此外，为了减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I、试剂II或三剂的试剂I、试剂II、试剂III中通常加入稳定剂10～80％或者10～50mmol/l，稳定剂可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或盐等中的一种或一种以上。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的本发明离子钙诊断试剂盒较为理想
缓冲液80--120mmol/l磷脂 2--10mmol/l磷脂酶(需钙离子激活) 20000--200000U/l胆碱氧化酶2000--20000U/l过氧化物酶2000--20000U/l稳定剂20--50％(总体积)还原型色原体组合 0.1--10mmol/l由于本发明是完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，不易受到内、外源其他物质的干扰。酶法方法简便、易于操作。酶解反应的特异性促使测试结果精确。酶解反应都是在缓冲液条件下进行，没有污染环境问题。酶法方法不需要特殊、额外的仪器，测试成本低廉。因此可以保证具有较高的测试准确性，更便于推广应用。
此外，本发明的显著特色之一是可以消除内、外源胆碱的污染，消除内、外源胆碱的作用发生在整个反应时间段的前半部分，在后半段时间受污染的内、外源胆碱已经被消耗殆尽，而在后半段时间测试离子钙含量所需要的胆碱都是产生于离子钙的作用。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一(单剂)本实施例的离子钙诊断试剂盒包括缓冲液 80mmol/l磷脂2mmol/l磷脂酶(需钙离子激活)20000U/l胆碱氧化酶 2000U/l过氧化物酶 2000U/l
稳定剂 50％(总体积)4-氨基抗砒 2mmol/l石碳酸 10mmol/l在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长495～505nm，测试副波长600nm以上，被测离子钙样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应磷脂+水磷脂酶-D/Ca++磷脂酸+胆碱胆碱+2氧+水胆磷氧化酶甜菜碱+2过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长495～505nm吸光度上升的速度，从而测算出离子钙的含量大小。
本实施例应用磷脂酶偶联胆碱氧化酶、过氧化物酶反应比色法。磷脂酶在钙的辅助下酶解磷脂产生胆碱，偶联胆碱氧化酶及过氧化物酶等酶偶联反应以及还原型色原体(Chromogen)组合系统，将无色的还原型色原体组合氧化成有颜色的醌亚胺色原(Quioneimine)或者吲嗒胺色原(Indamine)染料，因此测量染料含量的高低(不同染料吸收波长不同，介于400--600nm之间)可以直接反映离子钙含量的大小。
实施例二(双剂)本实施例的离子钙诊断试剂有试剂I缓冲液100mmol/l胆碱氧化酶11000U/l过氧化物酶11000U/l
稳定剂 50％(总体积)4-氨基抗砒 1mmol/l试剂II缓冲液 100mmol/l磷脂6mmol/l磷脂酶(需钙离子激活)110000U/l稳定剂 50％(总体积)2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 1mmol/l测定离子钙含量时，温度控制在30℃，反应时间15分钟，测试主波长546nm，测试副波长630nm以上，被测离子钙样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应。
具体测定步骤为磷脂+水磷脂酶-D/Ca++磷脂酸+胆碱胆碱+2氧+水胆磷氢化酶甜菜碱+2过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长546nm吸光度上升的速度，从而测算出离子钙的含量大小。
各反应步骤的反应时间控制在15分钟。
实施例三(三剂)本实施例的离子钙诊断试剂为三剂，有试剂I缓冲液 120mmol/l稳定剂 20mmol/l3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2mmol/l
试剂II缓冲液 120mmol/l胆碱氧化酶 20000U/l过氧化物酶 20000U/l稳定剂 50％(总体积)试剂III缓冲液 120mmol/l磷脂10mmol/l磷脂酶(需钙离子激活)200000U/l稳定剂 50％(总体积)双甲基苯胺 2mmol/l在全自动生化分析仪上设定温度25℃，反应时间20分钟，测试主波长578nm，测试副波长700nm以上，被测离子钙样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应。
具体测定步骤为磷脂+水磷脂酶-D/Ca++磷脂酸+胆碱胆碱+2氧+水胆碱氧化酶甜菜碱+2过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长578nm吸光度上升的速度，从而测算出离子钙的含量大小。
实施例四本实施例的离子钙诊断试剂有试剂I缓冲液 100mmol/l
磷脂2mmol/l胆碱氧化酶 6000U/l过氧化物酶 8000U/l稳定剂 50％(总体积)4-氨基抗砒 1mmol/l试剂II缓冲液 100mmol/l磷脂酶(需钙离子激活)60000U/l稳定剂 50％(总体积)双甲基苯胺 2mmol/l测定离子钙含量时，温度控制在30℃，反应时间10分钟，测试主波长578nm，测试副波长700nm以上，被测离子钙样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应磷脂+水磷脂酶-D/Ca++磷脂酸+胆碱胆碱+2氧+水胆碱氧化酶甜菜碱+2过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长578nm吸光度上升的速度，从而测算出离子钙的含量大小。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。
权利要求
1.一种离子钙含量测定方法，步骤如下1)、将样品与主要由磷脂、磷脂酶(需钙离子激活)、胆碱、氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成的试剂混合，使之发生如下反应磷脂+水磷脂酶-D/Ca++磷脂酸+胆碱胆碱+2氧+水胆碱氧化酶甜菜碱+2过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水2)、检测最终反应物在主波长400——600nm吸光度上升的速度，测算出离子钙含量的大小。
2.根据权利要求1所述离子钙含量测定方法，其特征在于所述步骤2)为将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪下，检测主波长400——600nm吸光度上升的速(程)度，测算出离子钙的含量。
3.根据权利要求1或2所述离子钙含量测定方法，其特征在于温度控制在20℃到50℃范围，反应时间控制在2-30分钟。
4.根据权利要求1或2所述离子钙含量测定方法，其特征在于被测离子钙样品与试剂的比例控制在1/10到1/500。
5.一种离子钙诊断试剂盒，由以下成分组成缓冲液40——200mmol/l磷脂 1——50mmol/l磷脂酶(需钙离子激活) 5000——500000U/l胆碱氧化酶500——50000U/l过氧化物酶 500——50000U/l稳定剂 10——80％(总体积)还原型色原体组合0.1——20mmol/l
6.根据权利要求5所述离子钙诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或三剂。
7.根据权利要求5或6所述离子钙诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸铵或盐中的至少一种。
8.根据权利要求5或6所述离子钙诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲剂的pH范围是6.0～11.0，所述缓冲剂是三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、咪唑缓冲液或双甘氨肽缓冲液中的一种。
9.根据权利要求5或6所述离子钙诊断试剂，其特征在于所述还原型色原体为0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙与0.1-20mmol/l以下十四种成分之一组合而成石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-双乙基-m-甲苯胺、2，4-双氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸、3，5-双氯石碳酸磺酸、3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐、仨溴羟基苯甲酸、双甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羟基苯胺。
10.根据权利要求5或6所述离子钙诊断试剂，其特征在于所述还原型色原体组合为由0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒与0.1-20mmol/l以下十四种成分之一组合而成石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-双乙基-m-甲苯胺、2，4-双氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸、3，5-双氯石碳酸磺酸、3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐、仨溴羟基苯甲酸、双甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羟基苯胺。
全文摘要
本发明涉及一种测定离子钙含量的方法，同时本发明还涉及离子钙诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、磷脂、磷脂酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶、稳定剂、还原型色原体组合。通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况(速度)，从而测算出离子钙的含量大小。采用本发明完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
文档编号C12Q1/44GK1763222SQ200410065050
公开日2006年4月26日 申请日期2004年10月20日 优先权日2004年10月20日
发明者王尔中 申请人:王尔中