专利名称：α－葡萄糖苷酶固定化方法
技术领域：
本发明涉及一种α-葡萄糖苷酶固定化的工艺方法，属有机化学酶化学工程技术领域。
背景技术：
据报道，日本、欧美和中国都很关注低聚异麦芽糖的工业化生产和相关研究工作，作为低聚异麦芽糖工业化生产关键酶制剂α-葡萄糖苷酶，倍受国内外食品工业界的重视。而由于α-葡萄糖苷酶的稳定性和可控性欠佳，以及价格昂贵等问题，在一定程度上制约了低聚异麦芽糖的发展和应用。而酶工程的主要内容就是把游离酶固定化，称为固定化酶。采用固定化酶技术，不但能降低成本，还能提高酶的耐酸碱稳定性、热稳定性、耐有机溶剂性及储存稳定性等，而且能增强工程可控性，因此与游离酶相比，具有明显优势。
在固定化酶领域中，关键技术是交联试剂与载体的选择及其最佳匹配。目前普遍用于固定具有胺基功能载体的交联试剂是戊二醛。但该交联试剂存在一些如下问题在交联反应中醛基与胺基所形成的C＝N席夫键易于水解，特别是在较高温度时水解更严重，在固定化过程中，酶活性损失较大；在贮存中由于自动聚合而形成很多不同物质，性质不稳定；另外戊二醛也是一种有毒物质，对操作者身体不利。国外报道有一种新型的交联试剂-三羟甲基磷，可用于具有胺基功能的载体，交连反应在室温下自动进行。据报道，用该三羟甲基磷交联试剂固定化的酶有尿素酶、醇脱氢酶等，但未见用该试剂固定α-葡萄糖苷酶的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种α-葡萄糖苷酶的固定化的工艺方法。
本发明的一种α-葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于以壳聚糖为载体，用三羟甲基磷交联固定α-葡萄糖苷酶，该方法具有以下工艺步骤a.壳聚糖的预处理先制备高脱乙酰度壳聚糖，取一定量的壳聚糖，加入一定浓度的NaOH溶液，在130℃下搅拌反应时间5小时，然后水洗至中性，在105℃下干燥，经粉粹，过120目的筛，得到经预处理的壳聚糖，其脱乙酰度为93％；
b.三羟甲基磷的制备取等摩尔量的四羟甲基氯化磷和KOH，分别溶于水中，在室温和剧烈搅拌下把KOH水溶液滴加到四羟甲基氯化磷水溶液中，滴加完毕则反应结束，得三羟甲基磷；c.交联固定α-葡萄糖苷酶将前述经预处理过的壳聚糖迅速加入至上述的含有三羟甲基磷的反应液中，在室温下反应8分钟，然后过滤，并水洗残留的四羟甲基氯化磷，然后再用pH6.0，含有1mM的巯基乙醇和0.5mM的EDTA的磷酸钾缓冲液进行洗涤，最后加入浓度为0.1U/mL的α-葡萄糖苷酶1ul；在5℃下进行固定化，时间为2小时；待固定化完毕，用PH6.8的磷酸钾缓冲液洗出未交联的α-葡萄糖苷酶，然后在采用考马斯亮蓝G-250法的监测下，进一步用1M的NaCl水溶液洗尽未交联的酶，接着再依次用水、PH6.8的磷酸钾缓冲液洗涤，最后在4℃下保存存在于缓冲液中的固定化的α-葡萄糖苷酶。
固定α-葡萄糖苷酶的反应式如下所示 三羟甲基磷(THP)能与胺基物质发生Mannich反应，所以能与具有胺基功能的载体壳聚糖发生交联反应，交联反应在室温下自动进行，所形成的P-CH2-N键非常稳定，不水解，可长期保存。
上述工艺步骤中，磷酸钾缓冲液中加入巯基乙醇是防止酶在温度高和冲洗过程中失活，EDTA则是防止有重金属毒害酶。
本发明以壳聚糖为载体，用三羟甲基磷交联固定α-葡萄糖苷酶，克服了传统使用的交联剂戊二醛的不足，特别是在固定化过程中在较高温度时，使酶活性损失减少，酶的复活回收率较高。另外，本发明方法固定的α-葡萄糖苷酶的耐酸碱稳定性、热稳定性、耐有机溶剂性及储存稳定性与游离的酶和用戊二醛作交联剂固定的该酶相比，均有较大提高。
具体实施例方式
现将本发明的具体实施例叙述于后。
实施例一本实施例的具体工艺步骤如下a.壳聚糖的预处理先制备高脱乙酰度壳聚糖，取20g壳聚糖，加入350mL浓度为40％NaOH，在130℃下搅拌反应时间5小时，然后水洗至中性，在105℃干燥，经粉粹，过120目的筛，得预处理的壳聚糖，其脱乙酰度为93％。
b.三羟甲基磷(THP)的制备取等摩尔量的四羟甲基氯化磷(THPC)和KOH，分别溶于90mL和10mL的水中，在室温和剧烈搅拌下，把KOH水溶液滴加到THPC水溶液中，滴加完毕则反应结束。该反应液中所得到的三羟甲基磷(THP)的浓度为2.5mg/ml。
c.交联剂固定α-葡萄糖苷酶将前述经处理过的壳聚糖70mg迅速加入于上述100ml含三羟甲基磷的反应液中(浓度为2.5mg/ml，则相当于250mg三羟甲基磷)，在室温反应8分钟。然后进行过滤，并用水洗残留的三羟甲基磷(THP)，然后用pH6.0，含有1mM的巯基乙醇和0.5mM的EDTA的磷酸钾缓冲液洗涤，，最后加入1ulα-葡萄糖苷酶(0.1U/mL)，在5℃下进行固定化，固化时间为2小时；待固定化完毕，用PH6.8的磷酸钾缓冲液洗出未交联的α-葡萄糖苷酶，然后在采用考马斯亮蓝G-250法的监测下，进一步用1M的NaCl水溶液洗尽未交联的酶，接着依次用水、PH6.8的磷酸钾缓冲液洗，最后在4℃下保存存在于该缓冲液中的α-葡萄糖苷酶。
本发明实施例中，对壳聚糖的预处理，其脱乙酰度的高低及壳聚糖的颗粒大小均直接影响着α-葡萄糖苷酶的固定化，本实施例中，脱乙酰度为93％，粒度过120目筛是比较适宜的，它能使交联剂载体的酶增多。
本实施例中，所用的四羟甲基氯化磷(THPC)和KOH是等摩尔量，KOH不能过量，过量的OH-会催化加速生成没有固定化能力的(HOCH2)3P＝O (THPO)和壳聚糖-CH2(HOCH2)2P＝O，不利于固定化过程。本实施例中采用四羟甲基氯化磷(THPC)来制取三羟甲基磷(THP)，其原因是THPC是一种工业化大生产的阻燃剂，价格便宜，易于购得，可降低制造成本。
经实验测定，本实施例中1μm游离α-葡萄糖苷酶(0.1u/ml)的OD(吸光度)为0.8，采用三羟甲基磷固定化的α-葡萄糖苷酶的OD为0.229，未被交联固定的α-葡萄糖苷酶的OD为0.244，由计算而得固定化酶回收率为41.2％。
α-葡萄糖苷酶能水解底物PNPG产生对硝基苯酚(PNP)，PNP在400nm处有最大紫外吸收，所以α-葡萄糖苷酶的活性可通过测定PNP在400nm处的吸光度OD值来测定。本实施例中采用UV-260型等外分光光度计在400nm处测定PNP吸光度OD值。
通过实验表明，三羟甲基磷交联剂固定的α-葡萄糖苷酶具有较好的物理化学性能(1)有较强的耐酸碱能力，它在PH4.0条件下连续操作4小时，活性基本没变化；在有底物PNPG的碳酸钠溶液(0.1mol/L，PH＝10)中在37℃水浴下10分钟，它的活性仅减少15％，而用戊二醛交联固定的该酶其活性减少62％；游离的α-葡萄糖苷酶则马上失活。
(2)耐有机溶剂能力强，它能在甲醇∶磷酸钾(PH6.8)缓冲液＝1∶1中正常地水解底物PNPG，在甲醇∶磷酸钾(PH6.8)缓冲液＝1∶2中水解底物PNPG的能力比正常情况下高58.5％。
(3)热稳定性剂储存稳定性高，固定化的α-葡萄糖苷酶的热稳定性剂储存稳定性要比游离α-葡萄糖苷酶高出很多，在160℃下的半衰期为17小时。
权利要求
1.一种α-葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于以壳聚糖为载体，用三羟甲基磷交联固定α-葡萄糖苷酶，该方法具有以下工艺步骤a.壳聚糖的预处理先制备高脱乙酰度壳聚糖，取一定量的壳聚糖，加入一定浓度的NaOH溶液，在130℃下搅拌反应时间5小时，然后水洗至中性，在105℃下干燥，经粉粹，过120目的筛，得到经预处理的壳聚糖，其脱乙酰度为93％；b.三羟甲基磷的制备取等摩尔量的四羟甲基氯化磷和KOH，分别溶于水中，在室温和剧烈搅拌下把KOH水溶液滴加到四羟甲基氯化磷水溶液中，滴加完毕则反应结束，得三羟甲基磷；c.交联固定α-葡萄糖苷酶将前述经预处理过的壳聚糖迅速加入至上述的含有三羟甲基磷的反应液中，在室温下反应8分钟，然后过滤，并水洗残留的四羟甲基氯化磷，然后再用pH6.0，含有1mM的巯基乙醇和0.5mM的EDTA的磷酸钾缓冲液进行洗涤，最后加入浓度为0.1U/mL的α-葡萄糖苷酶1ul；在5℃下进行固定化，时间为2小时；待固定化完毕，用PH6.8的磷酸钾缓冲液洗出未交联的α-葡萄糖苷酶，然后在采用考马斯亮蓝G-250法的监测下，进一步用1M的NaCl水溶液洗尽未交联的酶，接着再依次用水、PH6.8的磷酸钾缓冲液洗涤，最后在4℃下保存存在于缓冲液中的固定化的α-葡萄糖苷酶。
全文摘要
本发明涉及一种α－葡萄糖苷酶固定化的工艺方法，属有机化学酶化学工程技术领域。本发明的一种α－葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于以壳聚糖为载体，用三羟甲基磷交联固定α－葡萄糖苷酶，该方法具有以下工艺步骤(1)壳聚糖的预处理，使脱去乙酰基，获得高脱乙酰度的壳聚糖；(2)用四羟甲基氯化磷和KOH反应制取三羟甲基磷；(3)交联固定α－葡萄糖苷酶将前述经预处理过的壳聚糖迅速加入至上述的含有三羟甲基磷的反应液中，在室温下反应8分钟，然后过滤，水洗、磷酸钾缓冲液洗涤，最后加入浓度为0.1U/mL的α－葡萄糖苷酶1ul；在5℃下进行固定化，时间为2小时；待固定化完毕，在依次用水、磷酸钾缓冲液洗涤，最后在4℃下保存好固定化的α－葡萄糖苷酶。
文档编号C12N11/00GK1618959SQ200410067070
公开日2005年5月25日 申请日期2004年10月12日 优先权日2004年10月12日
发明者雍克岚, 吕敬慈, 卢大胜, 陈旭, 冯偲慜, 顾慧娟 申请人:上海大学