专利名称：无细胞毒性猪去细胞真皮基质的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医学皮肤组织工程技术领域，特别是涉及一种无细胞毒性猪去细胞真皮基质的制备方法；涉及以无细胞毒性猪去细胞真皮基质为支架构建组织工程复合皮的方法；涉及无细胞毒性猪去细胞真皮基质在构建组织工程复合皮和组织工程复合皮制备作为皮肤代替物的应用。
背景技术：
目前，猪去细胞真皮基质作为人体皮肤代替物的制备方法主要有酶消化法、高渗盐—去污剂处理法和平衡盐溶液法三类。其中，尤以酶消化法国内外报道最多。它是在4℃或37℃条件下，利用外源性蛋白酶的作用去除表皮结构，再辅以其它方法，如组织液浸泡和去污剂处理等，达到真皮基质无细胞化；高渗盐—去污剂处理法，是利用高渗盐溶液使锚着细丝与表皮基底细胞的半桥粒分离，完整去除表皮后，再用去污剂处理到真皮基质无细胞化。以上两种方法，制备中应用的某些化学试剂，如Tritonx-100、SDS等有极强的细胞裂解作用，难以彻底清除，致使以真皮基质为支架细胞培养成功率低，可重复性差；平衡盐溶液法，是将无菌皮片放置于37℃磷酸缓冲盐溶液中，使皮肤内源性蛋白酶激活，从而分离表皮和真皮，再用反复冻溶、γ射线照射等方法，去除全部真皮内存活细胞。但这种方法，一是生产工艺比较复杂，处理时间长，大约2周左右；二是制备过程中易污染；三是抗原性去除不彻底。
发明内容
本发明的任务之一在于提供一种化学试剂容易被清除，无抗原性，制备周期短，制作工艺简单的无细胞毒性猪去细胞真皮基质的制备方法；本发明的任务之二在于提供一种细胞培养成功率高，可重复性好的组织工程复合皮的制备方法；本发明的任务之三在于提供一种无细胞毒性猪去细胞真皮基质在构建组织工程复合皮和组织工程复合皮制备作为人体皮肤代替物的应用。
本发明所说的无细胞毒性猪去细胞真皮基质的制备方法，将反削成0.3-0.4mm厚的干净、无菌猪皮，在经三蒸水配置的含高渗盐水中浸泡获得的真皮基质，置于三蒸水配置的含0.5Mol/L氢氧化钠溶液中用水浴震荡器常温下持续震荡24小时，再用超声波清洗机对真皮基质用三蒸水分次震荡洗涤至少3遍，每次至少震荡洗涤10分钟，以彻底清除其中的氢氧化钠和基质中的细胞碎片。然后用磷酸平衡盐溶液漂洗5遍，置于95％的乙醇内浸泡30分钟，再用磷酸平衡盐溶液漂洗3遍后，-80℃冷冻干燥4小时，分装消毒，低温保存。
本发明所说的无细胞毒性猪去细胞真皮基质作为表皮细胞体外培养支架制备组织工程复合皮的方法，先将真皮基质置于以乙酸溶解的I型牛胶原溶液内包被后，调整PH为7.0-7.4，再将其先后置于磷酸平衡盐溶液和无血清培养基内浸泡48小时，取出在其表面接种传代后的表皮细胞后，置于温度为37℃、CO2浓度为5％的CO2孵箱内无血清培养，48小时将其升至气液面后继续培养7-10天。
本发明所说的无细胞毒性猪去细胞真皮基质的应用，实际上涉及以无细胞毒性猪去细胞真皮基质作为表皮细胞体外培养支架构建组织工程复合皮和组织工程复合皮制备作为人体皮肤代替物的应用。
为了更好地理解本发明去细胞猪皮真皮基质制备作为人体皮肤代替物的应用，和以其为支架进行表皮细胞体外培养构建的组织工程复合皮创面移植效果，下面通过本发明以猪去细胞真皮基质为支架进行细胞培养得到的组织工程复合皮与单纯培养的表皮细胞膜片修复动物创面的比较实验来加以证明。
1.表皮细胞膜片和组织工程复合皮的制备取SD乳大鼠全层皮肤，用DispaseII-胰蛋白酶消化为细胞悬液后，采用Gibco公司提供的无血清培养基进行表皮细胞体外培养，取第二代细胞分别接种于两组直径为60mm的培养皿内，接种密度为0.25×106/cm2，隔日换液，10天后即获得单纯培养的表皮细胞膜片和本发明含有复层表皮的组织工程复合皮。
2.实验方法取健康SD大鼠42只，雌雄不限，体重205-250g。每只实验鼠用3％戊巴比妥钠按50mg/Kg行腹腔麻醉后，背部去毛，切掉直径约4cm的全厚皮肤，随机分为两组。一组用含有复层表皮的组织工程复合皮移植覆盖，另一组用单纯培养的表皮细胞膜片移植覆盖。两组大鼠创面移植后均用凡士林纱布及无菌敷料覆盖，打包固定，动物单笼饲养。术后2周、4周、6周观察创面愈合率，计算收缩率，同时取移植物组织进行组织学观察。
3.实验结果(1)大体观察与表皮细胞膜片组相比，组织工程复合皮移植组，移植物上皮化程度高，与创面基底贴附紧密，表面光滑，创面愈合好，创面愈合率明显高于表皮细胞膜片组，收缩率也明显减低(见表1、表2)。表明本发明构建的组织工程复合皮能很好地修复全层皮肤缺损，改善创面愈合质量。
表1 组织工程复合皮与表皮细胞膜片移植后创面愈合率(％，X±s)创面愈合率(％，X±s)组 别二周 四周 六周组织工程复合皮组 78.65±2.69*85.06±2.13*92.66±2.87*表皮细胞膜片组 68.23±2.23 74.17±1.96 82.19±2.35*组织工程复合皮组与表皮细胞膜片组创面愈合率比较，P＜0.05，统计学差异显著。
表2 组织工程复合皮与表皮细胞膜片移植后创面收缩率(％，X±s)创面收缩率(％，X±s)组别二周 四周六周组织工程复合皮组 11.8±2.43*18.77±3.40*25.92±3.11*表皮细胞膜片组 19.25±2.85 28.52±3.78 36.52±3.70*组织工程复合皮组与表皮细胞膜片组创面收缩率比较，P＜0.05，统计学差异显著。
(2)组织学观查术后4周，组织工程复合皮移植组，移植物组织学观查可见较完整的皮肤结构，表皮层复层结构明显，真皮层内胶原纤维排列较规整，间质内有少许炎性细胞浸润，可见丰富的毛细血管结构垂直于创面生长，而且有较多的成纤维细胞增生；术后6周，组织工程复合皮可见完整的皮肤结构，表皮层成活且分层接近正常，真皮层内胶原纤维排列规整，可见丰富的毛细血管结构垂直于创面生长。免疫组化抗Laminin染色显示，组织工程复合皮在基底膜区及真皮血管束周围呈阳性反应，基底膜区染色较深，连续性好，表皮真皮连接区的乳头结构明显；表皮细胞膜片组的移植物表皮层也有分层，但真皮内胶原纤维排列紊乱，成纤维细胞多。免疫组化抗Laminin染色显示，在基底膜区及真皮血管束周围也呈阳性反应，但是染色浅，连续性较差。
以上实验结果表明应用本发明构建的含有复层表皮的组织工程复合皮，创面愈合率明显高于表皮细胞膜片，而且移植后组织工程复合皮的收缩率较表皮细胞膜片也明显减低。表明本发明以猪去细胞真皮基质为支架构建的含有复层表皮的组织工程复合皮具有良好的创面修复效果。
本发明的优点1.获得的真皮基质不含有细胞成分，无抗原性；2.在真皮基质和组织工程复合皮的制备工艺中，分别用氢氧化钠作为脱细胞制剂和用乙酸溶解I型牛胶原包被真皮基质，化学试剂易清除，获得的真皮基质无毒性，细胞培养成功率高、可重复性好，移植后可明显改善皮肤创面愈合质量；3.制备工艺简单，制作周期短，价格低廉。
具体实施例方式
本发明无细胞毒性猪去细胞真皮基质的制备方法，将反削为0.3-0.4mm厚的猪皮皮片，洗净放在75％酒精内浸泡三次，再用无菌磷酸平衡盐水洗涤5遍，以确保应用的猪皮干净、无菌。为了去除猪皮表皮，本实施例将干净、无菌猪皮置于三蒸水配置的经过滤消毒的含1Mol/L高渗盐水中37℃浸泡36小时。然后将获得的真皮基质用三蒸水洗涤3次，放置在磷酸平衡盐溶液内浸泡2小时。取出后将其置于含0.5Mol/L的三蒸水配置的氢氧化钠溶液中，用水浴震荡器常温下持续震荡24小时，震荡频率为100次/分钟。为了彻底清除本发明制备中的氢氧化钠和基质细胞碎片，本发明真皮基质的制备，采用超声波清洗机用三蒸水分次震荡洗涤至少30分钟以上。本实施例给出的震荡洗涤遍数为4遍，每次震荡洗涤13分钟。之后，将真皮基质置于磷酸平衡盐溶液内漂洗5遍，用95％的乙醇浸泡30分钟，再用磷酸平衡盐溶液漂洗3遍后，-80℃低温冷冻干燥4小时，分装消毒，低温保存。本实施例对分装后的真皮基质采用60Co照射消毒，4℃冰箱保存。
本发明无细胞毒性猪去细胞真皮基质作为表皮细胞体外培养支架构建组织工程复合皮的方法，在无菌条件下，先用0.5％乙酸溶解I型牛胶原，调整PH为7.0-7.4，然后将真皮基质置于由乙酸溶解的I型牛胶原溶液中，用以包被真皮基质的表皮面。之后再将包被后的真皮基质先后置于磷酸平衡盐溶液和无血清培养基内，在温度为37℃、CO2浓度为5％的孵箱中浸泡。48小时取出后，在其表皮面接种体外培养的传代后的表皮细胞。然后将接种表皮细胞的真皮基质置于温度为37℃、CO2浓度为5％的孵箱中进行无血清复合培养，48小时将其升至气液面后继续进行培养，约10天左右即可获得组织工程复合皮。
本实施例给出的I型牛胶原由Sigma公司提供；无血清培养基由Gibco公司提供；真皮基质表皮面接种的表皮细胞为第二代，接种密度为0.25×106/cm2。
权利要求
1.无细胞毒性猪去细胞真皮基质的制备方法，将在三蒸水配置的含高渗盐水中浸泡获得的真皮基质，置于三蒸水配置的含0.5Mol/L氢氧化钠溶液中用水浴震荡器常温下持续震荡24小时，再用超声波清洗机对真皮基质用三蒸水分次震荡洗涤至少3遍，每次至少震荡洗涤10分钟，然后用磷酸平衡盐溶液漂洗5遍，置于95％的乙醇内浸泡30分钟，再用磷酸平衡盐溶液漂洗3遍后，-80℃冷冻干燥4小时，分装消毒，低温保存。
2.无细胞毒性猪去细胞真皮基质作为表皮细胞体外培养支架制备组织工程复合皮的方法，将真皮基质置于以乙酸溶解的I型牛胶原溶液内包被后，调整PH为7.0-7.4，再将其先后置于磷酸平衡盐溶液和无血清培养基内浸泡48小时，取出在其表面接种传代后的表皮细胞后，置于温度为37℃、CO2浓度为5％的CO2孵箱内无血清培养，48小时将其升至气液面后继续培养7-10天。
3.无细胞毒性猪去细胞真皮基质在构建组织工程复合皮和组织工程复合皮制备作为人体皮肤代替物的应用。
全文摘要
本发明，其中猪去细胞真皮基质的制备，将真皮基质置于三蒸水配置的含0.5Mol/L氢氧化钠溶液中持续震荡后，再用三蒸水和磷酸平衡盐水分别漂洗后，冷冻干燥，分装消毒；猪去细胞真皮基质作为表皮细胞体外培养支架制备组织工程复合皮的方法，将真皮基质用乙酸溶解的I型牛胶原包被后，调整pH7.0－7.4，再将其先后置于磷酸平衡盐溶液和无血清培养基内浸泡，取出接种传代后的表皮细胞后，再将其置于CO
文档编号C12N5/06GK1587390SQ20041006939
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月22日 优先权日2004年7月22日
发明者柴家科, 马忠锋, 杨红明, 刘强 申请人:中国人民解放军三○四医院