专利名称：硫酸盐还原原核生物检测的组合基因探针及其检测方法
技术领域：
本发明属于微生物检测技术领域，特别涉及利用分子微生物生态学的荧光原位杂交技术，应用组合基因探针对油田外排水中硫酸盐还原原核生物进行检测的方法。
背景技术：
对油田外排水中硫酸盐还原原核生物(Sulfate reducing prokaryotes，SRPs)的检测通常局限于硫酸盐还原细菌(Sulfate reducing bacteria，SRB)的检测，其所用的方法为绝迹稀释法(参见中国石油天然气总公司的行业标准SY/T5329-94)。这种方法通过对SRB进行培养，根据SRB对特定培养基的反应来判断油田外排水中SRB的数量。由于人工无法完全模拟自然环境的各种条件，人类无法在实验室中培养出自然界中所有的微生物，实际上，利用培养的方法只能检测出自然界中少量的微生物，培养菌种不全面，所以目前广泛采用的绝迹稀释法并不能精确反映水样中SRPs总菌情况，因而在石油开采过程对SRPs监控无法准确，严重影响石油开采技术的实施。另一方面，目前广泛采用的、传统的绝迹稀释法对SRB培养通常需要两个星期以上的时间，无法对石油开采过程进行及时监控，无法对杀菌等操作进行及时调整。同时，绝迹稀释法要求厌氧操作，操作复杂，易受污染，结果不准确。总之，目前广泛采用的绝迹稀释法对SRB的检测不能准确地反映外排水的真实情况，无法很好地指导石油开采的生产和技术实施。
最近发展的分子微生物生态学的荧光原位杂交(FISH)技术，其工作原理是对微生物具有家族特异性的高度保守的核酸片断序列进行检测，简单来说是根据微生物16SrRNA序列中具有家族特异性的高度保守的核酸片断序列设计基因探针，然后通过杂交反应使探针与检测的目标序列相杂交，通过对探针上带有的荧光进行检测可以检测到带有目标核酸片段的微生物细胞。大量实践证明了这种方法对微生物检测的直观、准确、快速、易操作等优点。
目前常规的FISH分析是利用单一探针来对特定微生物进行检测，而SRPs在“16SrRNA进化史树”上则分属于不同的“进化史树树枝”上，单一基因探针无法包含所有SRPs的进化史信息，因而无法对所有的SRPs进行检测。本发明通过对各组SRPs的16SrRNA序列进行系统分析，根据在油田广泛存在的124种SRPs的16SrRNA序列确定了8个基因探针序列，首次对这8个基因探针进行了不同比例的组合，形成组合基因探针；首次利用基因探针对油田外排水中全部SRPs进行了检测，结果表明这种组合基因探针能很好地检测油田外排水中的SRPs。该发明利用基因探针系统和全面地对油田外排水中SRPs进行检测，克服了传统的绝迹稀释法的种种缺点，可以快速、准确和有效地指导油田生产。
发明内容
本发明的目的是为克服目前广泛采用的绝迹稀释法耗时、检测不全面等缺点，提出一种新的用于油田外排水中硫酸盐还原原核生物检测的组合基因探针及其检测方法，能够对油田外排水中SRPs快速、全面、精确、便捷地检测，可以实现对采油过程及时、准确的调控。
本发明提出的一种硫酸盐还原原核生物检测的组合基因探针，其特征在于，由SRPs中的8个基因序列的两种或两种以上组合而成，所述8个基因序列为探针 探针碱基序列探针I TCCACTTCGGTCTCCCAT探针II CCGGCTCCAGTACTCAAG探针III CAACGTTTACTGCATAAT探针IV ACCGGTATTCCTCCCCAT探针V CCCAGATATCAGGGTAGA探针VI TCGGGCAGTTATCCCGGG探针VII CAGGCGGATCACTTAATG探针VIIICCCCGGTAAGCTTCCCGG本发明提出的硫酸盐还原原核生物的检测方法，包括以下步骤1)从油田外排水中的SRPs筛选出上述8个基因序列作为检测的基因探针，2)选取所述8个基因探针之中的两个或两个以上制成组合基因探针溶液(其中各探针的相对比例可任意选取)；3)从待检测的油田外排水中取水样品，用浓度为2-10％的异多醛溶液固定该水样品中的微生物细胞；4)取所述固定好的微生物细胞水样品1-10μl滴入载玻片中，在室温下对载玻片上的固定微生物样品进行干燥；再利用50％-100％的酒精对该载玻片上的微生物样品脱水；5)在该载玻片上的水样品上加入所述的1-10μl组合基因探针溶液，加入浓度为2.0-5.5M的NaCl和浓度为10％-40％甲酰胺的杂交溶液，在34-62℃的反应温度下杂交1-2.5小时；6)用pH8浓度为1.2M的磷酸盐缓冲溶液清洗该载玻片上的探针溶液10-30分钟，再用蒸馏水清洗该载玻片上水样品，后干燥；7)用荧光显微镜观察该载玻片上微生物样品，对其中带有荧光的SRPs细胞进行计数。根据载波片上孔洞的面积以及样品的体积，计算样品中总SRPs的数量。
本发明的特点和积极效果本发明利用新近发展的FISH手段，首次开发了能够全面检测油田外排水中SRPs的组合基因探针，研究确定了组合基因探针检测SRPs的最优工作条件，首次对油田外排水中SRPs进行了检测。通过对油田外排水中存在的各种SRPs的检测分析，了解了目前在中国采油外排水普遍存在的124种SRPs，基于此确定了能够检测这124种SRPs的8个基因探针序列，而对8个基因探针进行组合设计的组合基因探针则能够对油田外排水中常见的124种SRPs很好地进行检测。
利用本发明的组合基因探针对硫酸盐还原原核生物的检测方法克服了广泛采用的绝迹稀释法耗时、培养菌种不全面的缺点。绝迹稀释法需要两个星期以上才有检测结果，并且该方法能检测油田外排水中所有的124种SRPs，比绝迹稀释法所能检测出的SRPs种属要多得多。该方法准确、直观、快速、而且操作方便易于掌握，成本小得多，整个样品检测时间仅为10-12小时。能够及时反应油田排水的情况，可以实现对采油过程及时、准确的调控。准确地指导油田生产实践。
具体实施例方式
本发明提出的检测方法结合实施例作进一步说明。
实施例一、胜利油田孤岛采油厂外排水样中的SRPs进行检测1)制备组合基因探针溶液，将本发明的8种探针I-VIII，以相对比例为15％，8％，16％，11％，15％，10％，6％和19％制成组合基因探针溶液；2)从油田外排水中取水样品，用浓度为2％的异多醛溶液固定该水样品中包括SRPs在内的微生物细胞；3)取上述固定好的微生物细胞水样品3μl滴入载玻片中，在室温下对载玻片上的固定微生物样品进行干燥，再用50％、80％和100％的酒精依次对该载玻片上的微生物样品脱水；4)在该载玻片上的水样品上加入所述的3μl组合基因探针溶液，加入含2.0M的NaCl和10％甲酰胺的杂交溶液，在40℃的反应温度下杂交1小时；5)用清洗液(磷酸盐缓冲溶液，1.2M，pH8)清洗该载玻片上的探针溶液20分钟，再用蒸馏水清洗该载玻片上水样品5次，后干燥；6)用荧光显微镜观察该载玻片上微生物样品，对其中带有荧光的SRPs细胞进行计数。根据载波片上孔洞的面积以及样品的体积，计算样品中总SRPs的数量。
本实施例方法的检测结果表明，油田外排水中SRPs的相对含量为20％，绝对数量为8.3×106个/l。
实施例二胜利油田胜利采油厂外排水样中的SRPs进行检测1)制备组合基因探针溶液，将本发明的4种探针I、IV、V和VII，以相对比例为15％，30％，20％和35％制成组合基因探针溶液；2)从油田外排水中取水样品，用浓度为8％的异多醛溶液固定该水样品中包括SRPs在内的微生物细胞；3)取上述固定好的微生物细胞水样品10μl滴入载玻片中，在室温下对载玻片上的固定微生物样品进行干燥，再用50％、80％和100％的酒精依次对该载玻片上的微生物样品脱水；
4)在该载玻片上的水样品上加入所述的10μl组合基因探针溶液，加入含5.5M的NaCl和40％甲酰胺的杂交溶液，在52℃的反应温度下杂交1.5小时；5)用清洗液(磷酸盐缓冲溶液，1.2M，pH8)清洗该载玻片上的探针溶液10分钟，再用蒸馏水清洗该载玻片上水样品10次，后干燥；6)用荧光显微镜观察该载玻片上微生物样品，对其中带有荧光的SRPs细胞进行计数。根据载波片上孔洞的面积以及样品的体积，计算样品中总SRPs的数量。
本实施例方法的检测结果表明，油田外排水中SRPs的相对含量为26％，绝对数量为1.5×106个/l。
实施例三胜利油田东辛采油厂外排水样中的SRPs进行检测1)制备组合基因探针溶液，将本发明的2种探针IV和VI，以相对比例为65％，35％制成组合基因探针溶液；2)从油田外排水中取水样品，用浓度为10％的异多醛溶液固定该水样品中包括SRPs在内的微生物细胞；3)取上述固定好的微生物细胞水样品1μl滴入载玻片中，在室温下对载玻片上的固定微生物样品进行干燥，再用50％、80％和100％的酒精依次对该载玻片上的微生物样品脱水；4)在该载玻片上的水样品上加入所述的1μl组合基因探针溶液，加入含3.5MNaCl，30％甲酰胺的杂交溶液，在62℃的反应温度下杂交2.5小时；5)用清洗液(磷酸盐缓冲溶液，1.2M，pH8)清洗该载玻片上的探针溶液30分钟，再用蒸馏水清洗该载玻片上水样品7次，后干燥；6)用荧光显微镜观察该载玻片上微生物样品，对其中带有荧光的SRPs细胞进行计数。根据载波片上孔洞的面积以及样品的体积，计算样品中总SRPs的数量。
本实施例方法的检测结果表明，油田外排水中SRPs的相对含量为28％，绝对数量为6.7×106个/l。
通过和绝迹稀释法对比的结果表明该方法的检测结果更全面，更加切实可行。
上述各实施例中的所采用的探针组合，及具体条件参数均只用于说明如何实现本发明方法的举例，不能用以限制各权利要求中确定的保护范围，本发明方法适用于8种探针之中的任意2种以上的组合，均可应用于油田回注水种SRPs的检测。
在实际应用中各种探针组合方式可根据油田具体采油厂的情况而定，通常首先利用8种探针的各种组合进行分析，再确定该采油厂的最佳探针组合方式(2种以上探针的组合)，形成的组合基因探针可以应用于该采油厂SRPs的日常检测。
权利要求
1.一种硫酸盐还原原核生物检测的组合基因探针，其特征在于，由SRPs中的8个基因序列的两种或两种以上组合而成，所述8个基因序列为探针 探针碱基序列探针I TCCACTTCGGTCTCCCAT探针II CCGGCTCCAGTACTCAAG探针IIICAACGTTTACTGCATAAT探针IV ACCGGTATTCCTCCCCAT探针V CCCAGATATCAGGGTAGA探针VI TCGGGCAGTTATCCCGGG探针VIICAGGCGGATCACTTAATG探针VIII CCCCGGTAAGCTTCCCGG。
2.一种硫酸盐还原原核生物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤1)从油田外排水中的SRPs筛选出8个基因序列作为检测的基因探针，包括探针探针碱基序列探针I TCCACTTCGGTCTCCCAT探针II CCGGCTCCAGTACTCAAG探针III CAACGTTTACTGCATAAT探针IV ACCGGTATTCCTCCCCAT探针V CCCAGATATCAGGGTAGA探针VI TCGGGCAGTTATCCCGGG探针VII CAGGCGGATCACTTAATG探针VIIICCCCGGTAAGCTTCCCGG2)选取所述8个基因探针之中的两个或两个以上制成组合基因探针溶液；3)从待检测的油田外排水中取水样品，用浓度为2-10％的异多醛溶液固定该水样品中的微生物细胞；4)取所述固定好的微生物细胞水样品1-10μl滴入载玻片中，在室温下对载玻片上的固定微生物样品进行干燥；再利用50％-100％的酒精对该载玻片上的微生物样品脱水；5)在该载玻片上的水样品上加入所述的1-10μl组合基因探针溶液，加入浓度为2.0-5.5M的NaCl和浓度为10％-40％甲酰胺的杂交溶液，在34-62℃的反应温度下杂交1-2.5小时；6)用pH8浓度为1.2M的磷酸盐缓冲溶液清洗该载玻片上的探针溶液10-30分钟，再用蒸馏水清洗该载玻片上水样品，后干燥；7)用荧光显微镜观察该载玻片上微生物样品，对其中带有荧光的SRPs细胞进行计数。根据载波片上孔洞的面积以及样品的体积，计算样品中总SRPs的数量。
全文摘要
本发明涉及硫酸盐还原原核生物检测的组合基因探针及其检测方法，属于微生物检测技术领域。该组合基因探针由SRPs中的8个基因序列的两种或两种以上组合而成，该检测方法为取水样品，用异多醛溶液固定该水样品中的微生物细胞；滴入载玻片中，进行干燥、脱水后加入所述的组合基因探针溶液，再加入NaCl和甲酰胺的杂交溶液，杂交后；用磷酸盐缓冲溶液清洗该载玻片上的探针溶液，再用蒸馏水清洗该载玻片上水样品，后干燥；用荧光显微镜观察该载玻片上微生物样品，对其中带有荧光的SRPs细胞进行计数。本发明能够对油田外排水中SRPs快速、全面、精确、便捷地检测，可以实现对采油过程及时、准确的调控。
文档编号C12Q1/68GK1635162SQ200410086710
公开日2005年7月6日 申请日期2004年10月29日 优先权日2004年10月29日
发明者吴晓磊, 曾景海, 屈睿, 晏芸 申请人:清华大学