专利名称：一种通过子房滴注获得转基因植物的方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域。涉及一种通过子房滴注获得转基因植物的基因转化方法，可应用于有花植物，无需经过原生质体培养、细胞培养、组织培养以及再生植株等遗传转化过程。
背景技术：
长期以来，为了将外源功能基因导入植物中，人们曾经探索了多种转化方法(朱生伟等，外源DNA直接导入受体植物的研究进展，植物学通报，2000，17，11-16)，目前较为完善并被广泛使用的是基因枪和农杆菌介导两种转化方法。此外，我国学者建立的花粉管通道法[Zhou GY，Weng J，Introduction of exnogenous DNA into cotton embryos，Method inEnzymology，1983，(101)433-448]在棉花、大豆等作物中也有应用[Luo ZX，WU R，ASimple method for transformation of rice via the pollen-tube pathway，PlantMolecular Biology Reporter，1989，7(1)69-77；李长缨，简元才，花粉管通道法在植物遗传转化中的应用，生物学杂志，2000，17(1)9-10；曾君祉，吴有强，王东江等，花粉管通道(或运载)法转化的植株后代遗传表现及转化机理的探讨，科学通报，1998，43(6)561-566；王罡，张艳贞，魏松红等，花粉管通道法将Bt毒蛋白基因导入优良玉米自交系，吉林农业大学学报，2002，24(4)40-44；崔岩，杨庆凯，周思军，利用花粉管通道技术导入大豆抗病虫目的基因，生物技术，2002，12(6)5-7]。
目前广泛应用的基因枪和农杆菌介导的植物转化方法，始终存在选择标记基因和载体骨架序列等非目的基因外源DNA片段引起的潜在安全性问题。以消除选择标记基因和载体骨架序列为目标，国内外许多实验室近年来采用了多种策略进行大量的研究和不断的改进并且取得了一些进展[Goldsbrough AP，Lastrella CN，Yoder JI，Transposition mediatedrepositioning and subsequent el imination of marker genes from transgenic tomato，Biotechnology，1993，111286？292；Ow DW，Medberry SL，Genome manipulationthrough site-specific recombination，Crit Rev Plant Sci，1995，14239-261；Iamtham S，Day A，Removal of antibiotic resistance genes from transgenic tobaccoplastids，Nat Biotechnol，2000，181172-1176；Daniell H，Muthukumar B，Lee SB，Marker free transgenic plantsengineering the chloroplast genome without theuse of antibiotic selection，Curr Genet，2001，39109-116；Ow DW，Recombinase-directed plant transformation for the post-genomic era，Plant Mol Biol，2002，48(1-2)183-200]。但目前的研究结果离实际应用还存在很大的距离。此外，由于设计原理和操作规程本身的限制，在这两种转化方法基础上寻找到可以完全消除非目的基因外源DNA片段的有效途径，将是一个十分困难的工作。因此，探讨建立一种新的可以完全消除非目的基因外源DNA片段的实用的转化方法，具有十分重要的意义。
70年代末，我国科学家在远缘杂交的基础上，通过授粉时混入异源花粉匀浆的方法，在后代中发现了对应性状的变异，从而推测可能有异源DNA参与了受精过程，并建立了花粉管通道转化方法[Zhou GY，Weng J，Introduction of exnogenous DNA into cottonembryos，Method in Enzymology，1983，(101)433-448；龚蓁蓁，沈蔚芳，周光宇等，授粉后外源DNA导入植物技术胎NA通过花粉管通道进入胚囊，中国科学(B)，1988(6)611-614]，将外源DNA溶液在开花后加到受体植物的柱头上，在受精的同时，外源DNA经过花粉管进入合子，从而完成对合子的转化。通过对植物受精过程的研究发现，在受体组织中同时具备再生感受态和转化感受态的细胞是转化成功的关键[Potrykus I，Gene transfermethods for plants and cell cultures，Ciba Found Symp，1990，154198-208]。当受精过程开始后，卵细胞发生急剧的脱分化过程；形成合子后，彻底消除了以前的分化特性，变成核大、质浓和分裂活跃的细胞，具有再生及转化感受态细胞的特点[龚蓁蓁，沈蔚芳，周光宇等，授粉后外源DNA导入植物技术朌NA通过花粉管通道进入胚囊，中国科学(B)，1988(6)611-614]。亚显微结构的观察揭示，在精子进入时，卵细胞的细胞壁还未形成，一些壁物质分散地聚集在细胞膜的表面[谢道昕，范云六，倪万潮等，苏云金杆菌(Bacillus huringiensis)杀虫晶体蛋白基因导入棉花获得转基因植株，中国科学，1991〔4〕367-373；谢道昕，范云六，倪丕仲等，苏云金杆菌杀虫基因导入水稻栽培品种中花11号获得转基因植株，中国科学，1991，(8)830-834]。因此这些卵细胞类似未完全酶解的原生质体，为外源基因的进入提供了可能性。邓德旺等(邓德旺，郭三堆，杨志民，棉花花粉管通道法转基因的分子细胞学机理研究，云南大学学报，1999，S3，124-125)采用激光共聚焦显微技术验证了棉花花粉管通道转化的可行性，外源DNA以高亲合力荧光探针标记后导入授粉后的子房，通过Leica共聚焦激光扫描显微镜观察到，花粉管从花柱进入中轴胎座时，需要经过一个折向，沿着中轴座的外周向下生长，在胚珠着生处再折向进入珠孔。外源DNA经过胎座上部分传输组织中的花粉管外缝隙、胎座表面、珠孔、花粉管通道进入胚囊，可以直接转化处于融合期无壁的生殖细胞或受精卵。黄国存等[黄国存，董越梅，孙敬三，以GFP为标记用花粉管通道途径导入外源DNA，科学通报，1998，43(23)2531-2533]利用绿色荧光素酶基因进行的工作也验证了花粉管通道是外源基因进入胚囊实现转化的可能途径之一。
花粉管通道法由于不依赖于组织培养和再生植株等体外培养过程，当年即可获得转化植株，只需3-4代即可获得遗传稳定的转基因品系。但是，由于外源基因导入的唯一途径是花粉管这一花粉萌发时向胚珠方向延伸的微细管道，因此在实际操作中也存在很多问题如进行外源基因转化目标植物的工作时间受自然花期限制，同时必须充分了解每一种植物的开花受精的时间过程；在自然田间进行操作，受环境条件的影响很大；由于转基因以随机的方式整合进入受体染色体基因组中，故转基因工程植株的后代的遗传情况较为复杂；花粉管通道法的操作的经验性很强，需要一定的技术摸索和技巧；另一方面，对单籽粒的小花农作物的操作难度较大，由于获得大量的转基因种子比较困难，故工作效率也较低[倪万潮，郭三堆，贾士荣，花粉管通道法介导的棉花遗传转化，中国农业科技导报，2000(2)27-31]。此外，由于该技术可控性差、操作程序难以统一、转化效果不稳定、重现性差等原因，国际上对其方法的可行性仍存在争论(Shou HX，Palmer RG，Wang K，Irreproducibility of theSoybean Pollen-Tube Pathway Transformation Procedure，Plant Molecular BiologyReporter，2002，20325？34)。
发明内容
本发明的目的是提供一种在植物授粉后一定时期，完全切除花柱，并在子房上造成切口，使外源DNA通过子房滴注进入胚囊，直接转化处于融合期无壁的生殖细胞或受精卵，以达到遗传转化。该方法可以应用于任何有花植物，易于统一操作标准，不需要经过组织培养过程，并可应用无载体、无选择标记的线性基因转化元件，解决常规植物基因工程操作中由载体骨架序列和选择标记基因所引起的转基因植物安全性问题，具有适用范围广、安全、简便、标准化、高转化率和可重复性的特点，可以较好地解决当前普遍应用的植物基因转化方法带来的问题。
本发明的技术解决方案是，在植物授粉后花粉粒萌发、雄核通过花粉管通道进入胚囊后，完全切除花柱及0-1.0mm的子房，在子房切口处滴注外源DNA，使其通过子房进入胚囊，直接转化处于融合期无壁的生殖细胞或受精卵，达到遗传转化之目的。
本发明提供的植物基因转化方法，不需要经过原生质体培养、细胞培养、组织培养以及再生植株等遗传转化过程。
本发明提供的植物基因转化方法中所述的外源DNA，包括环形脱氧核糖核苷酸序列，或线性的脱氧核糖核苷酸序列。
本发明提供的植物基因转化方法，其特征在于通过应用仅由表达调控序列和外源功能基因组成的基本元件进行转化，实现无选择标记基因和载体骨架序列的转化过程，能够解决应用基因枪和农杆菌介导的植物转化方法中始终存在的选择标记基因和载体骨架序列等非目的基因外源DNA片段引起的潜在安全性问题。
本发明提供的植物基因转化方法，完全切除花柱，可缩短外源DNA进入胚囊的距离，降低转化操作中的复杂程度，操作程序易于控制，重复性好。
本发明提供的植物基因转化方法，切除子房顶端0-1.0mm后，在子房切口处滴注外源DNA，使其进入胚囊，直接转化处于融合期无壁的生殖细胞或受精卵，不同的转化对象转化效率可达到1-30％，且不影响植物的结实。
本发明所达到的有益效果是，能够应用于任何有花植物，易于统一操作标准，能够显著提高转化效率，并可应用无载体、无选择标记的线性基因转化元件，具有适用范围广、安全、简便、标准化、高转化率和可重复性的特点。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步的说明。
实施例1应用染色剂模拟子房滴注法转化过程的研究玉米自交系沈137、C8605-2、16母和9818由辽宁东亚种苗公司提供，L87由大连市农科院提供，LD009和LD002由沈阳隆迪种业有限公司提供。大豆品种为铁丰30和铁丰31，由辽宁省大豆研究所提供。中性红染色剂溶液按照常规方法配制，使用实体解剖镜观察滴注中性红染色剂的实验材料。荧光染色剂hoechst 33258购自碧云天生物技术研究所，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释至终浓度为10μg/ml，使用荧光显微镜观察滴注荧光染色剂溶液的实验材料。
玉米转化应用本发明提供的方法，在授粉后一定时间内切除全部花柱或部分子房，然后将外源DNA溶液滴注在切口处，使其直接地渗入到子房中。按常规方法进行雌、雄花套袋隔离，雄花套袋隔离24小时后对雌花进行授粉，授粉后16小时-20小时，沿玉米雌穗纵向将苞叶剥开(但不要将苞叶剥离雌穗，以免影响结实)，将露出的几行玉米花柱在基部与子房连接处进行切除。切除时可略带子房顶端部分，但不要超过1.0mm。
考虑到玉米花柱长度对转化效率的影响，分别切除花柱使其剩余3cm或1cm，或将花柱全部去掉并切除子房0-1mm后滴注中性红。从花柱全部切除后滴注中性红溶液的子房外观观察来看，中性红溶液可以使子房充分染色。子房剖面观察的结果表明，切除部分花柱和花柱全部去掉并切除子房0-1mm均可使滴注的溶液进入子房，但后者的溶液进入量明显增加。花柱全部切除并切除子房0-1mm后，将荧光染色剂溶液直接滴注子房的结果表明，与滴注柱头的方法相比，子房中荧光反应强度明显增强，说明子房滴注可使荧光染色剂溶液进入量显著增多。
大豆转化应用本发明提供的方法，下午3时左右开始选取正在盛开、颜色鲜艳的花，每节只选取1-2朵花，其余的花朵(旁侧花朵)去除或者保留。用镊子去掉翼瓣和龙骨瓣后，用剪子分别切除不同长度的雌蕊，包括切除部分花柱，全部切除花柱并切除部分子房0-1mm和切除部分子房1-2mm三种处理，分别滴注5μL的中性红溶液进行转化过程研究，第二天取样观察。对不同处理的大豆子房剖面观察结果表明，切除部分花柱后中性红溶液进入子房的量很少；全部切除花柱并切除部分子房0-1mm后溶液进入子房的量增多，顶部胚囊已被染色；切除部分子房1-2mm后溶液可大量进入子房，但对结荚率有较大影响。
实施例2子房滴注法转化对植物结实率和转化率的影响大豆品种为铁丰30，由辽宁省大豆研究所提供。按前述方法转化，对切除不同长度雌蕊，包括完全切除花柱(切除子房0mm)，切除部分子房0-1mm，和切除部分子房1-2mm)，在切口处分别滴注0.1×SSC溶液，研究不同处理对转化材料结荚率的影响；为了检测子房滴注法的转化效率，将制备好的仅含有调控序列和外源基因的线性转化元件溶液100μl(DNA浓度为100ng/μl)滴注在子房切口处，对照植株只转化0.1×SSC溶液。
玉米品种为玉米自交系沈137、C8605-2、16母和9818由辽宁东亚种苗公司提供，L87由大连市农科院提供，LD009和LD002由沈阳隆迪种业有限公司提供。转化方法同前述。为了检测子房滴注法的转化效率，将制备好的仅含有调控序列和外源基因的转化元件溶液100μl(DNA浓度为100ng/μl)滴注在子房切口处，对照植株只转化0.1×SSC溶液。全部滴完后，将完成滴注的子房周围刻上记号，但不要切伤雌穗；再将剥开的苞叶合上，用细绳轻轻系上，套袋；20天后，去除隔离袋，成熟后收获种子。
结果表明，切除不同长度的雌蕊对大豆的结荚率有一定程度的影响，其中以完全切除花柱的结荚率最高，随着子房切除程度加大，结荚率虽然有一定的下降，但仍维持在较高的程度(表1)。
表1 铁丰30不同处理对豆荚形态的影响
子房滴注法处理后转化材料的结实率有所下降，但仍可获得足够的T1代种子供检测用。但由于切除花柱至部分子房，有利于滴注的溶液大量进入子房，因而可增加转化效率。以PCR方法为主对T1代转化材料批量筛选。对玉米3582株和大豆142株共计13份转化材料进行了检测，获得PCR检测玉米阳性材料3份，大豆阳性材料5份。其中，玉米的PCR阳性检出率为1.3-15.4％，平均阳性检出率为2.4％；大豆的PCR阳性检出率为8.3-25.0％，平均阳性检出率为14.8％。采用Southern blot、PCR产物测序方法对PCR方法检测的阳性植株进行进一步检测，目前已获得外源基因已整合到植物基因组中比较充分的实验证据。
实施例3子房滴注法转化大豆对豆荚形态的影响大豆品种为铁丰30，由辽宁省大豆研究所提供。操作方法同前述，用剪子分别切除不同长度的雌蕊，包括完全切除花柱(切除子房0mm)，切除部分子房0-1mm，和切除部分子房1-2mm)，以未作处理的大豆为对照，分别滴注5μl0.1×SSC，研究不同处理对转化材料豆荚生长状态和结荚率的影响。结果表明(表1)，未作任何处理的豆荚顶端锐；完全切除花柱的豆荚顶端明显变钝；切除部分子房的雌蕊结的豆荚绝大部分顶端钝，十分明显；切除部分子房1-2mm明显影响豆荚中第1个、甚至第2个籽粒的正常发育。
权利要求
1.一种通过子房滴注获得转基因植物的方法，其特征在于，在植物授粉后花粉粒萌发、雄核通过花粉管通道进入胚囊后，完全切除花柱及0-1.0mm的子房，在子房切口处滴注外源DNA，使其通过子房进入胚囊，直接转化处于融合期无壁的生殖细胞或受精卵，达到遗传转化之目的。
2.根据权利要求1所述的一种通过子房滴注获得转基因植物的方法，其特征在于，能够用于转化的外源DNA，包括环形脱氧核糖核苷酸序列，或线性的脱氧核糖核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种通过子房滴注获得转基因植物的方法，其特征在于，能够用于转化的外源DNA，包括仅由表达调控序列和外源功能基因组成的基本元件的转化，能够实现无选择标记基因和载体骨架序列的转化过程。
4.根据权利要求1所述的一种通过子房滴注获得转基因植物的方法，其特征在于，能够用于转化的外源DNA，包括仅由边界序列、表达调控序列和外源功能基因组成的基本元件的转化，能够实现无选择标记基因和载体骨架序列的转化过程。
全文摘要
一种通过子房滴注获得转基因植物的方法属于生物工程领域。涉及一种应用于有花植物，通过子房滴注获得转基因植物的方法，无需经过原生质体培养、细胞培养、组织培养以及再生植株等过程，属于生物工程领域。其特征是在植物授粉后花粉粒萌发、雄核通过花粉管通道进入胚囊后，完全切除花柱及0－1.0mm的子房，在切口处滴注外源DNA，使其通过子房进入胚囊，直接转化处于融合期无壁的生殖细胞或受精卵，达到遗传转化之目的，不同转化对象的转化效率可达到1－30％，安全、高效，可重复。
文档编号C12N15/87GK1624146SQ20041015554
公开日2005年6月8日 申请日期2004年12月17日 优先权日2004年12月17日
发明者安利佳, 王长海, 苏乔, 杨君, 高晓蓉, 栾雨时, 吴畏, 刘明 申请人:大连理工大学