专利名称：猪链球菌菌株及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种链球菌，尤其涉及猪链球菌菌株及其用途。
背景技术：
猪链球菌(Streptococcus suis)是条件性致病菌，广泛分布于自然界中，在动物的呼吸道、肠道、生殖道等处常在，可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡，严重危害养猪业的发展。链球菌之所以能致病，是因为其可产生多种酶和毒素，如透明质酸酶、链激酶、链道酶、DNA酶和溶血菌素O、溶血菌素S及红斑毒素；根据荚膜多糖抗原的差异，可将其分为35个血清型，即1～34以及1/2型。对猪致病性较强的为猪链球菌1型、2型和9型。以溶血性链球菌引起的败血性链菌病危害最大，脑炎型次之，关节炎型和淋巴结脓肿型危害小，但无乳链球菌是繁殖母猪的大敌。
猪链球菌为革兰氏阳性菌，可在外界环境中存活很长时间，特别是在粪便中及被污染的环境和带菌猪是重要的传染源，超急性死亡没有任何症。不分品种、年龄、性别的猪只一年四季都可感染本病，哺乳和断奶后仔猪发病死亡率高达80％以上，目前把链球菌分为下列五种类型。1、急性败血型(C群链球菌引起)常发生在肥育猪，表现为体温升高到41-42℃，最高可达到43℃，常有浆液鼻漏、眼结膜潮红、呼吸渐快、呈肺炎状、便秘干硬、腹下有紫红斑，皮肤有毛血点，颈背皮肤呈“刮痧状”出血点或斑，如患猪耐不过，常出现突然死亡(一般耐过12-18小时转为亚急性)。2、脑膜炎型(C群链球菌引起)多发生在哺乳和断奶仔猪(8周龄仔猪)病初体温可升高到40.5-42.5℃。中猪和母猪，便秘、很快出现神经症状(注意在出现神经症状之前有一个高热时间，一般很短(4-8小时)不易发现，给以后的确诊带来误区)，出现歪头、跛行、转圈、磨牙、发抖、眼球鼓胀、口角流白沫、不能站立、爬行或后肢麻痹，共济失调，病程1-3天，如不及时控制很快死亡。(注早期发现可见猪耳朵朝后抿，初步定为本病)。3、关节炎型多发生于新生仔猪，出现关节肿胀和蹄甲炎，跛行。4、脓肿型多为E群链球菌感染引起咽部、颈部、腿部淋巴节化脓，C群可引起皮肤形成脓肿，有热疼感影响采食、呼吸和吞咽。5、无乳型生产母猪临产前发热或不食，产后1-3天出现发热症状40℃左右，造成无乳、回乳和乳房脓肿等。所有链球菌感染无论慢性或急性，多表现为食欲不振，有轻微跛行现象。目前，我们在发病猪肺脏中分离到一株B群链球菌，与上述的C群链球菌、E群链球菌不同。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的猪链球菌菌株，该菌株可作为标准的试验用菌株。
本发明的目的是通过以下技术途径来实现的一种猪链球菌菌株(Streptococcus suis)，该微生物的保藏号是CGMCCNo.1316；保藏地址是北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期是2005年2月21日。
本发明菌株的分离方法如下将病死猪只，剖开胸腔取出肺脏，肺脏表面消毒后，取无菌剪刀，剪开一个深部切口，将无菌铂金耳深入肺脏切口内部，蘸取内部组织液，划斜线接种在含5％绵羊血PPLO固体培养基上(取灭菌PPLO琼脂培养基100毫升，加热融化，待冷却至50℃时，以无菌手续加入脱纤血5毫升，轻轻摇匀，防止产生气泡，倾注于灭菌的平皿中，经无菌检查后，放在冰箱中保存备用；PPLO固体培养基购于Difco公司)。将平板倒置于37℃恒温培养箱中14-18小时后，将平板取出挑取灰白色、半透明、表面光滑、圆形、隆起的周围有α溶血环小菌落进行革兰氏染色，镜下观察为革兰氏阳性链状小球菌，即为猪链球菌。
兰氏分群通过法国梅里埃公司提供的兰氏分群试剂盒分群为B群。
形态及染色细菌菌体为卵圆形，在固体培养基上为短链存在，在液体培养基上呈较长的链状生长，革兰氏染色阳性，无抗酸性。
培养及生化特性兼性厌氧菌，在5％二氧化碳中生长快于有氧条件，培养最适温度37℃。在固体培养基上培养时，在培养基上加入绵羊血、犊牛血清有助于本菌生长。菌落为灰白色、半透明、表面光滑、圆形、隆起的小菌落，菌落周围有α溶血环。
本发明菌株可作为科研工作者标准的试验用菌株。通过该菌株可以了解该菌的DNA分型、该菌对药物的耐药机制、该菌多重耐药机制及该菌在猪体内的病理复制模型。
本发明菌株生化反应试验一、试验材料1、供试菌株本发明菌株。
2、培养基的配制5％牛血清PPLO液体培养基取21克PPLO肉汤(Difco)加入1000毫升蒸馏水中，121℃15分钟高压灭菌后冷藏备用。在使用时，加入5％牛血清。购于PPLO肉汤Difco公司。
二、试验方法及结果挑取单个本发明菌落，接种于5％牛血清PPLO液体培养基中，37℃培养14-18小时，将纯培养的细菌接种于各种生化反应管中，在37℃恒温培养箱中孵育过夜后，取出观察结果。通过生化反应管中指示剂的颜色变化，判定细菌生化反应结果。具体结果如下葡萄糖(+)、麦芽糖(+)、蔗糖(+)、乳糖(+)、松三糖(-)、核糖(+)、山梨醇(-)、甘露醇(-)、阿拉伯糖(-)、棉子糖(+)、胆汁溶解(-)。
本发明菌株药敏试验将过夜培养本发明菌液，用灭菌生理盐水稀释至0.5麦氏单位，用无菌棉拭子沾取在PPLO固体培养基(PPLO固体培养基购于Difco)上密集划线接种，三次划线，每次划线旋转60度，保证接种物均匀分布。涂布菌液的平板于室温中干燥3-5分钟，用无菌镊子取药敏纸片(购于上海伊华医学科技有限公司)，贴于平板表面，并用镊子轻压一下纸片使其贴平。每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm。将贴好纸片的平板置37℃孵育18-24小时后，用标尺量取抑菌圈直径。根据抑菌圈的大小(不同抗生素其抑菌圈大小的标准不一致)，判定为敏感，耐药或中度耐药。
试验结果如下(抑菌环直径)红霉素19.4mm、青霉素17.0mm、氟哌酸11.2mm、氯霉素18.6mm、氨苄西林17.0mm、四环素0.0mm、复方磺胺0.0mm、先锋V号15.2mm、头孢呋新16.0mm。
根据NCCLS判断标准，本发明菌株对红霉素、头孢呋新、先锋V号中度耐药、对氯霉素敏感、对青霉素、氟哌酸、氨苄西林、四环素、复方磺胺耐药。
试验结果表明，本发明菌株可作为标准的药敏试验用菌株。
本发明菌株对红霉素耐药表型的确定耐药表型的测定以改良的双纸片法测定，在涂布本发明菌株菌液的平板上，间隔2Cm贴上红霉素及克林霉素纸片，过夜培养后观察结果。如果对克林霉素敏感，继续做15、16元环大环内酯类药物的敏感性试验。
试验结果如下(抑菌环直径)红霉素19.4mm(中度耐药)、克林霉素0mm(耐药)，因猪链球菌同时对红霉素、林可霉素耐药，所以本发明菌株对红霉素耐药表型为内在性耐药表型。
本发明菌株对红霉素耐药基因的确定对红霉素耐药的本发明菌株染色体DNA的提取纯的细菌菌落或细菌悬液沉淀物溶解在20μl水中，95℃加热5分钟，12,000rpm离心2分钟，上清液储存在-20℃以备用。
ermb/mefA耐药基因的扩增对红霉素耐药的菌株进行ermb和mefA的PCR。引物均由上海博亚公司合成。ermb所用引物为5′-GAAAAGGTACTCAACCAAATA-3′(上游)和5′-AGTAACGGTACTTAAATTGTTTAC-3′(下游)，扩增片断639bp。反应条件93℃初始变性5min后，94℃1min，54℃2min，72℃2min，30个循环后72℃延伸10min。mefA耐药基因所用引物5′-AGTATCATTAATCACTAGTGC-3′(上游)和5′-TTCTTCTGGTACTAAAAGTGG-3′(下游)，扩增片断400bp。94℃初始变性4min后，94℃1min，54℃2min，72℃2min，30个循环后72℃延伸10min。
试验结果如下PCR结束后，扩增到639bp的目的产物，将得到的目的产物在blast上检索，与NCBI GenBank上Streptococcus gallolyticus(AY183117.1)ermb基因同源性达99％；PCR结束后，没有扩增到的mefA耐药基因。
试验结果表明，本发明菌株可用于耐药基因的确定。
权利要求
1.一种猪链球菌菌株(Streptococcus suis)，其微生物保藏号是CGMCCNo.1316，保藏日期是2005年2月21日。
2.按照权利要求1所述的猪链球菌菌株，其微生物特征是细菌菌体为卵圆形，在固体培养基上为短链存在，在液体培养基上呈较长的链状生长，革兰氏染色阳性，无抗酸性，兼性厌氧菌，在5％二氧化碳中生长快于有氧条件，培养最适温度37℃，菌落为灰白色、半透明、表面光滑、圆形、隆起的小菌落，菌落周围有α溶血环。
3.权利要求1或2所述的猪链球菌菌株在作为试验用标准菌株中的用途。
4.按照权利要求3所述的用途，其特征是猪链球菌菌株在药敏试验中的用途。
5.按照权利要求3所述的用途，其特征是猪链球菌菌株在确定耐药基因中的用途。
全文摘要
本发明公开了猪链球菌(Streptococcus suis)的一种新菌株，微生物保藏号是CGMCC No.1316，保藏日期是2005年2月21日；本发明菌株可作为科研工作者标准的试验用菌株；通过该菌株可以了解该菌的DNA分型、该菌对药物的耐药机制、该菌多重耐药机制及该菌在猪体内的病理复制模型。
文档编号C12R1/46GK1824769SQ20051000876
公开日2006年8月30日 申请日期2005年2月25日 优先权日2005年2月25日
发明者李艳华, 蔡雪辉, 姜成刚, 刘永刚, 王洪峰, 柴文君 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所