专利名称：一种芽孢乳杆菌及其生产的活菌制剂的制作方法
技术领域：
本发明的一种芽孢乳杆菌S1及其生产的菌剂，属于生物高技术领域，是利用通过调整动物肠道微生态的方法来降低仔猪的腹泻率，提高仔猪的生长速度，适用于现代农业生产中绿色无公害畜产品的生产。
二、技术背景自上世纪50年代，美国食品与药物管理局(FDA)首次批准抗生素可用作饲料添加剂后，世界各国先后进行抗生素的饲养试验，并用于生产。无容置疑，抗生素用作促生长类饲料添加剂，在预防动物疾病，促进动物生长方面起到过积极作用。但随着时间的推移和科学的进步，人们认识到，在饲养中使用饲用抗生素等抗菌药物可产生严重的负面效应。主要表现为病原菌等微生物的抗药性增加，抗菌药物失去应有效果，一些疾病给人和动物带来严重威胁，正常菌群平衡失调，人、动物免疫力降低等。因此，一些发达国家在饲养中禁用和限用抗生素等抗菌药物。在我国，安全问题是限制我国畜产品出口的一个瓶颈，随着我国加入WTO，环保型饲料的生产愈显重要。因此，寻找抗生素的替代品是国内、国际饲料产业研究的热点问题。
益生素是一类通过调控动物肠道微生物区系平衡而有效地促进宿主动物健康和生长的微生物活菌制剂，因此也常称微生物活菌制剂。当生理和环境条件变更时，幼畜肠道中有害病原菌常迅速繁殖，造成肠道性疾病如腹泻的发生。益生素的应用可通过微生物拮抗、竞争排斥以及免疫刺激改善肠道微生物区系的平衡，从而减少疾病的发生。作为益生素的微生物通常是来自动物自身肠道或来自其它生态环境的有益微生物，对动物和人无毒副作用，因此被认为是一类具有广阔开发和应用前景的抗生素替代品，这一方面的研究也成为当今国际上畜牧兽医学科的一个前沿研究领域。
在动物营养中用作益生素的微生物主要有乳酸菌(包括芽孢杆菌Bacillus spp.、肠球菌Enterococcus spp.、乳酸杆菌Lactobacillus spp.、双歧杆菌Bifidobacterium spp.等)、酵母菌(如Saccharomyces cerevisiae)等。但有关其应用效果的报道很不一致，原因可能与下述因素有关(1)菌株来源。目前所用的益生菌大多为体外筛选而得，由于体内外环境差异极大，外源微生物必须经过定植、竞争和排斥才能在动物肠道中生存，因而许多学者认为，理想的益生素菌种最好来自动物肠道。(2)益生菌株的作用机理不清楚，特别是其在动物肠道中的活动规律仍不十分清楚。(3)益生素在体内的存活条件不清楚。目前生产中所用的不少益生菌株是通过体外微生物平板实验筛选出来的。但是益生素被饲用后，必须适应或耐受肠道中的生理和生活环境，必须能附着在肠道壁上，必须能够与其它肠道微生物竞争并达到可控制有害微生物繁殖所需的数量和存活率。这些是益生素能否发挥其作用的先决条件。
目前国外已有研究室开展寻找内源性乳酸菌作为仔猪益生菌的研究工作，但有关其作用机理和将其应用到生产实际中的报道甚少。一些国内学者在此方面也做了很多工作，但多限于菌株的分离、单一菌株的抑菌实验等方面的研究，有关深入探讨乳酸菌的作用机理的研究尚少。
发明内容
技术问题 本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种新型的芽孢乳杆菌益生菌剂，使用本菌剂可较大程度的降低仔猪腹泻率，提高仔猪的生长速度，降低仔猪饲料中饲用抗生素的添加量。同时生产和使用成本较低。该菌剂可以在仔猪正常饲养过程中使用，符合绿色饲料添加剂要求。
技术方案本发明菌株是采用PCR/DGGE技术，并结合常规微生物学方法，分离仔猪肠道内具益生作用的乳酸菌株，并通过活体动物实验，结合体外培养、发酵技术，分析了肠道生理生化因素对所分离的外源乳酸菌的选择性影响，最终筛选出可用作仔猪益生素生产的芽孢乳杆菌S1菌株，通过发酵生产、制成了益生菌剂。
下面为本发明的主要内容一种芽孢乳杆菌S1，其特征在于该微生物是革兰氏染色阳性的的菌株S1(2005年2月5日寄存于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.1315)，经鉴定为Sporolactobacillus sp.。主要生物学特性为G+，菌体细长杆状，有分节，椭圆形芽孢，孔雀绿染色后芽孢明显，兼性厌氧生长，葡萄糖、乳糖、纤维二糖、菊糖能氧化产酸，但不分解阿拉伯糖、木糖、淀粉。该菌耐低pH值(pH2.5)及高胆盐浓度(0.1-0.2％)，对胃蛋白酶不敏感，80℃下2小时内能生长，发酵菌液具有显著的抑制大肠杆菌及金黄色葡萄球菌生长效应。仔猪生产中使用该菌剂后可较大程度的降低仔猪的腹泻率，提高生长速度，减少仔猪饲料中饲用抗生素的添加量。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。
使用上述芽孢乳杆菌生产菌剂的工艺为斜面菌种----摇瓶种子液----发酵罐------冷冻干燥----产品(包装剂型冻干粉)。
本发明的详细实施步骤为1)将试管种接种于发酵培养基中，摇瓶振荡培养至对数期；2)将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入10升发酵罐，培养至对数生长期，培养基配方为蛋白胨1％；牛肉浸膏1％；酵母浸膏0.5％；葡萄糖2％；柠檬酸三铵0.2％；醋酸钠0.5％；K2HPO40.5％；MgSO4.7H2O 0.05％；MnSO4.4H2O0.02％；吐温-80 0.1％；番茄汁10％；pH5.5～6.2；培养温度为37℃，全流程培养时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。
3)发酵罐中的菌液在3000×g，4℃下离心10分钟后，所得菌泥添加无菌脱脂乳液，而后-70℃过夜，在冷冻干燥仪中冷冻干燥20h，制成冻干粉。
有益效果本发明提供了一种新型的芽孢乳杆菌益生菌剂，使用本菌剂可较大程度的降低仔猪腹泻率，提高仔猪的生长速度，降低仔猪饲料中饲用抗生素的添加量。
使用该发明生产的芽孢乳杆菌益生菌剂具有生产成本低，使用方便，使用效果好的优点，适合个体养殖户及规模化猪场大面积推广使用。本发明对于降低仔猪的腹泻率，保护生态环境具有重要的意义。动物试验表明，芽孢乳杆菌S1菌剂能使仔猪腹泻率降低60％以上，可以大大降低猪生产过程中饲用抗生素的添加量，降低养猪成本，提高养猪生产效益。该益生菌剂可以与其他仔猪添加剂的同时使用，符合绿色饲料添加剂要求。并且该菌来源于仔猪肠道，属有益微生物，对动物无任何副作用。
四
图1对大肠杆菌K99的抑菌效果图2分子跟踪S1菌在仔猪肠道中的定植图3S1菌的生长曲线
五具体实施例方式
1 菌株的分离和鉴定以无菌方法取仔猪肠道食糜及肠壁，将其溶解于无菌生理盐水中，用旋涡混合仪将稀释液混匀后，1000r.min-1下离心，取上清梯度稀释后接种于固体培养基上，37℃培养数天。从中挑取数个菌落，菌株优化结果表明，S1菌的生长速度极快，在接种后10小时即可达到平稳期，见图3；S1菌耐低pH值、高温、高胆盐浓度及抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的效果最好，该菌鉴定为Sporolactobacillus sp.。主要生物学特性为G+，菌体细长杆状，有分节，椭圆形芽孢，孔雀绿染色后芽孢明显，兼性厌氧生长。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。
2 菌株优化实验2.1pH值对芽孢乳杆菌S1存活的影响S1在MRS培养基中培养至对数后期，取菌液在pH2.5、3.5、4.5生理盐水中，每隔30min测定S1菌株的数量，结果表明，上述pH值对S1菌株的存活无太大影响，在pH4.5时，其活菌数随时间延长不断上升，菌株呈正常生长态势，在pH3.5时，在整个处理期间，活菌数基本无变化；在pH2.5时，随时间延长，活菌数有所下降，但在150min时存活数仍较高。在pH1.5时，经60min处理后存活数低于1.00×104，说明S1菌株对pH1.5耐受性差。由此可见，S1菌可耐受pH2.5以上的条件。
2.2胆盐对芽孢乳杆菌S1存活的影响S1菌在MRS培养基中培养至对数后期，接种于含胆盐的无菌生理盐水中，每间隔1h测定一次其中活菌数量。结果表明，与对照相比，S1菌株的生长受胆盐的抑制，随培养时间的增长，活菌数下降，且在同一时间点上，随胆盐浓度增加，S1菌株活菌数下降；但S1菌株对0.1-0.2％胆盐耐受性较好。
2.3芽孢乳杆菌S1的热耐受性S1菌在MRS培养基中培养到对数后期，按10％的接种量接到已预热至50℃、80℃、100℃的无菌生理盐水中，每间隔1min测定其中的活菌数量，结果表明，S1菌株经100℃加热2min处理后存活率为1.94％，5min后存活率小于0.02％，50℃热处理对S1菌株的存活无影响。
2.4芽孢乳杆菌S1的抑菌效果采用牛津杯法，研究S1的发酵液对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抑制效应，表1所示，S1菌株发酵液对大肠杆菌K88、K99、O141、1987P和金黄色葡萄球菌抑菌效果显著。S1菌株菌液的抑菌物质中除乳酸外，同时存在其他抑菌物质，这些抑菌物质占总抑菌效应的30％左右。S1菌株发酵液的抑菌物质具有良好的热稳定性和耐蛋白酶特性，经70℃30min、100℃30min、121℃15min加热处理后残留抑菌效果(热处理菌液抑菌圈直径除以原液抑菌圈直径)均在92％以上，经蛋白酶处理后残留抑菌效果(蛋白酶处理菌液抑菌圈直径除以原液抑菌圈直径)均在85％以上，见表2。
2.5芽孢乳杆菌S1制剂与不同寡糖的复合效应研究芽孢乳杆菌S1菌剂与不同寡糖的组合效应。结果表明，快发酵型(FOS)和慢发酵型(菊糖)寡糖复合后对芽孢乳杆菌S1的生长速度和产酸能力促进作用最强。
3实际应用实验3.1芽孢乳杆菌S1制剂的动物试验选取多窝新生仔猪，分别在7(开食当天)、9、11日龄进行口服芽孢乳杆菌S1的试验。结果表明，芽孢乳杆菌S1能提高断奶后仔猪前后肠乳酸菌与大肠杆菌的数量比值；提高后肠VFA浓度尤其是丁酸浓度(丁酸浓度的提高对仔猪的健康有益)；分子跟踪显示其在乳仔猪胃肠道中能够存活并定植。同时取仔猪胃底、十二指肠、空肠组织，进行组织形态学观察，试验发现，乳酸菌可显著提高断奶后仔猪胃底腺盐酸细胞的数量，并可促进断奶前十二指肠肠绒毛的增高，但对空肠肠绒毛高度无显著影响。
3.2芽孢乳杆菌S1制剂的应用剂量试验选用30窝新生仔猪，分别于7(开食当天)、9、11日龄给三个处理组口服不同剂量的芽孢乳杆菌S1，结果表明不同剂量的芽孢乳杆菌S1均能显著降低乳仔猪的腹泻率，CFU为109的口服剂量效果最佳。
3.3芽孢乳杆菌S1制剂的中试动物试验选取多个猪场，每猪场30-40窝新生仔猪，于7、9、11日龄口服CFU为109的芽孢乳杆菌S1。结果表明，在7-21日龄期间，口服芽孢乳杆菌S1组的平均日增重比对照组提高9.49％，而且其日增重变异系数明显好于对照组(7.47％vs23.15％)，试验组腹泻率极显著低于对照组(3.1％vS19.7％)。
表1 对大肠杆菌K88、99、O141、987P、E1及金黄色葡萄球菌的抑菌效应单位mm
表2 S1菌液中抑菌物质的热稳定性
权利要求
1.一种芽孢乳杆菌，其特征在于该微生物是革兰氏染色阳性的Sporolactobacillus sp.的菌株S1，2005年2月5日寄存于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.1315，经鉴定为Sporolactobacillus sp.，主要生物学特性为G+，菌体细长杆状，有分节，椭圆形芽孢，孔雀绿染色后芽孢明显，兼性厌氧生长，葡萄糖、乳糖、纤维二糖、菊糖能氧化产酸，但不分解阿拉伯糖、木糖、淀粉；该菌发酵菌液具有显著的抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌生长的效应；该菌耐低pH值及高胆盐浓度，对胃蛋白酶不敏感，80℃下2小时内能生长，其菌剂在仔猪饲养中使用后可较大幅度的降低仔猪的腹泻率，提高生长速度，减少仔猪饲料中饲用抗生素的添加量。
2.一种用权利要求1所述的芽孢乳杆菌的菌剂，是通过以下方法生产而成1)将试管种接种于发酵培养基中，摇瓶振荡培养至对数期；2)将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入10升发酵罐，培养至对数生长期，培养基配方为蛋白胨1％；牛肉浸膏1％；酵母浸膏0.5％；葡萄糖2％；柠檬酸三铵0.2％；醋酸钠0.5％；K2HPO40.5％；MgSO4.7H2O 0.05％；MnSO4.4H2O 0.02％；吐温-80 0.1％；番茄汁10％；pH5.5～6.2；培养温度为37℃，全流程培养时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上；3)发酵罐中的菌液在3000×g，4℃下离心10分钟后，所得菌泥添加无菌脱脂乳液，而后-70℃过夜，在冷冻干燥仪中冷冻干燥20h，制成冻干粉。
全文摘要
本发明提供了一种可降低仔猪腹泻率的芽孢乳杆菌及其生产的活菌制剂，所用菌株为革兰氏染色反应阳性菌S1，经鉴定为Sporolactobacillus sp.。主要生物学特性为G
文档编号C12N1/20GK1687400SQ20051003889
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月15日 优先权日2005年4月15日
发明者朱伟云, 姚文, 毛胜勇 申请人:南京农业大学