专利名称：一种同步检测三种鱼病病毒的试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种水生动物特别是鱼类病毒的检测用试剂盒，特别是一种同步检测鱼传染性造血器官坏死症病毒、传染性胰脏坏死症病毒和病毒性出血性败血症病毒的试剂盒，本发明还涉及前述同步检测的检测方法。
背景技术：
病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、传染性胰脏坏死症病毒(IPNV)和鱼传染性造血器官坏死症病毒(IHNV)是同被列为《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》的二类传染病，VHS和IHN分别是《中华人民共和国动物防疫法》规定的二类和三类疫病，这三种是国际兽疫局OIE名录中的疾病。IHN和VHS病毒均属于弹状病毒科单链RNA病毒，IHN病毒引起鲑科多种鱼的致死性疾病，通过污染的水、饲料和粪便等传播，幼鱼和鱼苗死亡率可达100％，成鱼感染可终身带毒并散毒，VHS病毒可引起各种年龄的鲑科多种鱼发病，死亡率达80-100％，IPN病毒属双RNA病毒科双链RNA病毒，引起包括鲑科鱼在内的很多水生动物的急性高度传染性疾病。这3种病毒病均是由RNA病毒引起的急性高度传染性疾病，可侵害多种海水和淡水养殖鱼类，在欧、美、日、韩及部分亚洲国家流行，可通过鱼体及所产卵、精液、尿、粪便以及污染的饲料、水等传播，对养殖场造成致命打击，危害非常严重。对上述3病的最好的控制方法是加强对养殖场检测，防止病毒传入鱼群。目前还没有对这三种鱼病进行检测的试剂盒，目前对三种鱼病普遍采用的检测方法是用病料接种敏感鱼及细胞进行病毒增殖，分离纯化病毒，然后用血清中和、免疫荧光和酶联免疫检测方法进行病毒鉴定，其操作步骤复杂繁琐，时间长达2-4周。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种同步检测鱼传染性造血器官坏死症病毒、传染性胰脏坏死症病毒和病毒性出血性败血症病毒的试剂盒，用该试剂盒可以对上述3种病毒同步进行快捷、方便、迅速的检测。
本发明还公开了一种应用上述试剂盒同步检测传染性造血器官坏死症病毒、传染性胰脏坏死症病毒和病毒性出血性败血症病毒的检测方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种同步检测鱼传染性造血器官坏死症病毒、传染性胰脏坏死症病毒和病毒性出血性败血症病毒的试剂盒，其特点是，它由下列物品构成，(1)阴性对照，不含IHNV、IPNV和VHSV 3种病毒核酸成分的组织提取液，1支；(2)阳性对照，含有IHNV、IPNV和VHSV 3种病毒核酸成分的溶液，1支；(3)dNTP，1支；(4)含Mg2+的PCR缓冲液，1支；(5)引物对ihnf/ihnr，各1支；ihnf为5’-gttaacttcaacgccaacagg，ihnr为5’-tgaagtacccctccccgagcatcc；(6)引物对ipnf/ipnr，各1支；ipnf为5’-ccgcaacttacttgagatccattatgc，ipnr为5’-cgtctggttcagattccacctgtagtg；(7)引物对vhsf/vhsr，各1支；vhsf为5’-cgaccagctcaactcaggtgtcc，vhsr为5’-ccaggtcggtcttgatccattctgtc；(8)DNA聚合酶，1支；(9)逆转录酶，1支；(10)RNA酶抑制剂，1支；(11)100％DEPC溶液，1支；(12)包装盒子1个，泡沫板1块，其大小与包装盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有若干数量的小孔，分别用于放置上述物品。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的一种同步检测鱼传染性造血器官坏死症病毒、传染性胰脏坏死症病毒和病毒性出血性败血症病毒的试剂盒，其特点是，它还可以含有以下物品(1)RNA提取用Trizol液，1支；(2)氯仿，1支；(3)异戊醇，1支；(4)70％乙醇，1支；(5)含0.01％DEPC的水溶液，1支。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。本发明是一种同步检测鱼传染性造血器官坏死症病毒、传染性胰脏坏死症病毒和病毒性出血性败血症病毒的检测方法，其特点是，采用上述的试剂盒，其步骤如下，(1)样品中RNA模板的提取取易感组织样品匀浆液或可疑病毒感染悬液100-500μl，加入500-800μl Trizol试剂，旋涡30s，加入200μl按24∶1比例配制的氯仿与异戊醇混合液，旋涡30s，10000-15000r/min离心5-3min，取上清，加入等量异丙醇溶液同上离心，取沉淀，加入300μl的70％乙醇溶液同上离心后，去上清，风干，加入50μl的0.01％DEPC水溶液，取2-10μl用于RT-PCR；(2)RT-PCR预混合液的配制先按下列术式预先加入各试剂并混合好，各试剂加入前需离心数秒钟，
dNTP 1μl；含Mg2+的PCR缓冲液， 5μl；引物对ihnf/ihnr2μl；引物对ipnf/ipnr， 2μl；引物对vhsf/vhsr， 2μl；DNA聚合酶，0.5μl；逆转录酶， 0.5μl；RNA酶抑制剂， 0.25μl；0.01％DEPC水溶液， 若干；然后在上述混合液中分别加入RNA模板，2-10μl，得RT-PCR预混合液A，总体积50μl；阴性对照，5μl，得RT-PCR预混合液B，总体积50μl；阳性对照，5μl，得RT-PCR预混合液C，总体积50μl；(3)将上述RT-PCR预混合液A、B、C装入PCR反应管，置于基因扩增仪中，如仪器无热盖，加入1-2滴石蜡油封盖，设置RT-PCR循环参数如下，进行扩增42℃×30min95℃×4min
72℃×10min25℃×1min或结束(4)扩增反应结束后，取10-15μl加入4μl溴酚蓝混匀，经2％琼脂糖凝胶电泳，电压按5V/cm电泳30-40min后于紫外分析仪下观察，阴性对照和阳性对照正确，样品RNA提取液若在625bp、371bp、206bp处出现条带，则分别为VHSV、IHNV和IPNV阳性，说明待测样品中携带三种病毒，若出现其中之一条带，则对应的病毒检测结果为阳性，否则为阴性。
本发明的试剂盒既可用来同时检测三种病毒，也可用来单独检测其中每一种病毒，单独检测时，只用其中一种病毒的特异性引物对，如单独检测IHNV时，加入ihnf/ihnr引物，不加入vhsf/vhsr及ipnf/ipnr引物，其他试剂不变，以此类推。
与现有技术相比，应用本发明的试剂盒及检测方法可对IHNV、IPNV和VHSV三种病毒进行定性检测，不仅可以用来进行对IHNV、IPNV和VHSV各种单一病毒单管RT-PCR检测，也可以用来对3种病毒单管RT-PCR同步快速检测。检测时从制样开始全过程可控制在5小时之内。本发明检测方法避免了常规的先对RNA样品进行逆转录RT成cDNA，再取少量逆转录产品进行PCR扩增的两步复杂操作步骤及时间、试剂消耗，可对三种病毒进行定性检测，简便快速，特异性好，灵敏度高，可用于进出境鱼类3种鱼病的检测和养殖场的疫情监测，防制疫病传播流行，具有很高的实用价值。可应用于出口观赏鱼、鱼类及其产品监测检疫，对我国水生动物养殖场开展疫病诊断、疫情调查，以及进口水生动物及产品的检测。本发明方法准确、可靠、快速，简单、易操作、便于推广。
附图为本发明的RT-PCR扩增图。泳道1DNA标记，从上到下1116，883，692，500，400，331，242，190，110bp；泳道2/3，5/6含有VHSV、IHNV和IPNV的阳性对照；泳道4/7阴性对照。
具体实施例方式
下面参照附图，进一步描述本发明的具体技术实施方案。
实施例1。一种同步检测鱼传染性造血器官坏死症病毒、传染性胰脏坏死症病毒和病毒性出血性败血症病毒的试剂盒，它由下列物品构成，(1)阴性对照，不含IHNV、IPNV和VHSV 3种病毒核酸成分的组织提取液，1支；(2)阳性对照，含有IHNV、IPNV和VHSV 3种病毒核酸成分的溶液，1支；(3)dNTP，1支；(4)含Mg2+的PCR缓冲液，1支；(5)引物对ihnf/ihnr，各1支；ihnf为5’-gttaacttcaacgccaacagg，ihnr为5’-tgaagtacccctccccgagcatcc；
(6)引物对ipnf/ipnr，各1支；ipnf为5’-ccgcaacttacttgagatccattatgc，ipnr为5’-cgtctggttcagattccacctgtagtg；(7)引物对vhsf/vhsr，各1支；vhsf为5’-cgaccagctcaactcaggtgtcc，vhsr为5’-ccaggtcggtcttgatccattctgtc；(8)DNA聚合酶，1支；(9)逆转录酶，1支；(10)RNA酶抑制剂，1支；(11)100％DEPC溶液，1支；(12)包装盒子1个，泡沫板1块，其大小与包装盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有若干数量的小孔，分别用于放置上述物品。
实施例2。实施例1中的试剂盒，它还含有以下物品(1)RNA提取用Trizol液，1支；(2)氯仿，1支；(3)异戊醇，1支；(4)70％乙醇，1支；(5)含0.01％DEPC的水溶液，1支。
实施例3。参照附图。一种同步检测鱼传染性造血器官坏死症病毒、传染性胰脏坏死症病毒和病毒性出血性败血症病毒的检测方法，采用实施例1所述的试剂盒，其余所需试剂由检测者自备，其步骤如下，(1)样品中RNA模板的提取取易感组织样品匀浆液或可疑病毒感染悬液100μl，加入500μl Trizol试剂，旋涡30s，加入200μl按24∶1比例配制的氯仿与异戊醇混合液，旋涡30s，10000r/min离心5min，取上清，加入等量异丙醇溶液同上离心，取沉淀，加入300μl的70％乙醇溶液同上离心后，去上清，风干，加入50μl的0.01％DEPC水溶液，取2μl用于RT-PCR；(2)RT-PCR预混合液的配制先按下列术式预先加入各试剂并混合好，各试剂加入前需离心数秒钟，dNTP 1μl；含Mg2+的PCR缓冲液， 5μl；引物对ihnf/ihnr 2μl；引物对ipnf/ipnr，2μl；引物对vhsf/vhsr，2μl；DNA聚合酶， 0.5μl；逆转录酶， 0.5μl；RNA酶抑制剂，0.25μl；0.01％DEPC水溶液， 若干；然后在上述混合液中分别加入RNA模板，2μl，得RT-PCR预混合液A，总体积50μl；
阴性对照，5μl，得RT-PCR预混合液B，总体积50μl；阳性对照，5μl，得RT-PCR预混合液C，总体积50μl；(3)将上述RT-PCR预混合液A、B、C装入PCR反应管，置于基因扩增仪中，如仪器无热盖，加入1-2滴石蜡油封盖，设置RT-PCR循环参数如下，进行扩增42℃×30min95℃×4min 72℃×10min25℃×1min(4)扩增反应结束后，取10μl加入4μl溴酚蓝混匀，经2％琼脂糖凝胶电泳，电压按5V/cm电泳30min后于紫外分析仪下观察，阴性对照和阳性对照正确，样品RNA提取液若在625bp、371bp、206bp处出现条带，则分别为VHSV、IHNV和IPNV阳性，说明待测样品中携带三种病毒，若出现其中之一条带，则对应的病毒检测结果为阳性，否则为阴性。
实施例4。参照附图。一种同步检测鱼传染性造血器官坏死症病毒、传染性胰脏坏死症病毒和病毒性出血性败血症病毒的检测方法，采用实施例2所述的试剂盒，其步骤如下，
(1)样品中RNA模板的提取取易感组织样品匀浆液或可疑病毒感染悬液500μl，加入800μl Trizol试剂，旋涡30s，加入200μl按24∶1比例配制的氯仿与异戊醇混合液，旋涡30s，15000r/min离心3min，取上清，加入等量异丙醇溶液同上离心，取沉淀，加入300μl的70％乙醇溶液同上离心后，去上清，风干，加入50μl的0.01％DEPC水溶液，取10μl用于RT-PCR；(2)RT-PCR预混合液的配制先按下列术式预先加入各试剂并混合好，各试剂加入前需离心数秒钟，dNTP 1μl；含Mg2+的PCR缓冲液， 5μl；引物对ihnf/ihnr 2μl；引物对ipnf/ipnr，2μl；引物对vhsf/vhsr，2μl；DNA聚合酶， 0.5μl；逆转录酶， 0.5μl；RNA酶抑制剂，0.25μl；0.01％DEPC水溶液， 若干；然后在上述混合液中分别加入RNA模板，10μl，得RT-PCR预混合液A，总体积50μl；阴性对照，5μl，得RT-PCR预混合液B，总体积50μl；阳性对照，5μl，得RT-PCR预混合液C，总体积50μl；
(3)将上述RT-PCR预混合液A、B、C装入PCR反应管，置于基因扩增仪中，如仪器无热盖，加入1-2滴石蜡油封盖，设置RT-PCR循环参数如下，进行扩增42℃×30min95℃×4min 72℃×10min(4)扩增反应结束后，取15μl加入4μl溴酚蓝混匀，经2％琼脂糖凝胶电泳，电压按5V/cm电泳40min后于紫外分析仪下观察，阴性对照和阳性对照正确，样品RNA提取液若在625bp、371bp、206bp处出现条带，则分别为VHSV、IHNV和IPNV阳性，说明待测样品中携带三种病毒，若出现其中之一条带，则对应的病毒检测结果为阳性，否则为阴性。
权利要求
1.一种同步检测鱼传染性造血器官坏死症病毒、传染性胰脏坏死症病毒和病毒性出血性败血症病毒的试剂盒，其特征在于，它由下列物品构成，(1)阴性对照，不含IHNV、IPNV和VHSV 3种病毒核酸成分的组织提取液，1支；(2)阳性对照，含有IHNV、IPNV和VHSV 3种病毒核酸成分的溶液， 1支；(3)dNTP，1支；(4)含Mg2+的PCR缓冲液， 1支；(5)引物对ihnf/ihnr， 各1支；ihnf为5’-gttaacttcaacgccaacagg，ihnr为5’-tgaagtacccctccccgagcatcc；(6)引物对ipnf/ipnr， 各1支；ipnf为5’-ccgcaacttacttgagatccattatgc，ipnr为5’-cgtctggttcagattccacctgtagtg；(7)引物对vhsf/vhsr， 各1支；vhsf为5’-cgaccagctcaactcaggtgtcc，vhsr为5’-ccaggtcggtcttgatccattctgtc；(8)DNA聚合酶， 1支；(9)逆转录酶， 1支；(10)RNA酶抑制剂， 1支；(11)100％DEPC溶液， 1支；(12)包装盒子1个，泡沫板1块，其大小与包装盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有若干数量的小孔，分别用于放置上述物品。
2.根据权利要求1所述的一种同步检测鱼传染性造血器官坏死症病毒、传染性胰脏坏死症病毒和病毒性出血性败血症病毒的试剂盒，其特征在于，它还可以含有以下物品(1)RNA提取用Trizol液， 1支；(2)氯仿， 1支；(3)异戊醇，1支；(4)70％乙醇， 1支；(5)含0.01％DEPC的水溶液， 1支。
3.一种同步检测鱼传染性造血器官坏死症病毒、传染性胰脏坏死症病毒和病毒性出血性败血症病毒的检测方法，其特征在于，采用权利要求1所述的试剂盒，其步骤如下，(1)样品中RNA模板的提取取易感组织样品匀浆液或可疑病毒感染悬液100-500μl，加入500-800μl Trizol试剂，旋涡30s，加入200μl按24∶1比例配制的氯仿与异戊醇混合液，旋涡30s，10000-15000r/min离心5-3min，取上清，加入等量异丙醇溶液同上离心，取沉淀，加入300μl的70％乙醇溶液同上离心后，去上清，风干，加入50μl的0.01％DEPC水溶液，取2-10μl用于RT-PCR；(2)RT-PCR预混合液的配制先按下列术式预先加入各试剂并混合好，各试剂加入前需离心数秒钟，dNTP1μl；含Mg2+的PCR缓冲液， 5μl；引物对ihnf/ihnr 2μl；引物对ipnf/ipnr， 2μl；引物对vhsf/vhsr， 2μl；DNA聚合酶， 0.5μl；逆转录酶， 0.5μl；RNA酶抑制剂， 0.25μl；0.01％DEPC水溶液， 若干；然后在上述混合液中分别加入RNA模板，2-10μl，得RT-PCR预混合液A，总体积50μl；阴性对照，5μl，得RT-PCR预混合液B，总体积50μl；阳性对照，5μl，得RT-PCR预混合液C，总体积50μl；(3)将上述RT-PCR预混合液A、B、C装入PCR反应管，置于基因扩增仪中，如仪器无热盖，加入1-2滴石蜡油封盖，设置RT-PCR循环参数如下，进行扩增42℃×30min95℃×4min 72℃×10min25℃×1min或结束(4)扩增反应结束后，取10-15μl加入4μl溴酚蓝混匀，经2％琼脂糖凝胶电泳，电压按5V/cm电泳30-40min后于紫外分析仪下观察，阴性对照和阳性对照正确，样品RNA提取液若在625bp、371bp、206bp处出现条带，则分别为VHSV、IHNV和IPNV阳性，说明待测样品中携带三种病毒，若出现其中之一条带，则对应的病毒检测结果为阳性，否则为阴性。
全文摘要
本发明提供一种同步检测鱼传染性造血器官坏死症病毒(IHNV)、传染性胰脏坏死症病毒(IPNV)和病毒性出血性败血症病毒(VHSV)试剂盒。本发明还公开了应用该试剂盒进行检测的检测方法。应用该试剂盒及检测方法可对三种病毒进行定性检测，简便快速，特异性好，灵敏度高，可用于进出境鱼类3种鱼病的检测和养殖场的疫情监测，防制疫病传播流行，具有很高的实用价值。
文档编号C12Q1/04GK1687447SQ20051003888
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月12日 优先权日2005年4月12日
发明者段宏安, 张睿, 姚燕林, 王海涛, 周毅, 李金华, 刘小琴 申请人:中华人民共和国连云港出入境检验检疫局