专利名称：编码甘薯八氢番茄红素脱氢酶的cDNA序列的制作方法
所属领域本发明涉及甘薯(Ipomoea batatas)中表达的编码八氢番茄红素脱氢酶(Ipomoeabatatas phytoene desaturase)的cDNA序列。
背景技术：
β-胡萝卜素(β-Carotene)的生物合成主要发生于高等植物、藻类、真菌和细菌体内，动物体内不能从头合成β-胡萝卜素。β-胡萝卜素是维生素A(Vitamin A)的前体，在人体内可根据需要转化为维生素A。它具有营养、着色的双重作用，是联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)食品添加剂联合专家委员会认定的A类优秀有营养的食品添加剂(foodadditives)。近年来，越来越多的医学研究表明，β-胡萝卜素可抗多种癌症，特别是可降低肺癌发病率。β-胡萝卜素在淬灭自由基，增强人体免疫力，预防心血管疾病等保护人类健康方面起着重要的作用。
天然β-胡萝卜素顺式异构体比例高，目前化学合成法还无法合成β-胡萝卜素顺式异构体，而顺式异构体已被临床证明其抗癌、抗心血管疾病以及保健功能远远高于全反式异构体。
类胡萝卜素合成是一个十分庞大的次生代谢途径，β-胡萝卜素的合成从牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)开始，依次经八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、ζ-胡萝卜素脱氢酶和β-胡萝卜素环化酶的催化，最终合成β胡萝卜素，八氢番茄红素脱氢酶是β胡萝卜素合成的关键酶之一。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的编码甘薯八氢番茄红素脱氢酶的cDNA序列。
发明内容
本发明的目的是提供编码甘薯八氢番茄红素脱氢酶的cDNA序列。
在本发明中，“分离的”cDNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒、粘粒等。在产生本发明的编码甘薯八氢番茄红素合成酶的核苷酸序列时，可以将编码甘薯八氢番茄红素脱氢酶的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，从而形成甘薯八氢番茄红素脱氢酶基因的表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
本发明的编码甘薯八氢番茄红素脱氢酶的cDNA序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
获得有关的序列后，用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可以通过先合成多个多核苷酸小片段，然后再进行连接而获得编码本发明甘薯八氢番茄红素合成酶的核酸序列。然后，可将该核酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。
表2列出了本发明的编码甘薯八氢番茄红素脱氢酶基因与番茄的八氢番茄红素脱氢酶基因(GenBank Accession No.X59948)序列的同源比较图。
下面结合具体步骤，进一步阐述本发明。应理解，这些步骤仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列步骤中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等《分子克隆》、《实验室手册》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
步骤1编码甘薯八氢番茄红素脱氢酶的cDNA序列的克隆1.组织分离(isolation)红心甘薯品种金山72来源于福建农林大学作物学院薯类研究室，在大田种植80天，取幼嫩块根，用液氮速冻。
2.总RNA的分离(total RNA isolation)和检测取根部，用研钵研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至50ml新管，抽提总RNA(TRIzol Reagents，Invitrogen，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，电泳图谱呈现出3条清晰可区分的条带，其中28SRNA∶18SRNA比值约为2∶1，表明总RNA基本上未降解，可用于编码甘薯八氢番茄红素脱氢酶的cDNA序列的克隆。
3.全长cDNA序列的克隆(Cloning of Full-length cDNA)进行全长cDNA序列克隆，分四个阶段进行(1)RT-PCR根据黄水仙、玉米、番茄、胡萝卜、辣椒的编码八氢番茄红素脱氢酶的核酸保守序列，设计保守引物，保守序列的正向与反向引物分别为SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2。采用RT-PCR的方法(TaKaRa试剂盒)，得到保守序列pas con(531bp)，连接到T-easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，获得的保守序列与已知番茄(Lycopersicon esculentum)、辣椒(C.annuum)、马铃薯(Solanum tuberosum)的八氢番茄红素脱氢酶基因的同源性均为86％，初步认为它是一个编码甘薯八氢番茄红素脱氢酶cDNA的一个片段。
(2)3’-RACE反转录总RNA，得到第一链cDNA。
第一轮PCR(引物为GR3(SEQ ID NO.9)+SEQ ID NO.3)第二轮PCR(GR3N(SEQ ID NO.10)+SEQ ID NO.4)得到pds3(1060bp)其它过程如同(1)所示。
测序结果已有的数据库(Genebank+EMBL)搜索，得到其核酸序列与已知番茄(Lycopersiconesculentum)和辣椒(C.annuum)、马铃薯(Solanum tuberosum)的八氢番茄红素脱氢酶基因的同源性分别为86％、86％、84％，故可进一步确认它是一个八氢番茄红素脱氢酶cDNA的片段。
(3)5’-RACE第一轮PCR GR5(SEQ ID NO.11)+SEQ ID NO.5第二轮PCR GR5N(SEQ ID NO.12)得到pds5(610bp)其它过程如同(1)所示。
(4)PCR扩增甘薯八氢番茄红素脱氢酶cDNA的编码区通过组合使用上述方法，拼接候选的编码甘薯八氢番茄红素脱氢酶的全长cDNA序列，在获得该序列(至少包含完整的开放读框)信息的基础上，进一步设计正向引物pdsF(SEQ ID NO.7)和反向引物pdsR(SEQ ID NO.8)，以总RNA经Oligo(dT)反转录为模板，用高保真的Pyrobest酶，进行PCR扩增，PCR条件为94℃ 5min，随之以94℃ 30sec、60℃ 30sec和72℃ 2min进行30个循环，最后以72℃延伸10min。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1,845bp。
因此，组合上述4种方法得到的结果，获得了编码甘薯八氢番茄红素脱氢酶的全长cDNA序列(表1)。
BLAST的结果证明从甘薯中新得到的基因确为八氢番茄红素脱氢酶cDNA。由于已知的八氢番茄红素脱氢酶能够催化八氢番茄红素形成六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素，故推测该cDNA具有相同的功能。
步骤2甘薯八氢番茄红素脱氢酶cDNA的序列信息与同源性分析本发明新的甘薯八氢番茄红素脱氢酶基因全长cDNA的长度为2,181bp，开放读框位于184-1969位核苷酸，详细序列见表1。将甘薯八氢番茄红素脱氢酶基因的全长cDNA序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索，结果薯八氢番茄红素合成酶cDNA与辣椒(Capsicum annuum)的八氢番茄红素合成酶cDNA(GenBankAccession No.X68017)的在核苷酸水平上有76％的相同性，可以认为两者在功能上有很高相似性。
步骤3甘薯八氢番茄红素脱氢酶cDNA的功能分析在该步骤中，将编码甘薯八氢番茄红素脱氢酶的cDNA序列构建入植物表达载体之中，并转化烟草，以鉴定其功能。
1.植物表达载体的构建依据甘薯八氢番茄红素脱氢酶全长cDNA序列(表1)，设计扩增出完整阅读框的引物，分别在正反引物上引入限制性内切酶位点正反引物分别引入SmaI和SacI酶切位点。以步骤1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，保证甘薯八氢番茄红素酶的阅读框完全正确。分别用内切酶SmaI和SacI进行37℃酶切3h，回收目的片段1,845bp；载体p2300用SmaI和Sacl内切酶37℃酶切3h，分别回收目的片段。将经酶切的甘薯八氢番茄红素脱氢酶cDNA的目的片段与经相应内切酶切过的p2300载体连接，转化大肠杆菌DH5α，37℃培养20h，进行重组子的PCR鉴定和酶切鉴定。
2.植物表达载体转化农杆菌(1)取一份感受态农杆菌EHA105，加入含甘薯八氢番茄红素脱氢酶cDNA的植物表达载体约1μg，轻轻混匀；(2)于液氮中速冻2分钟，37℃温育5分钟；(3)加入500μl YEB液体培养基，28℃轻摇2-4小时，消除感受态；(4)分别取50-200μl菌液，分别涂布于含适当抗生素的YEB选择平板上，28℃倒置培养两天。
(5)鉴定呈阳性的农杆菌EHA105单菌落，接种到含50mg/L利福平，100mg/L卡那霉素的20ml液体YEB培养基中，于28℃恒温摇床振荡培养30个小时至对数生长期，取适量农杆菌用液体MS培养基稀释20-30倍。
3.烟草的遗传转化及再生(1)取无菌烟草叶片，切除叶片边缘与中脉，于Ms+1.0mg/L NAA固体培养基中28℃预培养2天；(2)重新取出材料，放入无菌MS液体培养基稀释过的带有目的基因的农杆菌中，浸泡15分钟，然后在有28℃摇床中低速摇15分钟；(3)取出小叶片，用无菌滤纸吸去多余菌液，于MS固体培养基中28℃暗培养两天；(4)把小叶片，用加500mg/L Cb的无菌水洗两次，无菌滤纸吸去多余菌液后，转入含100mg/LKm和500mg/L Cb分化培养基M1中，28℃光下培养至分化出愈伤组织，直至长出芽，其间每15天继代一次；(5)将长至3-5cm的芽转入生根培养基1/2Ms上诱导生根。
(6)经鉴定为阳性转基因烟草后，继续培养成苗。
4.转基因烟草叶片类胡萝卜素的提取
(1)取各转基因烟草叶片，迅速冷冻干燥，制成冻干粉，置真空干燥箱中避光保存，并尽快测定。
(2)准确称取冻干粉1.000g于具塞三角瓶中，加入提取液(丙酮∶乙醇＝3∶2)45mL，摇匀，盖上瓶塞，用超声波提取20分钟，过滤于50mL容量瓶中并定容。取20mL滤液置分液漏斗中，加入10mL石油醚混匀，加入10mL蒸馏水进行分配，取石油醚相置旋转蒸发瓶中，剩余水加入10mL石油醚进行再分配，合并2次石油醚相置旋转蒸发仪上，40-45℃蒸干，用2.0mL异丙醇溶解，过滤后上机测定。
5.高效液相色谱法测定转基因烟草叶片类胡萝卜素(1)β-胡萝卜素标样的制备β-胡萝卜素标淮品(Sigma公司产品)1.0mg，用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解，溶液转入25.0ml容量瓶中，用石油醚定容，浓度为0.04mg/ml，冰箱保存。临用时，吸取1.0ml于10.0ml容量瓶中，加流动相至刻度，此时浓度为0.004mg/ml。
(2)番茄红素标样的制备番茄红素标淮品(Sigma公司产品)1.0mg，用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解，溶液转入25.0ml容量瓶中，用石油醚定容，浓度为0.04mg/ml，冰箱保存。临用时，吸取1.0ml于10.0ml容量瓶中，加流动相至刻度，此时浓度为0.004mg/ml。
(3)测定方法流动相乙腈∶三氯甲烷(92∶8)。检测波长双波长测定，470nm(0-min)和450nm(8-13min)。流速1.0mL/min。柱温35℃。观测样品在470nm与450nm处有吸收峰的大小变化。
本发明涉及的记号及序列分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度23bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.1GGTGGAAAGGTAGCTGCT/aTGGAA(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度20bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.2GGCATGCAA/tAGT/cCTC/tTCAGG(3)SEQ ID NO.3的信息
(i)序列特征(A)长度22bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3CCGGATGAACTTTCGATGCAGT(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)长度22bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.4ACGGAAATCCGCCTGAGAGACT(5)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)长度23bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.5AGTCTCGTACCAGTCTCCGTCAT(6)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)长度25bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.6ACCCAGCACATATCTCGTGCCTCCA(7)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)长度28bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.7TCCCCCGGGTGTGTGAGCAATGTTGAAT(8)SEQ ID NO.8的信息
(i)序列特征(A)长度25bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.8CGAGCTCGCGATTCTAGTGCACATT(9)SEQ ID NO.9的信息(i)序列特征(A)长度25bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.9GCTGTCAACGAIACGCTACGTAACG(10)SEQ ID NO.10的信息(i)序列特征(A)长度23bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.10CGCTACGTAACGGCATGACAGTG(11)SEQ ID NO.11的信息(i)序列特征(A)长度23bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.11CGACTGGAGCACGAGGACACTGA(12)SEQ ID NO.12的信息(i)序列特征(A)长度26bp(B)类型核苷酸
(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.12GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA
表1甘薯八氢番茄红素脱氢酶全长cDNA序列表<110>福建农林大学<120>甘薯八氢番茄红素脱氢酶全长cDNA序列表<160>1<170>Patent In Version 2.1<210>1<211>2181<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<221>gene<222>(1)…(2181)<400>Full length sequence of phytoene desaturase gene from Ipomoea batatas1CGAAAAAAAA TTTGACAACG ATTAGCTTCA ATTCAAATAT CCCATATGCA GTTTATAGAA61 AATTTTCCCC TGCTGTTCTT TCCCTCAAAA AGGATTAGTG GTGTGTGAGC AATGTTGAAT121 TGATACTCTT GAAGAATTAT AGTTTCCCAA AGTGATCGCG TTTTCAGTAT AGGATTTGGC181 AAAATGTCCC ACATTGGACA TGTTTCTGCT GTTAGCTTGC CGTCTTCCTC TAGAGTTGGT241 TGTCGTGTTG GTTCAGCAGA AGTAAATGCG CTATCATTTG GATCGAGCTA CTCAATGGGC301 TCTAAATTGA GGATTCCTAC TAGCAATGGT GTTATGCCCA AATTAGGGAG GGGGTACCGT361 CCTTTGAAGG TCGTTTGCAT GGACTATCCG AGGCCAGAAC TTGAGAATAC TGTTAACTAT421 ATCGAAGCTG CTTACCTGTC CTCTTCATTT CGTTCTGCTC CGCGTCCAAG TAAACCATTG481 GAAGTTGTTA TTGCTGGTGC CGGTTTGGCT GGGTTGTCTA CTGCAAAATA TTTAGCAGAT541 GCGGGCCACA AACCAATACT GCTGGAGGCA CGAGATGTGC TGGGAGGAAA GGTAGCTGCA601 TGGAAAGATG ATGACGGGGA CTGGTATGAG ACTGGCTTAC ACATATTCTT TGGGGCATAC661 CCGAATATAC AGAACCTGTT TGGAGAACTA GGCATCAATG ATCGCTTGCA GTGGAAGGAA721 CATTCTATGA TATTTGCAAT GCCAAACAAA CCAGGAGAGT TCAGCCGATT TGATTTCCCT781 GAAGTTTTAC CATCTCCATT TAACGGGGTG TGGGCCATCC TAAGGAATAA TGAGATGCTT841 ACGTGGCCGG AGAAAGTGAA GTTTGCTATT GGTCTGTTGC CAGCAATGCT TGGTGGACAG901 TCTTATGTTG AAGCTCAAGA TGGGATATCT GTTAAGGACT GGATGAGAAA GCAGGGTATA961 CCAGACAGGG TGACTGATGA GGTGTTCATT GCCATGTCAA AGGCTCTGAA TTTCATTAAT1021 CCGGATGAAC TTTCGATGCA GTGCATATTG ATTGCTTTGA ACAGATCTCT TCAGGAGAAA1081 CATGGTTCAA AAATGGCCTT TTTAGACGGA AATCCGCCAG AAAGGCTTTG CTTGCCGATT1141 GTTGAACATA TCAAGTCACG AGGCGGTAAA GTCAAACTTA ACTCACGTAT AAATAAAATT1201 GAGCTGAATG AAGATGGAAG TGTCAAGAGT TTTCTTCTAA GTAATGGAAC TGTTATTAAA
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表2 Percent Identity70％in nt overlap1CTTTTACTAGTTATAGCATTCGGTATCTTTTTCTGGGTAACTGCCAAACCACCACAAATT61 ACAAGTTTCCATTTAACTCTTCAACTTCAACCCAACCAAATTTATTTCCTTAATTGTGCA121 GAACCACTCCCTATATCTTCTAGGTGCTTTCATTCGTTCCGAGGTAAGAAAAGATTTTTG181 TTTCTTTGAATGCTTTATGCCACTCGTTTAACTTCTGAGGTTTGTGGATCTTTTAGGCGA1..............CGAAAAAAAATTTGACAACGATTAGCTTCAATTCAAATATCCCATA| |||||||| | ||||| |||| |241 CTTTTTTTTTTTTTGTATGTAAAATTTGTTTCATAAATGCTTC...TCAACATAAATCTT47 TGCAGTTTATAGAAAATTTTCCCCTGCTGTTCTTTCCCTCAAAAAGGATTAGTGGTGTGT|| || || ||| || | | |||| | ||| |||298 GACAAAGAGAAGGAATTTTACCAAGTATTTAGGTTCAGAAATGGATAATTTTCTTACTGT107 GAGCAATGTTGAATTGATACTCTTGAAGAATTATAGTTTCC.......CAAAGTGATCGC|| || | || | | ||| || |||| || |358 GAAATATCCTTATGGCAGGTTTTACTGTTATTTTTCAGTAAAATGCCTCAAATTGGACTT160 GTTTTCAGTATAGGATTTGGCAAAATGTCCCACATTGGACATGTTTCTGCTGTTAGCTTG||||| ||| || || ||||| |418 GTTTCTGCTGTTAACTTGAGAGTCCAAGGTAGTTCAGCTTATCTTTGGAGCTCGAGGT..
220 CCGTCTTCCTCTAGAGTTGGTTGTCGTGTTGGTTCAGCAGAAGTAAATGCGCTATCATTT||||||| | || || |||| | ||||| || ||| || ||| |||476 .CGTCTTCTTTGGGAACTGAAAGTCGAGATGGTTGCTTGCAAAGGAATTCGTTATGTTTT280 GGATCGAGCTACTCAATGGGCTCTAAATTGAGGATTCCTACTAGCAATGGTGTTATGCCC| ||| | |||||||| |||| || ||||| |||| | ||| |535 GCTGGTAGCGAATCAATGGGTCATAAGTTAAAGATTCGTACTCCCCATGCCACGACCAGA340 AAATTAGGGAGGGGGTACCGTCCTTTGAAGGTCGTTTGCATGGACTATCCGAGGCCAGAA| ||| | | || | | ||||| |||||||| ||||| || ||||| || |||||595 AGATTGGTTAAGGACTTGGGGCCTTTAAAGGTCGTATGCATTGATTATCCAAGACCAGAG400 CTTGAGAATACTGTTAACTATATCGAAGCTGCTTACCTGTCCTCTTCATTTCGTTCTGCT|| || ||||| ||||||||| | || ||||| | | || || | || ||| || ||655 CTGGACAATACAGTTAACTATTTGGAGGCTGCATTTTTATCATCAACGTTCCGTGCTTCT460 CCGCGTCCAAGTAAACCATTGGAAGTTGTTATTGCTGGTGCCGGTTTGGCTGGGTTGTCT||||| |||| |||||||||||| |||||||||||||||| ||||||| ||| ||||||715 CCGCGCCCAACTAAACCATTGGAGATTGTTATTGCTGGTGCAGGTTTGGGTGGTTTGTCT
520 ACTGCAAAATATTTAGCAGATGCGGGCCAGAAACCAATACTGCTGGAGGCACGAGATGTG|| ||||||||||| |||||||| || |||||||| ||||||||||||||| | |||||775 ACAGCAAAATATTTGGCAGATGCTGGTCACAAACCGATACTGCTGGAGGCAAGGGATGTT580 CTGGGAGGAAAGGTAGCTGCATGGAAAGATGATGACGGGGACTGGTATGAGACTGGCTTA|| || |||||||||||||||||||||||||||| || || ||||| |||||||| ||835 CTAGGTGGAAAGGTAGCTGCATGGAAAGATGATGATGGAGATTGGTACGAGACTGGTTTG640 CACATATTCTTTGGGGCATACCCGAATATACAGAACCTGTTTGGAGAACTAGGCATCAAT|| |||||||||||||| ||||| ||||| |||||||||||||||||| |||| || ||895 CATATATTCTTTGGGGCTTACCCAAATATTCAGAACCTGTTTGGAGAATTAGGGATTAAC700 GATCGCTTGCAGTGGAAGGAACATTCTATGATATTTGCAATGCCAAACAAACCAGGAGAG||||| ||||| |||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||| ||||||||955 GATCGATTGCAATGGAAGGAACATTCAATGATATTTGCAATGCCAAGCAAGCCAGGAGAA760 TTCAGCCGATTTGATTTCCCTGAAGTTTTACCATCTCCATTTAACGGGGTGTGGGCCATC|||||||| ||||||||| | |||| |||||| |||| || || || | | ||||||1015 TTCAGCCGCTTTGATTTCTCCGAAGCTTTACCCGCTCCTTTAAATGGAATTTTAGCCATC820 CTAAGGAATAATGAGATGCTTACGTGGCCGGAGAAAGTGAAGTTTGCTATTGGTCTGTTG||| |||||| || |||||||| ||||| |||||||| || ||||| ||||| || |||1075 TTAAAGAATAACGAAATGCTTACATGGCCAGAGAAAGTCAAATTTGCAATTGGACTCTTG880 CCAGCAATGCTTGGTGGACAGTCTTATGTTGAAGCTCAAGATGGGATATCTGTTAAGGAC|||||||||||||| || || ||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||1135 CCAGCAATGCTTGGAGGGCAATCTTATGTTGAAGCTCAAGATGGGATAAGTGTTAAGGAC940 TGGATGAGAAAGCAGGGTATACCAGACAGGGTGACTGATGAGGTGTTCATTGCCATGTCA|||||||||||||| ||| | || ||||||||||| ||||||||||||||||| ||||||1195 TGGATGAGAAAGCAAGGTGTGCCGGACAGGGTGACAGATGAGGTGTTCATTGCTATGTCA1000 AAGGCTCTGAATTTCATTAATCCGGATGAACTTTCGATGCAGTGCATATTGATTGCTTTG||||| || || || || || || || |||||||| ||||||||||| ||||| || |||1255 AAGGCACTCAACTTTATAAACCCTGACGAACTTTCAATGCAGTGCATTTTGATCGCATTG1060 AACAGATCTCTTCAGGAGAAACATGGTTCAAAAATGGCCTTTTTAGACGGAAATCCGCCA||||| | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || ||||| ||1315 AACAGGTTTCTTCAGGAGAAACATGGTTCAAAAATGGCCTTTTTAGATGGTAATCCTCCT1120 GAAAGGCTTTGCTTGCCGATTGTTGAACATATCAAGTCACGAGGCGGTAAAGTCAAACTT|| || |||||| |||||||||||||||| || ||||| ||| || |||||| |||1375 GAGAGACTTTGCATGCCGATTGTTGAACACATTGAGTCAAAAGGTGGCCAAGTCAGACTG1180 AACTCACGTATAAATAAAATTGAGCTGAATGAAGATGGAAGTGTCAAGAGTTTTCTTCTA|||||||| ||||| || |||||||||||||| ||||||||||||||||||||| | ||
1435 AACTCACGAATAAAAAAGATTGAGCTGAATGAGGATGGAAGTGTCAAGAGTTTTATACTG1240 AGTAATGGAACTGTTATTAAAGGAGATGCTTTTGTGTTCGCTGGGCCTGTTGATATCCTG||| | || | || || | |||||||||||||||| || | || || ||||| |1495 AGTGACGGTAGTGCAATCGAGGGAGATGCTTTTGTGTTTGCCGCTCCAGTGGATATTTTC1300 AAGCTTCTTTTGCCCGAGGACTGGAAAGAGATCCCATATTTCAAAAAGCTGGAGAAATTA|||||||| ||||| || |||||||||||||| ||||||||| ||||| ||||||| |||1555 AAGCTTCTATTGCCTGAAGACTGGAAAGAGATTCCATATTTCCAAAAGTTGGAGAAGTTA1360 GTTGGAGTTCCCGTAATAAATGTTCATATATGGTTTGACAGAAAACTGAAGAACACATAC|| ||||| || || |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||1615 GTCGGAGTACCTGTGATAAATGTACATATATGGTTTGACAGAAAACTGAAGAACACATAT1420 GATCATCTCCTCTTTAGCAGAAGCTCACTTCTGAGTGTGTATGCTGACATGTCGGTAACA|||||| | ||||| |||||||||||||| || |||||||||||||||||||| || |||1675 GATCATTTGCTCTTCAGCAGAAGCTCACTGCTCAGTGTGTATGCTGACATGTCTGTTACA1480 TGCAAGGAATATTACAACCCCAATCAGTCTATGTTGGAGTTGGTGTTCGCGCCTGCAGAA|| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| || || |||||||||1735 TGTAAGGAATATTACAACCCCAATCAGTCTATGTTGGAATTGGTTTTTGCACCTGCAGAA1540 GAATGGGTGTCAAAAAGCGACTCAGAAATTATAGAAGCTACGATGAAGGAACTAGCCAAA|| ||| | ||||||||||||||||||| || || ||||||||||||||||| |1795 GAGTGGATATCTCGCAGCGACTCAGAAATTATTGATGCAACGATGAAGGAACTAGCAACG1600 TTGTTTCCCGACGAAATTTCTGCTGATCAGAGCAAAGCAAAAATACTGAAGTACCATGTT| ||||| || |||||||| || ||||| |||||||||||||| |||||||||||||||1855 CTTTTTCCTGATGAAATTTCAGCAGATCAAAGCAAAGCAAAAATATTGAAGTACCATGTT1660 GTCAAAACTCCAAGGTCTGTGTACAAAACCGTGCCAGGATGTGAGCCATGTCGCCCCTTG||||||||||| |||||||| || ||||| |||||||| || || || ||||| || ||1915 GTCAAAACTCCGAGGTCTGTTTATAAAACTGTGCCAGGTTGTGAACCCTGTCGGCCTTTA1720 CAAAAATCCCCCATAGACGGATTCTATTTAGCAGGCGACTACACGAAACAGAAGTACTTG|||| |||||| ||||| || || |||||||| || ||||||||||||||||| ||||||1975 CAAAGATCCCCAATAGAGGGGTTTTATTTAGCCGGTGACTACACGAAACAGAAATACTTG1780 GCTTCAATGGAAGGCGCTGTTCTATCCGGGAAGCTTTGTGCACAGGCGATTTTAAAGGAT|||||||||||||||||||| |||| || ||||||||||| || || ||| || |||||2035 GCTTCAATGGAAGGCGCTGTCTTATCAGGAAAGCTTTGTGCTCAAGCTATTGTACAGGAT1840 TACGAGTCACTCCTCGCTCGACAGCAGAAAATGCTGGCCGAGGCAAGCGCAAACATCAGT|| |||| ||| | | |||| || | | || | || ||||||| ||2095 TATGAGTTACTTGTTGGACGTAGCCAAAAGAAGTTGTCGGAAGCAAGCGTAGTTTAGCTT
1900 TGAAAACGAACTTAACCTGTTCTAATGTGCACTAGAATCGCGAGGTCGTTGAACCAAGTT|| || | || | || | | | || || |||2155 TGTGGTTATTATTTAGCTTCTGTACACTAAATTTATGATGCAAGAAGCGTTGTACACAAC1960 ATTTAGGTAGATTGTGTACAGTACTGCATATACCAAGAACACACCAAAATTGAGAAGAAG|| |||| ||||| ||| || | || ||| | |2215 ATATAGAAGAAGAGTGCGAGGTGAAGCAAGTAGGAGAAATGTTAGGAAAGCTCCTATACA2020 ATGCAATGTGTAACCTGGTAAAAGGACAAGCTAGGAAACATCTGAATTCATGTAAAGCTG||||2275 AAAGGATGGCATG...............................................
2080 ATATACCATGTTTGTTGATGCTGTTAAGAATTTTGAAGGTCCATAGCCTTCTTTACT...
|||||| | |||| | |||2288 ................................TTGAAGAT...TAGCATCTTTTTAATCC2137 .AAGTAGCAATCCAGCCTGTTTACATCTGTTTTAGCAAAAAAAAAA||||||| | | | | ||2313 CAAGTTTAAATATAAAGCATATTTTATGGAATTC上列甘薯八氢番茄红素脱氢酶的cDNA序列下列番茄八氢番茄红素脱氢酶的核酸序列(GenBank Accession No.X59948)
权利要求
1.编码甘薯八氢番茄红素脱氢酶的cDNA序列，其特征是从红心甘薯块根分离克隆而得，其全长cDNA核苷酸序列的长度为2,181bp，其中开放阅读框位于184-1868位核苷酸，具体如下1 CGAAAAAAAA TTTGACAACG ATTAGCTTCA ATTCAAATAT CCCATATGCA GTTTATAGAA61AATTTTCCCC TGCTGTTCTT TCCCTCAAAA AGGATTAGTG GTGTGTGAGC AATGTTGAAT121 TGATACTCTT GAAGAATTAT AGTTTCCCAA AGTGATCGCG TTTTCAGTAT AGGATTTGGC181 AAAATGTCCC ACATTGGACA TGTTTCTGCT GTTAGCTTGC CGTCTTCCTC TAGAGTTGGT241 TGTCGTGTTG GTTCAGCAGA AGTAAATGCG CTATCATTTG GATCGAGCTA CTCAATGGGC301 TCTAAATTGA GGATTCCTAC TAGCAATGGT GTTATGCCCA AATTAGGGAG GGGGTACCGT361 CCTTTGAAGG TCGTTTGCAT GGACTATCCG AGGCCAGAAC TTGAGAATAC TGTTAACTAT421 ATCGAAGCTG CTTACCTGTC CTCTTCATTT CGTTCTGCTC CGCGTCCAAG TAAACCATTG481 GAAGTTGTTA TTGCTGGTGC CGGTTTGGCT GGGTTGTCTA CTGCAAAATA TTTAGCAGAT541 GCGGGCCACA AACCAATACT GCTGGAGGCA CGAGATGTGC TGGGAGGAAA GGTAGCTGCA601 TGGAAAGATG ATGACGGGGA CTGGTATGAG ACTGGCTTAC ACATATTCTT TGGGGCATAC661 CCGAATATAC AGAACCTGTT TGGAGAACTA GGCATCAATG ATCGCTTGCA GTGGAAGGAA721 CATTCTATGA TATTTGCAAT GCCAAACAAA CCAGGAGAGT TCAGCCGATT TGATTTCCCT781 GAAGTTTTAC CATCTCCATT TAACGGGGTG TGGGCCATCC TAAGGAATAA TGAGATGCTT841 ACGTGGCCGG AGAAAGTGAA GTTTGCTATT GGTCTGTTGC CAGCAATGCT TGGTGGACAG901 TCTTATGTTG AAGCTCAAGA TGGGATATCT GTTAAGGACT GGATGAGAAA GCAGGGTATA961 CCAGACAGGG TGACTGATGA GGTGTTCATT GCCATGTCAA AGGCTCTGAA TTTCATTAAT1021 CCGGATGAAC TTTCGATGCA GTGCATATTG ATTGCTTTGA ACAGATCTCT TCAGGAGAAA1081 CATGGTTCAA AAATGGCCTT TTTAGACGGA AATCCGCCAG AAAGGCTTTG CTTGCCGATT1141 GTTGAACATA TCAAGTCACG AGGCGGTAAA GTCAAACTTA ACTCACGTAT AAATAAAATT1201 GAGCTGAATG AAGATGGAAG TGTCAAGAGT TTTCTTCTAA GTAATGGAAC TGTTATTAAA1261 GGAGATGCTT TTGTGTTCGC TGGGCCTGTT GATATCCTGA AGCTTCTTTT GCCCGAGGAC1321 TGGAAAGAGA TCCCATATTT CAAAAAGCTG GAGAAATTAG TTGGAGTTCC CGTAATAAAT1381 GTTCATATAT GGTTTGACAG AAAACTGAAG AACACATACG ATCATCTCCT CTTTAGCAGA1441 AGCTCACTTC TGAGTGTGTA TGCTGACATG TCGGTAACAT GCAAGGAATA TTACAACCCC1501 AATCAGTCTA TGTTGGAGTT GGTGTTCGCG CCTGCAGAAG AATGGGTGTC AAAAAGCGAC1561 TCAGAAATTA TAGAAGCTAC GATGAAGGAA CTAGCCAAAT TGTTTCCCGA CGAAATTTCT1621 GCTGATCAGA GCAAAGCAAA AATACTGAAG TACCATGTTG TCAAAACTCC AAGGTCTGTG1681 TACAAAACCG TGCCAGGATG TGAGCCATGT CGCCCCTTGC AAAAATCCCC CATAGACGGA1741 TTCTATTTAG CAGGCGACTA CACGAAACAG AAGTACTTGG CTTCAATGGA AGGCGCTGTT1801 CTATCCGGGA AGCTTTGTGC ACAGGCGATT TTAAAGGATT ACGAGTCACT CCTCGCTCGA1861 CAGCAGAAAA TGCTGGCCGA GGCAAGCGCA AACATCAGTT GAAAACGAAC TTAACCTGTT1921 CTAATGTGCA CTAGAATCGC GAGGTCGTTG AACCAAGTTA TTTAGGTAGA TTGTGTACAG1981 TACTGCATAT ACCAAGAACA CACCAAAATT GAGAAGAAGA TGCAATGTGT AACCTGGTAA2041 AAGGACAAGC TAGGAAACAT CTGAATTCAT GTAAAGCTGA TATACCATGT TTGTTGATGC2101 TGTTAAGAAT TTTGAAGGTC CATAGCCTTC TTTACTAAGT AGCAATCCAG CCTGTTTACA2161 TCTGTTTTAG CAAAAAAAAA A
全文摘要
本发明提供了编码甘薯八氢番茄红素脱氢酶的cDNA序列，从红心甘薯块根分离克隆而得，其全长cDNA的长度为2,181bp，开放阅读框1,685bp，详细序列如表1，八氢番茄红素脱氢酶催化八氢番茄红素脱氢，依次形成六氢番茄红素和ζ－胡萝卜素，是甘薯β－胡萝卜素合成的关键酶，因此该cDNA序列有重要的应用价值。
文档编号C12N15/53GK1757735SQ200510080849
公开日2006年4月12日 申请日期2005年6月27日 优先权日2005年6月27日
发明者郑金贵, 陈选阳, 刘峰, 许明, 黄志伟 申请人:福建农林大学