专利名称：一种肠道致病菌的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及细菌检测技术，且特别涉及一种肠道致病菌的快速检测方法。
背景技术：
肠道传染病是全球性重要公共卫生问题之一，亚、非、拉地区尤为严重。根据WHO的资料，上述地区5岁以下儿童每年因肠道传染病死亡者约500万以上，发病约7.5亿～10亿人次。即使在经济发达的国家和地区也存在上述问题，例如美国、日本等国出血性大肠杆菌O157H7肠炎的严重流行即可说明这一事实。我国是发展中国家，卫生基础薄弱，经济、文化等尚不发达，加以幅员辽阔，人口众多，各地差别大而发展又不平衡，从而给肠道传染病的预防和控制带来一定困难。由于肠道传染病是导致儿童营养不良、生长发育障碍和成人劳动力大量损失的重要因素之一，因而直接危害人民健康和社会经济的可持续发展，必须引起足够的重视(魏承毓.我国肠道传染病的基本状况与防制对策.中国公共卫生，2004.1，20(1))。
目前对肠道致病菌引起的疾病的通用检测方法是先挑取少量粪便样品平板划线分离单菌落，再挑取单菌落进行二次培养，最后用生化鉴定和对O抗原和H抗原(主要是O抗原)的抗血清凝集反应鉴定所感染的细菌种类。此法的缺点在于灵敏度低，耗时长，漏检率高，而且世界上没有任何国家生产全套用于鉴定的抗血清。因此急需使用更快速、准确、可靠的方法检测肠道重要致病菌。
其中PCR技术和生物芯片技术是目前较好的检测肠道致病菌的方法。PCR技术本身的优越性无可厚非，自1989年开始被应用于临床检验以来，以其快速、简便、灵敏等优点很快地成为临床实验诊断学的一个技术热点。而自1997年7月Affymetric，Inc.(Santa Clara，CA)公司的Thomas R.等人发明了以生物芯片技术对微生物进行定种和表型分析的方法(第6,228,575号美国专利)以来，其因具有敏感度高、特异性强、大规模集成化、自动化、操作简便快捷、效率高等特点，而受到科研人员的青睐。
但上述两种方法目前尚无法用于临床诊断，这是因为在检测过程中，对粪便样品处理主要存在两方面的难点，其一是粪便样品干重的1/3为各种肠道内正常菌群，细菌的数量庞大，种类繁多，从大量的正常菌群中检测致病菌难度大；其二是粪便样品中的各种食物残渣中含有胆盐、胆红素、尿胆素原、多聚糖等多种PCR抑制物，使得从粪便样品中提取的DNA无法直接用PCR等方法检测(Sandrina Stacy-phipps.1995.Multiplex PCRassay and simple preparation method for stool specimens detectEnterotoxigenic Escherichia coli DNA during course of infection.J.Clin.Microbiol.331054-1059)。所以，目前还没有从粪便中提取可用于PCR和生物芯片检测的致病菌DNA的可靠方法。
目前对粪便的处理主要有以下几种方法1)用特定试剂使粪便样品中菌体DNA释放出来。这种方法因粪便样品成分复杂，使提取出的DNA杂质含量高，导致检测的灵敏度低、特异性差、错误率高。
2)用一定的试剂处理粪便样品后再将处理液过纯化、分离柱，以此得到较纯DNA。此方法因需要大量的纯化、分离柱，一方面，导致费用较高；另一方面，样品在过柱时损失较大，导致检测灵敏度低、漏检率高。
3)通过对传统方法的适当改进来提取粪便样品中DNA。此方法一般都存在灵敏度低，特异性差，漏检率高的情况。
综上所述，有必要发明出一种经过改进的粪便样品处理方法，利用该方法可快速、可靠地提取到用于PCR或基因芯片等快速检测肠道致病菌技术所需的DNA。
发明内容
鉴于上述情况，本发明的目的是提供一种快速处理粪便样品的方法，以利于后续DNA提取工作的进行，使其适应肠道致病菌的快速检测。
为了达到上述目的，本发明提出一种使粪便样品中的肠道重要致病菌迅速增殖，从而快速、可靠得检测出肠道致病菌种类的方法，该方法包括下列步骤步骤一，取欲检测的粪便样品，以无菌操作将其转入至少20ml肠道致病菌所用的培养基中，室温培养至少5小时；步骤二，按照常规方法提取上述培养后的样品中的DNA；步骤四，利用PCR或生物芯片检测技术对上述DNA进行处理，以鉴定上述样品中的肠道致病菌种类。
在本发明的一较佳实施例中，上述步骤一所述的肠道致病菌所用的培养基的使用量为30ml。
在本发明的另一较佳实施例中，上述步骤一所述的室温培养时间为5-6小时。
在本发明的另一较佳实施例中，上述步骤一所述的肠道致病菌所用的培养基为2×YT培养基。
基于上述技术方案，本发明仅需很少量的粪便样品即可进行检测，而且可快速、可靠地提取到用于PCR或基因芯片等快速检测肠道致病菌技术所需的DNA。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举最佳实施例，作详细说明如下。
具体实施例方式
下面通过最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。以下实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。
粪便样品的培养取欲检测的粪便样品少许，例如约为0.3克，以无菌操作将其转入30ml的2×YT培养基[培养基配方参见(美)J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南(第二版)，科学出版社，1999909]中，220rpm37℃培养5-6小时。此时粪便样品中的致病菌浓度可达到提取基因组的较适浓度。
在上述粪便样品的培养过程中，所选择的培养基种类、培养基使用量和培养时间均为经大量实验摸索后确定的最佳条件。
1.培养基在本发明的上述最佳实施例中，所选用的2×YT培养基因与一般的肠杆菌属细菌的选择性培养基相比，其营养成分丰富，可使包括大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌等在内的绝大部分肠道致病菌快速增殖，而一般的肠杆菌属细菌的选择性培养基只能将大肠杆菌、志贺氏菌等少数肠杆菌属细菌培养出来，而不能将绝大多数的肠道致病菌培养出来，因此使用2×YT培养基对培养肠道致病菌可获得最好的培养效果，与其他培养基相比，导致漏检的可能性小，增菌快速，体现了快速检测的特点。
2.培养时间本发明对上述粪便的培养时间分别做了2小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时和6小时几个梯度，实验结果表明，当培养时间为2小时，待检测细菌的特异PCR反应结果为阴性；当培养时间分别为4小时和4.5小时，待检测细菌的特异PCR反应结果多数为阳性，但不稳定，有不同程度的阴性结果出现；当培养时间分别为5小时、5.5小时和6小时，待检测细菌的特异PCR反应结果为稳定的阳性；培养时间过长(超过6小时)并不能使实验效果更好，且影响此方法快速的特点，因此在本发明的最佳实施例中，确定5-6小时为最佳培养时间。
3.培养基使用量培养基使用量的选择对是否能够快速、可靠的进行后续肠道致病菌的检测也具有重要作用，这是因为所选择的培养基使用量既要保证快速富集到待检测的致病菌，又要利用一定量的培养基来稀释粪便样品中的PCR抑制成分。本发明做了10ml、20ml和30ml几个梯度，实验结果表明，30ml培养基对PCR抑制成分的稀释效果最好，20ml和10ml培养基的稀释效果不稳定，有时会出现培养物中的PCR抑制成分浓度偏高，影响PCR扩增的情况。因为不同人的粪便样品，以及同一个人不同时间的样品中所含的PCR抑制成分的浓度不同，因此在本发明的最佳实施例中选择了稀释效果较好的30ml培养基。而大于30ml的使用量，会降低待测细菌的起始菌浓，使培养时间相应增加，从而达不到快速处理粪便样品的效果。
为确定所需的最佳培养基使用量和培养时间，本发明利用550份来源不同的正常人粪便样品，向其中混入待测细菌，形成起始菌浓≥103cfu/g的粪便模拟样品，分别在下表所列的培养条件下进行实验，并用特异PCR反应来检测从粪便样品培养物中提取的DNA的质量。在每个培养条件下进行10次重复实验，10次重复实验均得到阳性结果的用“+”表示；10次重复实验中只有一部分得到阳性结果的用“±”表示；10次重复实验均得到阴性结果的用“-”表示。经过一系列摸索实验最终确定了30ml培养基培养5-6个小时为最佳培养条件。
表不同培养基使用量、培养时间条件下的特异PCR反应结果
这里需要说明的是，在上述快速处理粪便样品的方法中，粪便样品的检测量、培养基的使用量和培养基种类以及培养时间并非特别限定于上述的数值。所属技术领域的技术人员应该知道，这些具体数值仅是通过一系列的梯度实验摸索出来的最佳试验数值。
粪便样品DNA的提取接下来可用传统方法或基因组DNA提取试剂盒提取上述培养后菌液的DNA。以下以使用天为时代科技有限公司生产的离心柱型血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒I提取上述处理后的粪便样品基因组为例来进行说明。
1)对于每一个待测的样品，平行取2个1.2ml培养后菌液加入到2个1.5ml灭菌离心管中，12000rpm室温离心8分钟，弃上清。
2)加入250μl缓冲液GA将菌体重悬。
3)加入10μl 50mg/ml的蛋白酶K，充分混匀；再加入250μl缓冲液GB，充分混匀，70℃水浴至溶液澄清(约20分钟)。
4)加入250μl无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
5)将所得的溶液和絮状沉淀全部转移到一个吸附柱CB中(吸附柱放入废液收集管中)12000rpm室温离心1分钟(直至液体全部离下)，弃液。
6)加入500μl去蛋白液GD(已混入无水乙醇)，12000rpm室温离心30秒，弃废液。
7)加入700μl漂洗液GW(已混入无水乙醇)，12000rpm室温离心30秒，弃废液。
8)加入500μl漂洗液GW(已混入无水乙醇)，12000rpm室温离心30秒，弃废液。
9)将吸附柱CB放回废液收集管中，12000rpm室温离心2分钟，尽量去除漂洗液。
10)将吸附柱CB转入一个干净的离心管中，加入100μl 70℃的洗脱缓冲液，室温静置5分钟，12000rpm室温离心30秒。
11)将离心得到的溶液再加入到吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm室温离心两分钟。
12)收集离下液，100℃水浴5分钟，自然冷却至室温，此时可直接使用用于PCR操作、生物芯片检测，或放入-20℃冻存(此提取物最多存放一个星期)。
粪便样品DNA的检测最后，利用公知的PCR或生物芯片检测技术对上述得到的DNA进行处理，以鉴定待测样品中肠道致病菌的种类。
综上所述，本发明通过对培养基种类、培养时间和培养基使用量的选择，获得最佳的粪便样品的培养条件，从而实现了仅需很少量的粪便样品即可快速、可靠检测出肠道致病菌的目的。
虽然本发明已以最佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可做些许的更动与改进，因此本发明的保护范围应以权利要求所界定者为准。
权利要求
1.一种肠道致病菌的检测方法，其特征是包括以下步骤步骤一，取欲检测的粪便样品，以无菌操作将其转入至少20ml肠道致病菌所用的培养基中，室温培养至少5小时；步骤二，按照常规方法提取培养后的样品中的DNA；步骤三，利用PCR或生物芯片检测技术对上述DNA进行处理，以鉴定上述样品中的肠道致病菌种类。
2.根据权利要求1所述的肠道致病菌的检测方法，其特征是上述步骤一中，肠道致病菌所用的培养基的使用量为30ml。
3.根据权利要求1所述的肠道致病菌的检测方法，其特征是上述步骤一中，室温培养时间为5-6小时。
4.根据权利要求1-3之任一所述的肠道致病菌的检测方法，其特征是上述步骤一中，肠道致病菌所用的培养基为2×YT培养基。
全文摘要
本发明涉及一种肠道致病菌的快速检测方法。该方法包括以下步骤首先，取欲检测的粪便样品，以无菌操作将其转入至少20ml肠道致病菌所用的培养基中，室温培养至少5小时；然后，按照常规方法提取培养后的样品中的DNA；最后，利用PCR或生物芯片检测技术对上述DNA进行处理，以鉴定上述样品中的肠道致病菌种类。本发明仅需很少量的粪便样品即可快速、可靠地检测出肠道致病菌的种类。
文档编号C12Q1/04GK1982475SQ20051013212
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月16日 优先权日2005年12月16日
发明者王磊, 冯露, 韩巍青, 李雅玥 申请人:天津生物芯片技术有限责任公司