专利名称：高转化率高纯度糖化酶浓缩液的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种作用在糖基化合物上的水解酶的生产方法，具体地说，涉及一种高转化率高纯度糖化酶浓缩液的生产方法。
背景技术：
糖化酶作为一种生物催化剂，主要应用于食品发酵、医药等行业淀粉的糖化酶过程(即是将淀粉转化为葡萄糖)，其作用原理为糖化酶作用于淀粉的α-1.4糖苷键，将淀粉逐个水解为葡萄糖，如应用于酒精工业中，首先由糖化酶将淀粉质原料水解为葡萄糖。然后通过酵母发酵，将葡萄糖转化为乙醇(酒精)和二氧化碳，从而完成酒精的生产。而目前我国生产的糖化酶主要存在的问题是由于制取糖化酶的发酵和纯化工艺不尽合理，使得糖化酶成品酶系不纯，特别是成品中含有较多α-淀粉酶和葡萄糖转苷酶(一般含α-淀粉酶200u/ml、葡萄糖转苷酶100u/ml以上)，α-淀粉酶存在于糖化酶成品中，影响糖化酶活力测定的准确性，从而影响使用的准确定量，对糖化工艺产生不利影响；葡萄糖转苷酶在应用过程中将葡萄糖转化为非发酵性潘糖和异麦芽糖，影响葡萄糖的得率。现有生产的糖化酶由于存在着以上不足，因此进一步使得DE值(即葡萄糖转化率)一般只有95％左右而难以提高。
发明内容
为了解决现有糖化酶的生产工艺存在着的糖化酶成品酶系不纯以及进而影响到使用时葡萄糖转化率(DE值)不够高的问题，本发明的目的，乃是提高一种高转化率高纯度糖化酶浓缩液的生产方法，从而降低糖化酶成品中α-淀粉酶和葡萄糖转苷酶的含量，进而提高糖化酶成品使用时的葡萄糖转化率。
本发明的解决方案如下(a)在一级种子罐中按下列重量配比装入用于种子培养的原料8～17％的碳原，1～3％的玉米浆，1～2％的硫酸铵，80％～88％的水；(b)在二级种子罐中按下列重量配比装入用于种子培养的原料8～17％的碳原，2～4％的豆饼粉，0.01～0.015％的α-淀粉酶，0.008～0.01％的生物素，80％～88％的水；且二级种子罐和一级种子罐用于种子培养的总原料分别按78％～88％比12～22％的重量比例进行配置；(c)在发酵罐中按下列重量配比装入用于种子培养后进行发酵的原料15～27％的碳原，3～7％的豆饼粉，0.3～0.5％的硫酸铵，2～7％流加的液氨，0.025～0.05％的α-淀粉酶，0.005～0.01％的生物素，62％～75％的水；且发酵罐用于发酵的总原料和二级种子罐用于种子培养的总原料分别按82～90％比10～18％的重量比例进行配置；(d)在纯化预处理罐中按下列重量配比装入用于经发酵后进行纯化预处理的原料2～5％的钠基膨润土，95％～98％的经酸化处理后的水；(e)在已装入种子培养原料的一级种子罐中按下列重量配比接入黑曲霉菌种0.05～0.6％的黑曲霉菌种，99.4～99.95％的一级种子罐用于种子培养的总原料重量；一级种子罐内培养温度为34℃±1℃，压力为0.08～0.1Mpa，通气量为1∶1～1.2，初发酵PH值为4.8～5.0，培养时间为25～40hr；(f)将培养成熟的一级种子罐菌种液移至二级种子罐中进行扩大培养，培养温度为34℃±1℃，罐内压力为0.05～0.08Mpa，通气量为1∶0.7～1，初发酵PH值为4.8～5.0，中期用流加液氨的方法控制PH值为4.7±1，培养时间为35～50hr；(g)将二级种子罐中培养成熟的菌种液移至装入发酵原料的发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为34℃±1℃，罐内压力为0.05～0.07Mpa，通气量为1∶0.5～1，初发酵PH值为4.8～5.0，当PH值下降至4.5左右时，用流加液氨的方法控制PH值为4.7±1，发酵过程中，当DE值下降至25-30时，以每小时2.5～1000L的耗用量，添加灭菌糖浆进行补料，保持在发酵过程中发酵液合理的碳、氮比和渗透压，发酵时间为135～170hr；(h)发酵完成后将成熟发酵液放入已装好预处理原料的纯化预处理罐中进行纯化预处理，处理温度为20℃～30℃，PH值为2.8～3.2，处理时间为1.5～3hr，发酵液经预处理后通过板框压滤机进行固液分离，分离后的酶液再进行超滤浓缩，浓缩后的酶液进行精滤除菌，精滤除菌后的酶液经理化检测合格后进行调配，即得成品酶。
本发明方法的有益效果是，可大幅度提高糖化酶发酵水平，糖化酶成品酶系纯度高，可明显提高DE值(葡萄糖转化率)；此外，由于采用脉冲补料发酵工艺，可提高设备利用率，节约能源，纯化提取过程中通过纯化预处理后，排放废水污染指标大大减少，有利于环境保护。利用本生产方法生产的糖化酶，主要技术指标达到国际同类产品先进水平，其主要技术性能指标如下糖化酶活力150000u/ml；α-淀粉酶含量未检出(即基本上为0u/ml)；葡萄糖转苷酶含量≤10u/ml；细菌总数＜100个/ml；DE值(葡萄糖转化率)＞98％。
具体实施例方式
实施例一一级种子罐采用1M3罐，定容0.8，罐中按总重量800kg配料，其中含碳原80kg，玉米浆8kg，硫酸铵8kg，水704kg；二级种子罐采用5M3罐，定容0.8，罐中按总重量4000kg配料，其中含碳原400kg，豆饼粉80kg，α-淀粉酶0.4kg，生物素0.32kg，水3519.28kg，因此二级种子罐和一级种子罐用于种子培养的总原料是分别按83.3％比16.7％(即4000kg∶800kg＝5∶1)的重量比例进行配置；发酵罐采用30M3罐，定容0.9，罐中按总重量27000kg配料，其中含碳原4960Kg，豆饼粉1080Kg，硫酸铵100kg，流加液氨880Kg，α-淀粉酶8.1kg，生物素1.62Kg，水19970.28kg，因此发酵罐用于发酵的总原料和二级种子罐用于种子培养的总原料是分别按87％比13％(即27000Kg∶4000kg＝6.7∶1)的重量比例进行配置；纯化预处理罐内装入钠基膨润土940kg，经酸化处理后的水22050kg；在已装入种子培养原料的一级种子罐中接入黑曲霉菌种0.5kg，接种温度为33.5℃，培养温度为33.5℃，罐压为0.08Mpa，通气量为1∶1，PH值为4.8，培养30hr后移入二级种子罐进行扩大培养；二级种子罐内培养温度为33.5℃，罐压为0.06Mpa，通气量为1∶0.8，PH值为4.8，培养40hr后移入发酵罐进行发酵；发酵罐内的发酵温度为33.5℃，罐压为0.05Mpa，通气量为1∶0.6，PH值为4.7±1，发酵过程中当DE值下降至25～30时，按每小时5～5001的耗用量，添加灭菌糖浆进行补料，流加液氨控制PH值为4.7±1，发酵142hr，放酶活力为51112u/ml；发酵完成后将成熟发酵液放入已装好预处理原料的纯化预处理罐中进行纯化预处理，处理温度为28℃，PH值为2.0，处理1.5hr后通过板框压滤机进行固液分离，分离温度为26℃，经10hr分离完毕后对酶液进行超滤浓缩，浓缩温度为26℃，经12hr浓缩后进行精滤除菌，精滤温度为26℃，经3hr完成，取精滤液进行理化测试，合格后进行调配，成品酶活力为151000u/ml，转苷酶含量为7u/ml，α-淀粉酶未检出(即为ou/ml)，细菌总数为76个/ml。
实施例二一级种子罐采用1M3罐，定容0.8，罐中按总重量800kg配料，其中含碳原112kg，硫酸铵16kg，玉米浆12kg，水660kg；二级种子罐采用5M3罐，定容0.8，罐中按总重量4000kg配料，其中含碳原540kg，豆饼粉140kg，α-淀粉酶0.52kg，生物素0.4kg，水3319.08kg，因此二级种子罐和一级种子罐用于种子培养的总原料是分别按83.3％比16.7％(即4000kg∶800kg＝5∶1)的重量比例进行配置；发酵罐采用35M3罐，定容0.9，罐中按总重量31500kg配料，其中含碳原8505kg，豆饼粉1260kg，硫酸铵150Kg，流加液氨970kg，α-淀粉酶12.6kg，生物素2.835kg，水20599.565kg，因此发酵罐用于发酵的总原料和二级种子罐用于种子培养的总原料是分别按88.73％比11.27％(即31500kg∶4000kg＝7.87∶1)的重量比例进行配置；纯化预处理罐内装入钠基膨润土1380kg，经酸化处理后的水33000kg；在已装入种子培养原料的一级种子罐中接入黑曲霉菌种0.5kg，接种温度为34.5℃，培养温度为34.5℃，罐压为0.1Mpa，通气量为1∶1.18，初始PH值为4.9，培养43hr后移入二级种子罐进行扩大培养；二级种子罐内培养温度为34.5℃，罐压为0.08Mpa，通气量为1∶1，初始PH值为4.9，培养48hr后移入发酵罐进行发酵；发酵罐内的发酵温度为34.5℃，罐压为0.07Mpa，通气量为1∶0.9，初始PH值为4.9，发酵过程中，当DE值下降至25～30时，按每小时15～900L的耗用量添加灭菌糖浆进行补料，流加液氨控制PH值为4.7±0.1，发酵169hr，放罐酶活力为54690u/ml；发酵完成后将成熟发酵液放入已装好预处理原料的纯化预处理罐中进行纯化预处理，处理温度为30℃，PH值为3.0，处理2hr后通过板框压滤机进行固液分离，分离温度为27℃，经12hr分离完毕后对酶液进行超滤浓缩，浓缩温度为27℃，经14hr浓缩后进行精滤除菌，精滤温度为27℃，经3.5hr完成，取精滤液进行理化测试，合格后进行调配，成品酶活力为150900u/ml，转苷酶含量为5u/ml，α-淀粉酶未检出，细菌总数为81个/ml。
实施例三一级种子罐采用1M3罐，定容0.8，罐中按总重量800kg配料，其中含碳原104kg，玉米浆12kg，硫酸铵12kg，水672kg；二级种子罐采用5M3罐，定容0.8，罐中按总重量4000kg配料，其中含碳原480kg，豆饼粉120kg，α-淀粉酶0.6kg，生物素0.36kg，水3399.04kg，因此二级种子罐和一级种子罐用于种子培养的总原料是分别按83.3％比16.7％(即4000kg∶800kg＝5∶1的重量比例进行配置；发酵罐采用38M3罐，定容0.9，罐中按总重量34000kg配料，其中含碳原8840kg，豆饼粉1310kg，硫酸铵150Kg，流加液氨920kg，α-淀粉酶12.5kg，生物素2.72kg，水22764.78kg，因此发酵罐用于发酵的总原料和二级种子罐用于种子培养的总原料是分别按89.5比10.5％(即34000kg∶4000kg＝8.5∶1)的重量比例进行配置；纯化预处理罐内装入钠基膨润土1010kg，经酸化处理后的水43200kg；在已装入种子培养原料的一级种子罐中接入黑曲霉菌种0.5kg，接种温度为34℃，培养温度为34℃，罐压为0.09Mpa，通气量为1∶1.15，初始PH值为4.8，培养40hr后移入二级种子罐进行扩大培养；二级种子罐内培养温度为34℃，罐压为0.07Mpa，通气量为1∶0.9，初始PH值为4.8，培养46hr后移入发酵罐进行发酵；发酵罐内的发酵温度为34℃，罐压为0.06Mpa，通气量为1∶0.8，初始PH值为4.8，发酵过程中，当DE值下降至25～30时，按每小时10～800L的耗用量，添加灭菌糖浆进行补料，流加液氨控制PH值为4.7±0.1。发酵158hr，放酶活力为58000u/ml；发酵完成后将成熟发酵液放入已装好预处理原料的纯化预处理罐中进行纯化预处理，处理温度为25℃，PH值为4.0，处理2.5hr后通过板框压滤机进行固液分离，分离温度为23℃，经12.5hr分离完毕后对酶液进行超滤浓缩，浓缩温度为23℃，经14hr浓缩后进行精滤除菌，精滤温度为27℃，经3.8hr完成，取精滤液进行理化测试，合格后进行调配，成品酶活力为15100u/ml，转苷酶含量为4u/ml，α-淀粉酶末检出，细菌总数为81个/ml。
在上述实施例中，碳原可采用玉米淀粉，也可采用玉米粉。一级种子罐、二级种子罐、发酵罐培养基和补料糖浆的灭菌温度为121～123℃，灭菌时间为45分钟。
权利要求
1.一种高转化率高纯度糖化酶浓缩液的生产方法，其特征在于(a)在一级种子罐中按下列重量配比装入用于种子培养的原料8～17％的碳原，1～3％的玉米浆，1～2％的硫酸铵，80％～88％的水；(b)在二级种子罐中按下列重量配比装入用于种子培养的原料8～17％的碳原，2～4％的豆饼粉，0.01～0.015％的α-淀粉酶，0.008～0.01％的生物素，80％～88％的水；且二级种子罐和一级种子罐用于种子培养的总原料分别按78％～88％比12～22％的重量比例进行配置；(c)在发酵罐中按下列重量配比装入用于种子培养后进行发酵的原料15～27％的碳原，3～7％的豆饼粉，0.3～0.5％的硫酸铵，2～7％流加的液氨，0.025～0.05％的α-淀粉酶，0.005～0.01％的生物素，62％～75％的水；且发酵罐用于发酵的总原料和二级种子罐用于种子培养的总原料分别按82～90％比10～18％的重量比例进行配置；(d)在纯化预处理罐中按下列重量配比装入用于经发酵后进行纯化预处理的原料2～5％的钠基膨润土，95％～98％的经酸化处理后的水；(e)在已装入种子培养原料的一级种子罐中按下列重量配比接入黑曲霉菌种0.05～0.6％的黑曲霉菌种，99.4～99.95％的一级种子罐用于种子培养的总原料重量；一级种子罐内培养温度为34℃±1℃，压力为0.08～0.1Mpa，通气量为1∶1～1.2，初发酵PH值为4.8～5.0，培养时间为25～40hr；(f)将培养成熟的一级种子罐菌种液移至二级种子罐中进行扩大培养，培养温度为34℃±1℃，罐内压力为0.05～0.08Mpa，通气量为1∶0.7～1，初发酵PH值为4.8～5.0，中期用流加液氨的方法控制PH值为4.7±1，培养时间为35～50hr；(g)将二级种子罐中培养成熟的菌种液移至装入发酵原料的发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为34℃±1℃，罐内压力为0.05～0.07Mpa，通气量为1∶0.5～1，初发酵PH值为4.8～5.0，当PH值下降至4.5左右时，用流加液氨的方法控制PH值为4.7±1，发酵过程中，当DE值下降至25-30时，以每小时2.5～1000L的耗用量，添加灭菌糖浆进行补料，保持在发酵过程中发酵液合理的碳、氮比和渗透压，发酵时间为135～170hr；(h)发酵完成后将成熟发酵液放入已装好预处理原料的纯化预处理罐中进行纯化预处理，处理温度为20℃～30℃，PH值为2.8～3.2，处理时间为1.5～3hr，发酵液经预处理后通过板框压滤机进行固液分离，分离后的酶液再进行超滤浓缩，浓缩后的酶液进行精滤除菌，精滤除菌后的酶液经理化检测合格后进行调配，即得成品酶。
2.根据权利要求1所述的高转化率高纯度糖化酶浓缩液的生产方法，其特征在于，所述碳原采用玉米淀粉。
3.根据权利要求1所述的高转化率高纯度糖化酶浓缩液的生产方法，其特征在于，所述碳原采用玉米粉。
全文摘要
一种高转化率高纯度糖化酶浓缩液的生产方法，主要包括在一级种子罐中按配比装入碳原、玉米浆、硫酸铵和水；在二级种子罐中按配比装入碳原、豆饼粉，α－淀粉酶、生物素和水；在发酵罐中按配比装入碳原、豆饼粉、流加的液氨、α－淀粉酶、生物素和水；在纯化预处理罐中按配比装入钠基膨润土和经酸化处理后的水；将黑曲霉菌种按配比接种到一级种子罐培养；将培养的菌种及原料移入二级种子罐扩大培养；将扩大培养的菌种及原料移入发酵罐发酵；接下来将成熟发酵液放入纯化预处理罐进行纯化预处理，随后进行固液分离、浓缩、精滤、除菌和理化检测，调配后即得成品酶。本发明的有益效果是，可大幅度提高糖化酶系纯度，明显提高葡萄糖转化率(D E值)。
文档编号C12N9/26GK1818059SQ20051013665
公开日2006年8月16日 申请日期2005年12月30日 优先权日2005年12月30日
发明者李洪兵, 李海清, 张锦杰, 朱永明, 胡永明 申请人:湖南鸿鹰祥生物工程股份有限公司