一种动物源细菌氯霉素类药物耐药基因多重pcr检测技术的制作方法

专利名称：一种动物源细菌氯霉素类药物耐药基因多重pcr检测技术的制作方法
专利说明一种动物源细菌氯霉素类药物耐药基因多重PCR检测技术 本发明涉及动物源细菌氯霉素类药物耐药基因多重PCR检测技术，属于医学分子生物学领域，具体是关于动物源细菌氯霉素类药物耐药基因多重PCR检测技术方法及其在耐药性检测中的应用。氯霉素类抗生素包括氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考，三者的结构相似，杀菌的机理也相同。氯霉素由于对人有抑制骨髓造血功能的不良反应和药物残留，我国农业部2002年已禁止氯霉素用于食品动物。甲砜霉素仍然用作兽药。氟苯尼考，我国于2002年已通过了该药的审批，又称氟甲砜霉素或富乐。
国内外的大量研究表明，由于氯霉素药物长期和大量使用，细菌对氯霉素类药物的耐药性十分严重。耐药性产生的直接后果是严重影响了临床疗效，增加了治疗成本，同时缩短新药的应用周期，增大了新药的研究与开发成本，尤其在人畜同药的情况下，耐药性通过畜产品以及环境等途径引起的交叉传播，直接对人体健康构成威胁。
目前我国畜禽耐药性检测控制与畜产品安全生产中，在氯霉素药耐药性检测研究方面，对病原菌耐药性基因的研究开展得少，尚无配套的检测试剂盒。传统方法是通过测定细菌的最低抑菌浓度或抑菌圈大小测定细菌的耐药性。传统的药敏试验必须经过繁琐的细菌分离纯化、繁殖扩增等步骤，检测周期长，最快也要48h左右。不利于临床上及时的选药治疗。同时，药敏试验是在体外用药物试探性的检验细菌的表型耐药特性，不能检测细菌的隐型耐药性。
国内外已经从分子水平开展了细菌耐药机理的研究和耐药性相关基因的分子检测。从分子水平进行细菌耐药性的检测，不仅大大地缩短常规检测的时间，还能够查明细菌耐药性的传播及流行趋势，为控制耐药菌株的产生和流行，新型兽药的研制提供科学的依据，目前，耐药基因检测方法主要有质粒图谱、质粒指纹图谱、质粒消除试验、PCR及PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)、Southern blot、Dot blot、核酸探针检测、DNA的序列测定等。其中，PCR方法具有敏感、特异、快速等优点，可以检测极微量的目的基因进行检测，而不需要经过费时的细菌培养阶段，广泛的应用于细菌耐药性研究。而多重PCR技术是在同一反应体系中加入多对引物对多个目的基因同时进行扩增。它在检测基因过程中可设立内部对照；可指示出模板的数量；可同时扩增几个目的基因；消耗的时间和试剂少，减少准备时间提高效率；可大量地进行样品和目的基因的检测。自从Chamberlain(1988)首次应用多重PCR扩增多个人类肌营养不良蛋白基因以来，多重PCR已发展成为一种通用技术，广泛应用于病原体鉴别、性别筛选、连锁分析、法医研究、模板定量和遗传疾病诊断。在病原体鉴别方面具有突出的优点，多重PCR技术可指示许多病原体中的某一个，或区分同一属中的种或株。近年来，多重PCR技术越来越广泛的应用于细菌耐药性的检测上。本发明的目的是提供一种快速检测动物源细菌对氯霉素类药物耐药基因的三重PCR检测技术方法本发明的目的是通过以下技术方案达到的一种动物源细菌氯霉素类药物耐药基因多重PCR检测技术，含有PCR模板制备试剂和细菌耐药基因多重PCR扩增试剂，其特征在于所述PCR模板制备试剂是由洗涤液、样品处理液组成，所述细菌耐药基因多重PCR扩增试剂包括10倍PCR缓冲液，其组分为50mMKCl、pH8.3的10mM Tris.HCl和0.01％明胶，浓度均为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，浓度为25mM/LMgCl2，浓度均为25mmol/L三种耐药基因特异性上下游引物，即Cat1基因、FloR基因和CmlA基因，浓度为2.5U/ULTaq DNA聚合酶和超纯水。所述动物源细菌氯霉素药物耐药基因多重PCR扩增试剂各组分的终浓度如下1倍PCR缓冲液，dGTP、dCTP、dATP和dTTP的终浓度各为0.25mmol/L，MgCl2的终浓度为2.5mM/L，氯霉素药物耐药基因Cat1、FloR、CmlA的终浓度分别为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.9mmol/L，Taq DNA聚合酶终浓度为1.75U/100UL。
一种优选技术方案，其特征在于所述样品前处理方法只需离心收集菌体后，经相应处理液简单处理即可备用。
一种优选技术方案，其特征在于所述PCR模板制备试剂洗涤液的成份为5％的甘油。
一种优选技术方案，其特征在于所述PCR模板制备试剂样品处理液的成份为60％的甘油。
一种优选技术方案，其特征在于所述三种耐药基因即Cat1、FloR、CmlA的特异性上下游引物序列如下表
一种优选技术方案，其特征在于所述的动物源细菌氯霉素类药物耐药基因的多重PCR扩增是将浓度配比适当的三种氯霉素类耐药基因上下游引物混在一起扩增。
一种动物源细菌氯霉素类药物耐药基因多重PGR检测技术包括以下步骤1.PCR模板的制备方法如下(1)LB培养基摇瓶培养增菌，包括动物粪样、组织液、血液或其它体液；(2)取1ml经LB培养基摇瓶培养3-6h的菌液于无菌1.5mlEP管中，8000rin离心3min，弃上清，再加入1mlPCR模板制备试剂洗涤液，重复离心一次，弃上清，最后加入50-200ulPCR模板制备试剂样品处理液，震荡混匀后备用。
2.动物源细菌氯霉素类药物耐药基因多重PCR扩增试剂的配置方法如下(1)根据现有技术合成上述耐药基因特异性引物Cat1、FloR、CmlA，用1mmol Tris.Hcl-0.1mmolEDTA缓冲液稀释，使其浓度为25mmol/L；(2)取10倍的PCR缓冲液，浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物，浓度为25mM/LMgCl2，浓度均为25mmol/L三种耐药基因即Cat1基因、FloR基因和CmlA基因的特异性上下游引物，浓度为2.5U/ULTaq DNA聚合酶和超纯水装入一无菌的PCR反应薄壁管中。
3.动物源细菌氯霉素类药物耐药基因检测试剂的保存将动物源细菌氯霉素类药物耐药基因检测试剂保存于-20℃冰箱中。
4.动物源细菌氯霉素类药物耐药基因多重PCR检测技术的试剂组成(1)取10倍的PCR缓冲液5μl，浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物4μl，浓度为25mM/LMgCl23μl，浓度为2.5U/ULTaq DNA聚合酶0.15μl，浓度均为25mmol/L三种耐药基因即Cat1基因、FloR基因和CmlA基因的特异性上下游引物分别0.2μ1、0.4μl、0.9μl于一无菌的PCR反应薄壁管中。
(2)加入已制备好的模板5μl，补水至总体积50μl后加入20μl矿物油封顶即可。
5.PCR扩增循环参数为(1)94℃预变性5min；(2)然后进入循环94℃变性50s、54℃退火1min、72℃延伸1min，共34个循环，最后72℃延伸5min后，取出于4℃保存。
6.耐药基因检测结果判定
(1)取5μlPCR产物，与1μl Loading buffer混匀后，点样于2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，80V电压，电泳40min，于紫外荧光成相仪下拍照判定，结果可见550bp左右、650bp左右、900bp左右的条带，分别指示Cat1基因、FloR基因和CmlA基因；(2)直接测序鉴定法将经过纯化的PCR产物50μl和20μl三基因的上下游引物一起送上海生工生物有限公司进行DNA测序。
下面通过附图和具体实施方式
对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。

图1为氯霉素类药物耐药基因多重PCR检测技术阳性对照图。
具体实施例方式
下面结合实施例进一步阐述本发明1、如利用本发明氯霉素类耐药基因多重PCR检测技术检测一株直接测序法鉴定为Cat1、FloR和CmlA基因均为阳性的细菌对氯霉素类抗生素的耐药基因情况(1)PCR模板的制备将动物粪样接种于无菌的LB培养基3-6h(视细菌生长情况而定，以肉眼可见培养基明显变浑浊为度)，然后取1ml菌液于无菌1.5mlEP管中，标记。8000rin离心3min，弃上清，再分别加入1mlPCR模板制备试剂洗涤液，混匀后，重复离心一次，弃上清。最后分别加入50-200ulPCR模板制备试剂样品处理液，震荡混匀。
(2)多重PCR扩增试剂的组装取10倍的PCR缓冲液5μl，浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物4μl，浓度为25mM/LMgCl25μl，浓度为2.5U/ULTaq DNA聚合酶0.15μl，浓度均为25mmol/L三种耐药基因即Cat1基因、FloR基因和CmlA基因的特异性上下游引物分别0.2μl、0.4μl、0.9μl于一无菌的PCR反应薄壁管中。然后加入已制备好的模板5μl，补水至总体积50μl后加入20μl矿物油封顶即可，同时做一管阳性和阴性对照。
(3)耐药基因的多重PCR扩增PCR扩增循环参数为94℃预变性5min后，进入循环94℃变性50s、54℃退火1min、72℃延伸1min，共34个循环，最后72℃延伸5min后，取出于4℃保存。
(4)耐药基因检测结果判定取5μlPCR产物，与1μlLoading buffer混匀后，点样于2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，80V电压，电泳40min，于紫外荧光成相仪下拍照判定。电泳图(见附图1)。
权利要求
1.一种动物源细菌氯霉素类药物耐药基因多重PCR检测技术，含有PCR模板制备试剂和细菌耐药基因多重PCR扩增试剂，其特征在于所述PCR模板制备试剂是由洗涤液、样品处理液组成，所述细菌耐药基因多重PCR扩增试剂包括10倍PCR缓冲液组分为50mM KCl、pH8.3的10mM Tris.HCl和0.01％明胶，浓度均为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，浓度为25mM/LMgCl2，三种耐药基因即Cat1基因、FloR基因和CmlA基因的特异性上下游引物浓度均为25mmol/L，浓度为2.5U/ULTaq DNA聚合酶和超纯水。所述动物源细菌氯霉素类药物耐药基因多重PCR扩增试剂各组分的终浓度如下1倍PCR缓冲液，dGTP、dCTP、dATP和dTTP的终浓度均为0.25mmol/L，MgCl2的终浓度为2.5mM/L，氯霉素类药物耐药基因Cat1、FloR、CmlA的终浓度分别为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.9mmol/L，Taq DNA聚合酶的终浓度为1.75U/100UL。
2.根据权利要求1所述的耐药基因多重PCR检测技术，其特征在于所述样品前处理中只需离心收集菌体后，经相应处理液简单处理即可备用。
3.根据权利要求1所述的耐药基因多重PCR检测技术，其特征在于所述PCR模板制备试剂洗涤液的成份为5％的甘油。
4.根据权利要求1所述的耐药基因，其特征在于所述PCR模板制备试剂样品处理液的成份为60％的甘油。
5.根据权利要求1所述的耐药基因多重PCR检测技术，其特征在于所述三种耐药基因即Cat1基因、FloR基因、CmlA基因特异性上下游引物序列如下Cat1For5’-AACCAGACCGTTCAGCTGGAT-3’Rev5’-CCTGCCACTCATCGCAGTAC-3’FloRFor5’-GGCTTTCGTCATTGCGTCTC-3’Rev5’-ATCGGTAGGATGAAGGTGAGGA-3’CmlAFor5’-TGCCAGCAGTGCCGTTTAT-3’Rev5’-CACCGCCCAAGCAGAAGTA-3’
6.根据权利要求1所述的耐药基因多重PCR检测技术，其特征在于所述的动物源细菌氯霉素类药物耐药基因的多重PCR扩增是将浓度配比适当的三种氯霉素类耐药基因上下游引物混在一起扩增。
7.一种动物源细菌氯霉素类药物耐药基因多重PCR检测技术包括以下步骤[1]PCR模板的制备方法如下(1)LB培养基摇瓶培养增菌，包括动物粪样、组织液、血液或其它体液；(2)取1ml经LB培养基摇瓶培养3-6h的菌液于无菌1.5mlEP管中，8000rin离心3min，弃上清，再加入1mlPCR模板制备试剂洗涤液，重复离心一次，弃上清，最后加入50-200ulPCR模板制备试剂样品处理液，震荡混匀后备用。[2]动物源细菌氯霉素类药物耐药基因多重PCR扩增试剂的配置方法如下(1)根据现有技术合成上述耐药基因特异性引物Cat1、FloR、CmlA，用1mmol Tris.Hcl-0.1mmolEDTA缓冲液稀释，使其浓度为25mmol/L；(2)取10倍的PCR缓冲液，浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物，浓度为25mM/LMgCl2，浓度均为25mmol/L三种耐药基因即Cat1基因、FloR基因、CmlA基因的特异性上下游引物，浓度为2.5U/ULTaq DNA聚合酶和超纯水装入一无菌的PCR反应薄壁管中。[3].动物源细菌氯霉素类药物耐药基因多重PCR检测技术中试剂的组成(1)取10倍的PCR缓冲液5μl，浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物4μl，浓度为25mM/LMgCl23μl，浓度为2.5U/ULTaq DNA聚合酶0.15μl，浓度均为25mmol/L三种耐药基因即Cat1基因、FloR基因、CmlA基因特异性上下游引物分别0.2μl、0.4μl、0.9μl于一无菌的PCR反应薄壁管中。(2)加入已制备好的模板5μl，补水至总体积50μl后加入20μl矿物油封顶即可。[4].PCR扩增循环参数为(1)94℃预变性5min；(2)然后进入循环94℃变性50s、54℃退火1min、72℃延伸1min，共34个循环，最后72℃延伸5min后，取出于4℃保存。[5]耐药基因检测结果判定(1)取5μlPCR产物，与1μl Loading buffer混匀后，点样于2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，80V电压，电泳40min，于紫外荧光成相仪下拍照判定，结果可见550bp左右、650bp左右、900bp左右的条带，分别指示Cat1基因、FloR基因、CmlA基因；(2)直接测序鉴定法将经过纯化的PCR产物50μl和20μl三基因的上下游引物一起送上海生工生物有限公司进行DNA测序。
全文摘要
本发明涉及一种动物源细菌氯霉素类药物耐药基因多重PCR检测技术法，该方法包括扩增待测细菌耐药基因的三对PCR引物以及PCR模板制备试剂和细菌耐药基因多重PCR扩增试剂，利用该多重PCR检测技术能扩增待测菌株氯霉素类药的耐药基因。它具有灵敏度高、特异性高、应用范围广，结果准确可靠的特点。
文档编号C12Q1/68GK1966718SQ20061002207
公开日2007年5月23日 申请日期2006年10月20日 优先权日2006年10月20日
发明者王红宁, 杨鑫, 张安云, 周万蓉, 吴琦, 夏青青, 田国宝 申请人:四川大学