专利名称：一种快速筛选降解有机磷农药海洋微生物的方法
技术领域：
本发明涉及一种降解有机磷农药海洋微生物的筛选，具体的说是一种快速筛选降解有 机磷农药海洋微生物的方法。
背景技术：
农业应用的农药是防治病害、虫害、草害的有效的植物保护方法之一。农药以不同的 剂型经过稀释，以拌种、喷雾或撒施等方式降落在作物上及士壤里。然而，在目前的技术 水平条件下，农药的利用率仅为20%，而80%或更多的农药在施用后进入环境中，进入环 境的农药很容易随雨水形成的地表径流而进入河流或近岸海域，形成对水环境的污染。现 有技术中，针对有机磷污染物，人们不断在在自然界中寻找能够降解有机磷农药的微生物 和其产生的活性物质，但绝大多数微生物降解有机磷农药效率低、微生物的作用极其缓慢， 目前，降解有机磷微生物产品往往集中于陆地土壤微生物，而降解有机磷的海洋微生物产 品还是空白。
发明内容
为了克服传统技术中的不足，本发明的目的是提供一种操作简单、结果可靠、效率高的 快速筛选降解有机磷农药海洋微生物的方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为
(1) 样品采集
用无菌取样瓶采集沿海或近外海捕捞渔场的水样或泥样，放入20-4(TC的恒温箱中恒温
0.5-1.5小时恒温箱中待用；
(2) 分离筛选
水样中加入不同浓度的有机磷农药，摇匀，静置30min后在营养琼脂平板上涂布，20-40 'C培养48-72h，从有菌落生长的有机磷农药浓度最高的平板上挑选不同形态的菌落接种到 营养琼脂斜面上。
(3) 降解菌的富集培养
将所挑选的耐药菌分别接种到浓度为300,600,800和1,000 [X 10、V/V)]的含有有机磷 农药的选择性培养液中，28'C培养3d，而后在平板上划线。从有菌落生长的最高药物浓度 的平板上挑耐药菌接种到斜面上，28t:培养24h，再以此菌株为试验菌株，反复重复上述试 验。选取目前生产中常用的有机磷农药乐果、毒死啤、三唑磷、辛硫磷作为目标农药。
(4) 降解菌的培养特征及生理生化鉴定-
降解菌的鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》和《Bergey'smanual of determinative bacteriology》(ninthedition)进行。
(5) 对分离筛选的菌种进行性能检测
a. 菌株对有机磷耐受能力的测定
分别制各甲胺磷含量为400、 800、 1600、 3200、 6400、 12800 mg/L PSB液体培养基， 接种培养5-7d，观察记录其生长情况。
b. 菌株对有机磷的降解率的测定
以目标农药有机磷作为唯一的碳源，配制含有目标农药的500mg/L和1 000mg/LPSB 培养液，接种菌液l mL于125mL的培养液中，同时设有不接种菌的两种浓度的空白对照 和只接种菌而小加农药的对照，以消除水解和光解等因素引起目标农药减少的影响，在与 前述条件相同的培养条件下，培养7d取样用气相色谱测定细菌对目标农药的降解率。
c. 菌株降解有机磷农药降解谱的测定.-
为探讨菌株降解有机磷农药的降解谱，选取目前生产中常用的有机磷农药乐果、毒死 啤、三唑磷、辛硫磷作为目标农药，按照b.的方法进行试验，培养7d取样用气相色谱测定 细菌对目标农药的降解率。
具体实施例方式
为了进一步详细描述本发明，如下提供了制备本发明的组合物的实施例，然而应当理解， 本发明的范围不因这些实施例而受到限制。 实施例1
1. 样品采集
用无菌取样瓶采集沿海或近外海捕捞渔场的水样或泥样，放入20-4(TC的恒温箱中 恒温0.5-1.5小时恒温箱中待用；
2. 分离筛选
水样中加入不同浓度的有机磷农药，摇匀，静置30min后在营养琼脂平板上涂布， 25-3(TC培养48-72h，从有菌落生长的有机磷农药浓度最高的平板上挑选不同形态的菌 落接种到营养琼脂斜面上。选取目前生产中常用的有机磷农药乐果、毒死啤、三唑磷、 辛硫磷作为目标农药。
3. 降解菌的富集培养
将所挑选的耐药菌分别接种到浓度为300、 600、 800和1,000 [X10—、V/V)]的有机 磷农药(乐果、毒死啤、三唑磷、辛硫磷)选择性培养液中，28。C培养3d，而后在平 板上划线。从有菌落生长的最高药物浓度的平板上挑耐药菌接种到斜面上，28'C培养 24h，再以此菌株为试验菌株，反复重复上述试验。
4. 降解菌的培养特征及生理生化鉴定
降解菌的鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》和《Bergey'smanual of determinative bacteriology》(第九版)进行。
5. 对分离筛选的菌种进行性能检测
5.1菌株对有机磷耐受能力的测定 分别制各甲胺磷含量为400、 800、 1,600、 3，200、 6,400、 12,800 mg/L PSB液体培养基， 接种培养5-7d，观察记录其生长情况。 5.2菌株对有机磷的降解率的测定
以目标农药有机磷作为唯一的碳源，配制含有目标农药的500mg/L和1 000mg/LPSB 培养液，接种菌液lml于125ml的培养液中，同时设有不接种菌的两种浓度的空白对照和 只接种菌而小加农药的对照，以消除水解和光解等因素引起目标农药减少的影响，在与前 述条件相同的培养条件下，培养7d取样用气相色谱测定细菌对目标农药的降解率。
5.3菌株降解有机磷农药降解谱的测定 为探讨该菌株降解有机磷农药的降解谱，选取目前生产中常用的有机磷农药乐果、毒死啤、
三唑磷、辛硫磷作为目标农药，按照5.2的方法进行试验，培养7d取样用气相色谱测定细
菌对目标农药的降解率。
权利要求
1.一种快速筛选降解有机磷农药海洋微生物的方法，包括以下步骤(1)样品采集用无菌取样瓶采集沿海或近外海捕捞渔场的水样或泥样，放入恒温箱中待用；(2)分离筛选水样中加入不同浓度的有机磷农药，摇匀，静置在营养琼脂平板上涂布、培养，从有菌落生长的有机磷农药浓度最高的平板上挑选不同形态的菌落接种到营养琼脂斜面上；(3)降解菌的富集培养将所挑选的耐药菌接种到含有有机磷农药的选择性培养液中，培养，而后在平板上划线。从有菌落生长的最高药物浓度的平板上挑耐药菌接种到斜面上，培养，再以此菌株为试验菌株，反复重复上述试验。
2、 根据权利要求1所述的一种快速筛选降解有机磷农药海洋微生物的方法，其特征在于，其中步骤(1)所述的恒温条件为20-40。C的恒温箱中恒温0.5-1.5小时。
3、 根据权利要求1所述的一种快速筛选降解有机磷农药海洋微生物的方法，其特征在于，其 中步骤(2)所述的有机磷农药可以为乐果、毒死啤、三唑磷、辛硫磷。
4、 根据权利要求1所述的一种快速筛选降解有机磷农药海洋微生物的方法，其特征在于，其中性能检测是进行下面各项指标的检测菌株对有机磷耐受能力的测定、菌株对有机磷的降解率的测定和菌株降解有机磷农药降解谱的测定。
全文摘要
本发明涉及一种快速筛选降解有机磷农药海洋微生物的方法，包括(1)样品采集；(2)分离筛选；(3)降解菌的富集培养；(4)降解菌的培养特征及生理生化鉴定；(5)对分离筛选的菌种进行性能检测。本发明具有如下优点效率高，操作简单，结果可靠，促进了从海洋微生物中筛选降解有机磷农药的工作效率。
文档编号C12N1/00GK101104843SQ20061010129
公开日2008年1月16日 申请日期2006年7月10日 优先权日2006年7月10日
发明者金彬明 申请人:温州医学院