专利名称：离子钙浓度的测定方法及离子钙诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药、食品、环境等领域内对离子钙浓度的检测，尤其涉及利用酶比色法测定离子钙浓度的方法，以及由此制得的离子钙诊断试剂盒，属于离子钙浓度分析检测技术领域。
背景技术：
血液中的钙几乎全部存在于血浆中，血浆钙有两种形式1.非扩散性钙，也称结合钙，它同蛋白质结合，不能透过毛细血管壁，不具有生理活性，约占钙的40％；2.可扩散性钙，包括离子化钙，约占总钙的46％，是具有生理活性的部分；与碳酸氢根、磷酸盐、柠檬酸、乳酸等阴离子结合的钙，约占总钙的14％。非扩散性钙与扩散性钙可以互相转变并保持动态平衡。
钙的生理功能主要为1.构成骨骼和牙齿，维持和修补骨骼的完整性；2.保持神经肌肉的正常应激性；3.传导神经冲动；4.维持细胞的正常生理通透性；5.参与血疑过程；6.激活某些酶的活性，如琥珀酸脱氢酶、ATP酶等；7.对心肌收缩的影响，Ca2+有利于心肌收缩，它和有利于心肌舒张的K+相拮抗，从而维持心肌正常的收缩与舒张，血钙与骨骼中的钙保持动态平衡。血钙含量的变化能反映出骨组织的代谢情况，因此测定血钙对某些疾病的诊断有很大帮助。
总钙的测定方法很多，概括有滴定法(氧化还原滴定法、络合滴定法)、比色法(方法很多，最常用又便于自动化操作的是邻甲酚酞合络酮法、甲基麝香草酚蓝法、偶氮胂III法等)、火焰光度法、原子吸收分光光度法、同位素稀释质谱法、酶法。国际临床化学联合(IFCC)推荐的钙测定决定性方法为同位素稀释质谱法(IDMS)，参考方法为原子吸收分光光度法。世界卫生组织(WHO)推荐的中等实验室用的常规方法为邻甲酚酞络合酮法(O-CPC)。
离子钙的测定方法大致有生物学法、透析法、超滤法、金属指示剂法、离子选择性电极法，目前应用最多的是离子选择性电极法(ISE)。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定离子钙浓度的方法，以及应用该方法配制而成的离子钙诊断试剂盒。
为实现本发明的目的，一种酶比色法测定离子钙浓度的方法，采用以下步骤进行首先，将测定的样品与含有还原型辅酶、氧、NAD(P)H氧化酶的试剂混匀，使之发生以下反应，
然后，将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出离子钙浓度的大小。
上述酶比色法测定离子钙浓度的方法中，所述还原型辅酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一种。
实现本发明离子钙诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成缓冲液20～500mmol/L，稳定剂5～100g/ml，还原型辅酶0.1～0.35mmol/L，NAD(P)H氧化酶 2000～20000U/L。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，比如
双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分还原型辅酶，可以放在试剂II；试剂II中的NAD(P)H氧化酶也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II当中通常加入稳定剂，浓度在0.1～3mol/L，或5～100g/ml，或5～50％v/v范围之内。
用作稳定剂的物质可以是硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一种。
研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂还是双剂，如下配方成分关系的诊断/检测试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案缓冲液100mmol/L，稳定剂2mol/L，还原型辅酶0.25mmol/L，NAD(P)H氧化酶 6000U/L。
利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技术，计量还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定离子钙浓度的方法。同时，本发明还给出用以实现该方法的离子钙诊断/测定试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行离子钙浓度的测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在(1)本发明完全利用酶比色法测定离子钙浓度，测试结果准确；(2)参与反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂等多种形式的试剂，用于测定各种样品中离子钙浓度的大小；(6)本发明提供的液态离子钙诊断/检测试剂盒，稳定性好，很好地保证了应用测试效果。配成双剂以后，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。
具体实施例方式
本发明一种离子钙浓度的测定方法及离子钙诊断试剂盒，运用NAD(P)H氧化酶需要钙离子才能激活酶活性的酶促反应速率比色法，在钙离子的催化下，NAD(P)H氧化酶将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算离子钙浓度的大小。
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一(单剂)按以下成分和用量配制离子钙诊断试剂盒三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，硫酸铵 80g/ml，NADPH0.25mmol/L，NAD(P)H氧化酶6000U/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测离子钙样品与试剂的体积比为1∶25，反应方向为负反应(下降反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出离子钙浓度的大小。
实施例二(双剂)按以下成分和用量配制离子钙诊断试剂盒试剂I——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，甘油 2mol/L，NADH 0.25mmol/L；试剂II——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，丙二醇 50％v/v，
NAD(P)H氧化酶6000U/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测离子钙样品与试剂I、试剂II的体积比为2∶20∶5，反应方向为负反应(下降反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出离子钙的浓度大小。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外源物质的污染，便于推广应用。
权利要求
1.离子钙浓度的测定方法，包括以下步骤①将测定的样品与含有还原型辅酶、氧、NAD(P)H氧化酶的试剂混匀，使之发生以下反应，②将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出离子钙浓度的大小。
2.离子钙诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成缓冲液20～500mmol/L，稳定剂0.1～3mol/L，或5～100g/ml，或5～50％v/v，还原型辅酶0.1～0.35mmol/L，NAD(P)H氧化酶 2000～20000U/L。
3.根据权利要求2所述的离子钙诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为硫酸铵、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的离子钙诊断试剂盒，其特征在于所述还原型辅酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一种。
5.权利要求2～4中任意一种离子钙诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂或者双剂。
6.权利要求2～4中任意一种离子钙诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒为干粉试剂盒或液体试剂盒。
全文摘要
本发明涉及一种离子钙浓度的测定方法及离子钙诊断试剂盒，运用NAD(P)H氧化酶需钙离子激活酶活性的酶促反应速率比色法，在钙离子的催化下，NAD(P)H氧化酶将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算离子钙浓度的大小。该方法特异性高，不受内、外源物质的污染，测试结果精确、准确性好。将诊断试剂盒制成双剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂的稳定性。本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果，便于推广应用。
文档编号C12Q1/00GK1975431SQ20061016123
公开日2007年6月6日 申请日期2006年12月15日 优先权日2006年12月15日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司