专利名称：抗cd19抗体及其在肿瘤学中的应用的制作方法
抗CD19抗体及其在胂瘤学中的应用本发明部分地是在美国国立健康研究院(National Institutes of Health)的国立癌症研究所(National Cancer Institute)的基金号为 CA81776、 CA105001和CA96547的联邦政府基金资助下，和美国国立健 康研究院(National Institutes of Health)的国立过敏和传染性疾病研究 戶斤(National Institute of Allergy and Infectious Disease)的基金号为 AI56363的联邦政府基金资助下完成的。美国政府享有本发明的 一定权 利。本申请根据美国法典第35巻第119条(e)款(35U.S.C.§119 (e)) 要求2005年2月15日申请的美国临时专利申请60/653,587和2005年7月22 曰申请的美国临时专利申请60/702,063的优先权，并将其以其整体并入 作为参考。1. 简介本发明涉及在受试者中使用与人CD19抗原结合的治疗性抗体进行 B细胞紊乱或疾病治疗的方法，包括B细胞胂瘤。在优选的实施方案中， 本发明的组合物和方法的治疗性抗CD19抗体优选介导人抗体依赖性细 胞介导的细胞毒作用(ADCC)。本发明进一步涉及包含人的、人源化 的或嵌合的IgGl和/或IgG3人同种型的抗CD 19抗体的组合物。本发明进 一步涉及包含人的、人源化的或嵌合的IgG2和/或IgG4人同种型，优选介 导人的ADCC的抗CD19抗体的组合物。本发明还包括单克隆的人的、人 源化的或嵌合的抗CD19抗体。2. 本发明的背景B细胞表面标记已被普遍地认为是B细胞紊乱或疾病、自体免疫性疾 病和移植排异的靶标。B细胞表面标记的例子包括CDIO、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23、 CD24、 CD37、 CD53、 CD72、 CD74、 CD75 、 CD77、 CD79a、 CD79b、 CD80、 CD81、 CD82、 CD83 、 CD84、 CD85和CD86白细胞表面标记。已经开发了与这些标记特定结合的抗体，并且 一些抗体已经被试验用于疾病和紊乱的治疗。例如，已经证实，针对特异于成熟B细胞和它们的恶性对等物的 CD20细胞表面分子的基于嵌合的或放射性同位素标记的单克隆抗体(mAb)的疗法是非霍奇金氏淋巴瘤的有效体内疗法(Tedder等人， /聽画/. 7b勿15: 450-454 ( 1994 ) ; Press等人，/7e顧油gy， 221-240(2001 ) ; Kaminski等人，iV. </.， 329: 459-465 ( 1993 );Weiner, Se脂".(9"co/， 26: 43-51 ( 1999 ) ; Onrust等人，i>w^, 58: 79-88 ( 1999) ; McLaughlin等人，(9"co/ogy, 12: 1763-1769 ( 1998 ); Reff等人，B/ood, 83: 435-445 ( 1994 ) ; Maloney等人，S/ood, 90: 2188-2195( 1997); Maloney等人，/ C7w. (9"co/, 15: 3266-3274( 1997); Anderson等人，B,》c/zem. 5bc. Tra"rac， 25: 705-708 ( 1997))。还发 现抗CD20单克隆抗体疗法可以改善变形性关节炎、全身性红斑狼疮、特 发性血小板减少性紫癜和溶血性贫血，以及其它的免疫介导的疾病的临 床表现(Silverman等人，爿n^〃to脸廳.，48: 1484-1492( 2002 ); Edwards 等人,jR/zew/77(2,o/ogy, 40: 1-7( 2001 ); De Vita等人,Jw/zr"z^ A/zewm""^57 , 46: 2029-2033 (2002) ; Leandro等人，j朋.W/zeww. , 61: 883-888(2002 ) ; Leandro等人，^W/z"to 7 /zew肌，46: 2673-2677 ( 2001 ))。 抗CD22单克隆抗体LL-2在治疗经受化疗的攻击性和复发性的恶性淋巴 瘤患者中被证明是有效的(Goldenberg美国专利号6,134,982和 6,306,393 )。已经将抗CD20 (IgGl)抗体，RITUXANTM成功地用于某 些疾病的治疗，例如成人免疫血小板减少性紫癜、风湿性关节炎和自身 免疫性溶血性贫血(Cured等人，WO00/67796 )。不论本疗法的有效性， 按照CD20免疫疗法，大多数的急性淋巴母细胞性白血病(ALL)和许多 其它的B细胞恶性肿瘤不表达CD20,在低水平上表达CD20或已经失去 了CD20表达(Smith等人，O腳g，, 22: 7359-7368 ( 2003 ))。此外， CD20的表达不是对抗CD20疗法的预兆，仅有 一半的非霍奇金氏恶性淋 巴瘤患者对CD20控制的免疫疗法作出反应。人的CD19分子是在人的B细胞的表面上表达的结构清楚的细胞表 面受体，所述B细胞包括但不仅限于，前B细胞(pre-Bcell)、早期发育 的B细胞(即不成熟的B细胞)、成熟的B细胞通过末端分化成为浆细 胞和恶性B细胞。大多数的前-B急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、非 霍奇金氏恶性淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、前淋巴 细胞性白血病、毛细胞白血病、普通急性淋巴细胞白血病和一些非急性 淋巴母细胞性白血病都表达CD19( Nadler等人，丄/mw廳o/., 1M:244-250(1983 ) ， Loken等人，70: 1316-1324 ( 1987) , Uckun等人，祝ood, 71: 13-29 ( 1988 ) , Anderson等人，1984.祝ooc/， 63: 1424-1433 (1984) , Scheuermann,丄ei o顧，18: 385-397 ( 1995 ))。在浆细胞上的CD19的表达进一步说明其可在不同的B细胞瘤例如多发 性骨髓瘤、浆细胞瘤、华氏瘤上表达(Grossbard等人，丄//aemWo/， 102: 509-15 ( 1998 ); Treon等人，(9"co/， 30: 248-52 (2003 ))。 不同于CD20,当与抗CD19抗体结合时，CD19抗原被认为在高水平表达，并整合入细胞中。CD19抗原也是许多建议的用于免疫疗法的耙标之一。但是，认识 到的由于细胞内化作用而导致不能作为靶标来利用，被认为对于可以成 功地用于人类对象的治疗方案的开发已经造成了阻碍。CLB-CD19抗体(抗CD19鼠的IgG2a mAb )被证明抑制了植入无胸腺小鼠中的人类胂瘤 的生长(Hooijberg等人，C騰e^廳rc/z， 55: 840-846 ( 1995 ))。在 另一项研究中，使用人的IgGl Fc片段来嵌合单克隆的鼠抗体FMC63(IgG2a)。该对于具有人B细胞恶性淋巴瘤(异种移植模型)的SCID 小鼠的嵌合抗体的给药，不诱导补体介导的细胞毒性或抗体依赖性细胞 介导的细胞毒作用(ADCC)，而是导致移植的肿瘤细胞的明显杀伤(Geoffrey等人,Cawce厂/mmimo/. Immunother., 41: 53-60 ( 1995 ))。 使用肿瘤移植的异种移植小鼠模型所获得的结果导致了在人类患 者中使用鼠的抗CD 19抗体的研究。将鼠的CLB - CD 19抗体给予被确诊 为渐进性的非霍奇金氏恶性淋巴瘤，并使用上述的传统疗法(化疗或放 射疗法)已经失败的六个患者。给予这些患者从225到l,000mg的总抗体 剂量 (Hekman等人，Cawcer 7wwwwo/.Immunotherapy, 32: 364-372(1991))。虽然在注入抗体之后两个患者的循环胂瘤细胞暂时降低了 ， 但是在抗体治疗两个周期之后仅有 一个患者实现了部分緩解。从这一小 组难治的患者中不能得出关于治疗效能的结论。后来，这些研究者显示了在移植模型中非结合的CD20mAb的抗胂瘤 效果比CD19mAb的抗肿瘤效果好得多(Hooijberg等人，Omcwi^&, 55: 840-846 ( 1995 )和Hooijberg等人，QmcwL, 55: 2627-2634 ( 1995 "。 另外，当联合使用CD19和CD20mAb时，他们没有观察到对于胂瘤发病 率的累积或协同效应(Hooijberg等人，QwcerA"., 55: 840-846( 1995 ))。虽然异种移植的动物模型被认为是受试者中功效的不良预测指示剂，但 是在这些动物中获得的否定性结果阻止了人们对于用棵抗CD 19抗体的疗法的兴趣。基于抗CD19抗体的免疫毒素的利用同样产生了令人失望的结果。在初期的临床试验中，将B4抗CD19抗体(鼠IgGl mAb)结合到植物毒 素篦麻毒素上，并给予使用上述的传统疗法已经失败的多发性骨髓瘤人 类患者(Grossbard等人,Snto/z Jowr憩/o/T/aew^o/ogy, 102: 509-515 (1998 ))、高等非霍奇金氏恶性淋巴瘤(Grossbard等人，C"mca/Qmcw We化wc/z, 5: 2392-2398 ( 1999 ))和难治的B细胞恶性肿瘤(Grossbard 等人，所oot/, 79: 576-585 ( 1992 ))。这些试验一般地证明了B4-篦麻 毒素配合给予人类的安全性；但是，与用RITUXANTM的临床试验相比， 结果混乱，并且反应速度令人失望(Grossbard等人，C/z'mca/ Omcer i^wwc/z， 5: 2392-2398 ( 1999 ))。另外，明显有一部分患者发生了 人抗鼠抗体(HAMA)反应或人抗蓖麻毒素抗体(HARA)反应。在另 一 个试验中，用鼠的CLB-CD19抗体与连续注射小剂量的白细 胞介素-2结合来治疗之前用传统疗法治疗的七个轻度的非霍奇金氏恶性 '淋巴瘤患者(Vlasveld等人，/mwimo/. /www/7o/7zera/ _y， 40: STAT ( 1995 ) )。在一个白血病患者中出现部分緩解，并且观察到循环B 细胞的大于50%的降低。在测定的5个剩余患者中的4个中，循环B细胞 的数量不改变。因此，鼠抗CD19抗体和在人体中基于抗CD18抗体的免疫毒素的疗效评价产生了不能用于功效评价的无对照数据。 3.发明概述本发明涉及用于在受试者中使用与人CD19抗原结合并优选介导 ADCC的治疗性抗体来治疗B细胞疾病和紊乱，例如，但不限于，B细月包 恶性肿瘤的免疫治疗组合物和方法。本发明涉及包含人的、人源化的IgGl 和/或IgG3人同种型的抗CD19抗体的药物。本发明涉及包含人的、人源 化的IgG2和/或IgG4人同种型，优选介导人的ADCC抗CD19抗体。本发明 涉及包含嵌合的介导人ADCC的IgGl、 IgG2、 IgG3或IgG4同种型的抗 CD19抗体的药物组合物。在优选的实施方案中，本发明涉及包括单克隆 的人的、人源化的或嵌合的抗CD 19抗体的药物组合物。描述了用于治疗确诊为来源于B细胞或其前体，包括但不限于急性 淋巴母细胞性白血病(ALL)、霍奇金氏恶性淋巴瘤、非霍奇金氏恶性 淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、多发性骨髓瘤、滤泡 性淋巴瘤、套细胞恶性淋巴瘤、前淋巴细胞白血症、毛细胞白血病、普通急性淋巴细胞白血病和一些非急性成淋巴细胞白血病的B细胞恶性胂 瘤的受试者的治疗性组合物和方式。使用转基因小鼠模型评价在受试者中的针对CD19的免疫疗法来举 例il明本发明的方法。在一种实施方案中，本发明提供了一种包含在药学上可接受的载体中的单克隆的人的或人源化的IgGl或IgG3人同种型的抗CD19抗体的药 物组合物。在另一种实施方案中，本发明提供了一种包含在药学上可接 受的载体中包含治疗有效量的单克隆的嵌合IgGl或IgG3人同种型的抗 CD19抗体的药物组合物。在相关的实施方案中，单克隆的嵌合IgGl或 IgG3人同种型的抗CD19抗体的治疗上的有效量是少于每kg患者体重 lmg。在其它的相关实施方案中，单克隆的嵌合IgGl或IgG3人同种型的 抗CD19抗体的治疗上的有效量是大于每kg患者体重2mg。根据一个方面，本发明提供了一种包含在药学上可接受的载体中介 导人抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的单克隆的人的或人 源化的抗CD19抗体的治疗有效量的药物组合物。根据另一个方面，本发 明提供了一种包含在药学上可接受的载体中介导人抗体依赖性细胞介 导的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或细胞 凋亡活性的单克隆的嵌合的抗CD19抗体的药物组合物。本发明涉及一种在人体中治疗B细胞恶性胂瘤的方法，包含给予需 要的人单克隆的人的或人源化的IgGl或IgG3人同种型的抗CD19抗体，其 数量足够消耗循环的B细胞。本发明还涉及一种在人体中治疗B细胞恶性 肿瘤的方法，包含给予需要的人单克隆的人的或人源化的介导人抗体依 赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的抗CD19抗体，其数量足够消耗 循环的B细胞。本发明涉及一种在人体中治疗B细胞恶性肿瘤的方法，包含对需要这样的治疗的人类患者给予治疗有效量的单克隆的人的或人 源化的IgGl或IgG3人同种型的抗CD 19抗体。在 一 种实施方案中，本发明提供了 一种在人类患者中治疗B细胞恶 性肿瘤的方法，包含对需要这样的治疗的人类患者给予治疗有效量的单 克隆的人的或人源化的介导人抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用 (ADCC)的抗CD19抗体。在另一种实施方案中，本发明提供了一种治 疗在人类患者中由B细胞恶性肿瘤引起的早期疾病的方法，包含对需要 这样的治疗的人给予治疗有效量的介导人抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的单克隆的抗CD19抗体。在进一步的实施方案中，本 发明提供了 一种在人类患者中治疗B细胞恶性胂瘤的方法，包含对需要 这样的治疗的人类对象给予治疗有效量的单克隆的介导人抗体依赖性 细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的抗CD19抗体，其中受试者以前没有 受过恶性肿瘤治疗。本发明的另 一种实施方案提供了 一种在人类患者中 治疗B细胞恶性肿瘤的方法，包含对需要这样的治疗的人类患者给予治 疗有效量的介导人抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的单克 隆的抗CD19抗体，其中B细胞恶性肿瘤是CD19阳性的。在一个进一步 的实施方案中，本发明提供了 一种在人类患者中治疗B细胞恶性肿瘤的 方法，包含对需要这样的治疗的人类患者给予治疗有效量的介导人抗体 依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的单克隆的抗CD19抗体，其中 人类患者每dL的循环血液中含有至少1个单核细胞数。 3.1定义如此处所使用的，术语"抗体"和"抗体"(免疫球蛋白)指单克隆抗 体(包括全长的单克隆抗体)、多克隆抗体、由至少两个完整的抗体形 成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、人源抗体、camelised 抗体、嵌合抗体、单链Fvs(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、结构域 抗体、Fab片段、F(ab')2片段、表现要求生物活性的抗体片段、二硫 化物连接的Fvs (sdFv)和抗特异型(抗Id)抗体(包括，例如对于本 发明的抗体的抗Id抗体)、胞内抗体和以上所有抗体的抗原决定蔟结合 片段。特别地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性 片段，即包含抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以具有任一型 (例如IgG、 IgE、 IgM、 IgD、 IgA和IgY)、类(例如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgAl和IgA2)或亚类。天然抗体通常是大约150,000道尔顿由两个相同的轻(L)链和两个 相同的重(H)链所组成的异四聚化糖蛋白。每个轻链通过一个共价的 二硫键连接到重链上，而在不同的免疫球蛋白同种型的重链之间改变二 硫键的数目。每个重和轻链还具有有规则间隔的链内二硫桥。每个重链 在其一端具有可变区(VH),其后是一些恒定区。每个轻链在其一端 具有可变区(VL)，在其另一端具有恒定区；轻链的恒定区与重链的第 一个恒定区相连，并且轻链可变区与重链可变区相连。特定的氨基酸残 基被i人为在轻《连和重链的可变区之间形成了连接体。这样的抗体可来源于任一哺乳动物，包括但不限于，人、猴、猪、马、兔、狗、猫、小鼠等。术语"可变的"指在抗体中可变区的某些部分在序列上广泛地不同 的事实，并且导致每个特定的抗体对于其特定的抗原的结合专一性。但 是，可变性并不是在抗体的可变区均匀分布的。其集中在轻链可变区和重链可变区的称为互补性决定区(CDRs)的片段中。可变区的较高度 恒定的部分被称作骨架区(FR)。每个天然重链和轻链的可变区包含四 个FR区，主要采取P-折叠结构，通过形成环连接的三个CDRs相连，并 且有时成为P -折叠结构的 一部分。在每个链中的CDRs通过FR区与另一 个链的CDRs近似紧密地结合在一起，有助于抗体的抗原结合簇的形成(参见Kabat等人,Segwewces q/7Vofe/ w q/7mmw打o/ogz'ca/7nfereW， 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda， MD(1991))。恒定区通常不直接包括在结合的抗原中，但可能影响抗原 结合的亲合力，并可能显示出各种效应子功能，例如参与ADCC中的抗 体。此处所使用的术语"高变区"指抗体的导致结合到其抗原上的氨基 酸残基。高变区包含来自"互补性决定区"或"CDR"(例如在轻链可变 区的残基24 - 34 (LI ) 、 50 - 56 (L2)和89 - 97 ( L3 )和在重链可变区 的残基31 - 35 ( HI ) 、 50 - 65 ( H2 )和95 - 102 ( H3 ) ; Kabat等人， Se《wewces o/尸ro/ez力s o/ /wmwwo/ogzca/ /"/^res/1, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ( 1991 ))和/或来 自"高变环"的那些残基(例如在轻链可变区的残基26 - 32 (LI) 、 50 -52 (L2)和91 -96 ( L3 )和在重链可变区的残基26 - 32 ( HI ) 、 53 -55 (H2)和96—101 (H3) ; Chothia和Lesk,丄7Wo/Bw/， 196: 901-917 ( 1987))。"骨架结构"或"FR"残基是除了如此处所定义的高变区 残基以外的那些可变区残基，并且包括嵌合的、人源化的、人的、结构 》iU元体、3又体分子(diabodies)、疫苗体(vaccibodies)、线性抗体和 双特异性抗体。如此处所使用的术语"单克隆抗体，，指从基本上同类的 一组抗体中 获得的抗体，即除了可能以较少量存在的潜在的天然存在的突变之 外，包含相同数目的独立抗体。单克隆抗体是高度特异性的，其与单个 抗原位点相对应。此外，与一般包括与不同决定簇(抗原决定簇)相对应的不同抗体的传统(多克隆)抗体制剂相反，每个单克隆抗体是与抗 原上的单个决定簇相对应的。除了其特异性之外，单克隆抗体在通过杂 交瘤细胞合成，不被其它的免疫球蛋白生产细胞污染的方面是有利的。 另外，单克隆抗体可由用编码单克隆抗体的重链和轻链基因稳定地或瞬 时转染的细胞来生产。修饰语"单克隆的"表明从抗体的基本上均 一 的群体中获得的抗体 的特性，并且不被认为是需要通过任何特别的方法的抗体技术。此处所 使用的术语"单克隆的"指来源于细胞的克隆群体，包括任何真核的、原 核的或噬菌体的克隆的抗体，而不是工程化抗体的方法。例如，根据本 发明所使用的单克隆抗体可通过杂交瘤方法来制备，所述方法首先由Kohler等人，Atow", 256: 495 ( 1975 )，或可通过任何重组DNA方法 来制备(参见例如，U.S.专利号4,816,567),其包括使用例如在Clackson 等人，A^w", 352: 624-628 ( 1991 )和Marks等人，丄Mo/. S/o/., 222: 581-597 ( 1991 )中所描述的方法从噬菌体抗体文库中分离。这些方法可 用于生产单克隆的哺乳动物、嵌合的、人源化的、人的、结构域抗体、 双体分子(diabodies)、疫苗体(vaccibodies)、线性抗体和双特异性 抗体。术语"嵌合的"抗体包括其中至少重链和/或轻链的一部分与来源于 特定种类或属于特定抗体的类或亚类的抗体中的相应序列相同或同 源，并且该链的至少一个其它的部分与来源于另一个种类或属于另一个段，只要其表现出想要的生物活性即可(美国专利号4,816,567; Morrison 等人，Ato/.爿ca^5"c丄[7&4, 81: 6851-6855 ( 1984 ))。此处所关 心的嵌合抗体包括"灵长类动物化(primatized)"抗体，所述的"灵长类 动物化(primatized)"抗体来源于非人灵长类动物(例如东半球的猴 子，例如狒狒、猕猴或吸收放散试验猕猴)的可变区抗原结合序列和 人的恒定区序列(美国专利号5,693,780 )。非人的(例如鼠的)抗体的"人源"形式是包含来源于非人的免疫 球蛋白的最小序列的嵌合抗体。对于大部分情况，人源化的抗体是人免 疫球蛋白(受体的抗体)，其中来自受体的高变区的残基被来自非人物 种(供体的抗体)例如小鼠、大鼠、兔或具有要求的特异性、亲合力和 活性的非人灵长类动物的高变区的残基所取代。在有些情况下，人免疫球蛋白的骨架区(FR)残基被相应的非人残基所取代。此外，人源化的 抗体可包含在受体的抗体或供体的抗体中未发现的残基。进行这些修饰 以便进一步地改善抗体的性能。 一般说来，人源化的抗体基本上包含至 少一个，并且一般地两个，可变区，其中全部或者基本上全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且全部或者基本上全部的FR是人免 疫球蛋白序列的FR。在某些实施方案中，人源化的抗体包含至少一部分 的免疫球蛋白恒定区(Fc)， 一般是人免疫球蛋白的恒定区。有关进一 步的细节，参见，Jones等人，淑,,321: 522-525 ( 1986 ); Riechmann 等人，A^fwre, 332: 323-329 ( 1988 )和Presta, Cwr. 0/ . S^w". Bz'o/., 2: 593-596 ( 1992 )。"人的抗体"可以是来源于人的抗体或者从已经"设计，，来生产特异的 对应于抗原的攻击，并可以由本领域已知的任何方法制备的人抗体转基 因的生物体中获得的抗体。根据优选的方法，将人的重链和轻链位置的 元件导入到来源于胚胎干细胞系的细胞林中，所述细胞系包含内源的重 链和和轻链位置的耙裂解。转基因的生物体可以合成特异于人抗原的人 抗体，并且生物体可用于生产人抗体分泌杂交瘤。人抗体还可以是重链 和轻^1由来源于人DNA的 一 个或多个源的核苦酸序列所编码的抗体。还 可以用基因或染色体转染的方法、以及噬菌体显示技术、或体外活化B 细胞，所有这些本领域已知的技术来构建完全的人抗体。"CD19"抗原指由HD237或B4抗体(Kiesel等人，Lew/bw," i^^wc/z 〃，12: 1119 ( 1987))鉴定的大约90kDa的抗原。将CD19固定于细胞胞，包括但不仅限于，前B细胞、B细胞(包括幼稚B细胞、抗原刺激B 细胞、记忆B纟田胞、浆细胞和B淋巴细胞)和滤泡性分枝细胞。还将CD19 固定于人的胎儿组织的B细胞上。在优选的实施方案中，本发明的抗体 的輩巴CD 19抗原是人CD 19抗原。"抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用"和"ADCC"指细胞介导的反 应，其中非特异性的细胞毒素细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜 中性嗜中性细胞和巨噬细胞)识别在耙细胞上装订结合的抗体，之后导 致靶细胞的溶解。在优选的实施方案中，这样的细胞是人的细胞。不想 要被限于任何特定的作用机理作用机理，这些介导ADCC的细胞毒素细 胞通常表达Fc受体(FcRs)。介导ADCC、 NK细胞的初级细胞表达Fc yRIII,而单核细胞表达Fc yRI、 FcyRH、 Fc y RHI和/或Fc y RIV。将在造 血细月包上表达FcR相ii舌于Ravetch和Kinet， Annu. Rev. Immunol., 9: 457-92 (1991)。为了测定分子的ADCC活性，可进行体外ADCC试验，例如 美国专利号5,500,362或5,821,337所描述的。该试验的有用效应细胞包 括周围血液单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。选择性地，或 另外地，可在体内测定感兴趣的分子的ADCC活性，例如在如Clynes等 人，7WAS" f^&4, , 95: 652-656 ( 1998 )所公开的动物模型中。"补体依赖性的细胞毒性"或"CDC"指分子起始补体激活和在有补体 参与的情况下溶解靶的能力。补体激活途径起源于补体系统(CIq)的 第一个元件结合到复合有同源抗原的分子(例如，抗体)。为了测定补 体5敫、;舌，可进4亍CDCi式马会,i"列"i口, ^口Gazzano-Santaro等人，丄/附mw"o/. A/"/zoA, 202: 163 ( 1996 )所述的。"效应细胞"是表达一个或多个FcR，并执行操纵子功能的白细胞。 优选地，细胞表达至少FcyRI、 FcyRH、 Fc y RIII和/或Fc y RIV,并执 行ADCC操纵子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括周围血液单核 细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和 嗜中性细胞；其中优选PBMC和NK细胞。在优选的实施方案中效应细胞 是人的细胞。术语"Fc受体"或"FcR"用于描述结合到抗体的Fc区的受体。优选的 FcR是天然序列的人FcR。另外，优选的FcR是结合IgG抗体(y受体)， 并包括FcyRI、 FcyRII、 Fc y RIII和Fc y RIV亚类，包括等位变体和这 些受体的替代性拼接形式的FcR。 FcyRII受体包括Fc yRIIA (—种"活化 受体")和FcyRIIB (—种"抑制受体")，其具有相似的主要在其细胞质 结构域不同的氨基酸序列。活化受体FcyRIIA在其细胞质结构域中包含 基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。(参见，Daeron, i^ev./www脂/, 15: 203-234 ( 1997))。 在Ravetech和Kinet, j朋w. i ev. /wmwwo/， 9: 457-92 ( 1991 ) ; Capel等人,/mmwwo置;72o屯 4: 25-34 (1994);和deHaas等人，</.丄W. C"". Med, 126: 330-41 ( 1995 )中 评述了FcR。其它的FcR包括以后将鉴定出来的FcR,其由此处的术语 "FcR"所包含。该术语也包括新生的受体，FcRn,其负责将母亲的IgG传 递到胎儿(Guyer等人，/mw朋o/, 117: 587( 1976 )和Kim等人，/www"o/, 24: 249 ( 1994 ))。"Fv"是包含全抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由 一个 重链和一个轻链可变区以紧密的、非共价或共价连接的二聚体所组成。其处于每个可变结构域的三个CDR相互作用的结构而在VH-VL二聚体 的表面上形成抗原结合簇。总起来说，六个CDR给予对于抗体的抗原结 合特异性。但是，即使单个的可变结构域(或包含仅仅三个对于抗原特 异的CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，虽然与全部的结合 位点相比具有较低的亲合力。此处所述的用于治疗的抗体对于抗原表位的"亲合力"是本领域中 已知的术语，指抗体结合到抗原表位的程度或强度。亲合力可用本领域 许多已知的方法来测定和/或表示，包括但不限于，平衡电离常数(KD 或Kd)、表观平衡电离常数(KD'或Kd')和IC50 (在竟争性试验中引起 50%抑制所需要的量)。当然，对本发明来说，亲合力是对于结合于抗 原表位的给定数量的抗体的平均亲合力。此处所报道的根据每mL的 mglgG的KD'值表示每毫升血清的Ig毫克数，虽然可使用血浆。当将抗体 亲合力用作此处所述的治疗方法的给药基质，或用作此处所述的治疗方 法的选择物时，可在治疗之前和/或期间测定抗体亲合力，并且所得的值 可通过临床判断人类患者是否是适当的候选者来被用于治疗。"抗原表位"是本领域已知的术语，指表现特异性结合于抗体的任何 化学部分。"抗原表位"还可包含抗原，其是包含抗原表位的部分或分 子，并且，同样地，也特异性地结合于抗体。此处所用的"B细胞表面标记"是在B细胞表面上表达的抗原，所述B 细胞可以用与其结合的媒介物作为靶子。示例的B细胞表面标记包括 CDIO、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23、 CD24、 CD25、 CD37、 CD53、 CD72、 CD73、 CD74、 CD75、 CD77、 CD79a、 CD79b、 CD80、 CD81、 CD82、 CD83、 CD84、 CD85和CD86白细胞表面标记。与哺乳动 物的其它非B细胞组织相比，特别感兴趣的B细胞表面标记优先在B细胞 上表达，并且可在前体B细胞和成熟B细胞上表达。在一种实施方案中， 优选的标记物是CD19，其是基于从原/前B细胞阶段经过末端分化的浆细 胞阶段的谱系的分化期间的B细胞。此处所用的术语"抗体半寿期"指抗体的药物动力学性质，即按照其 给药的抗体分子的平均存在时间的量。抗体半寿期可表示为从患者的身 体或其特定部分中除去50%已知量的免疫球蛋白所需要的时间，例如，当在血清中测定时，即，循环半寿期，或在其它组织中。半寿期可在一 种免疫球蛋白或 一类免疫球蛋白与另 一种免疫球蛋白之间有所不同。通 常，抗体半寿期的增加导致抗体给药循环中平均留存时间(MRT)的增 加。术语"同种型"指抗体的分类。抗体的恒定区不参与跟抗原的结合， 但显示各种操纵子功能。根据重链恒定区的氨基酸序列，给定的抗体或免疫球蛋白可分为五种主要的免疫球蛋白类型之一IgA、 IgD、 IgE、 IgG 和IgM。这些类型的部分可进一步分为亚类(同种型)，例如IgGlQl )、 IgG2 (y2) 、 IgG3 (y3)和lgG4 (),以及IgAl和IgA2。对应于不同 类型的免疫球蛋白的重链恒定区分别被称作a、 △、 epsilon、 y和ji。已知 不同类型的免疫球蛋白的结构和三维形态。在各种人免疫球蛋白的类型 中，已知仅仅人IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4和IgM激活补体。已知人IgGl 和lgG3在人体中介导ADCC。如此处所使用的，术语"免疫原性"指混合物能够引起免疫反应(激 发特异性抗体的产生和/或特异性T细胞的增殖)。如此处所使用的，术语"抗原性"指混合物被抗体所识别，或可结合 到抗体上，并诱导免疫反应。如此处所使用的，术语"亲合力"抗体结合抗原的总体结合强度 (即两个抗体臂)的量度。抗体亲合力可使用本领域任何已知的方法 通过测定在抗原过量时抗原-抗体连接的解离来确定，例如，但不限于， 用由Gray等人，Wra/.MeA, 44: 11-24 ( 1993 )所描述的间接荧光抗体 的改进方法。由术语"治疗"、"治疗"或"对...治疗"(或符合语法的相应术语)， 其指对象的病情的严重程度减少，或实现至少部分地改善或改善和/或在 至少一个临床症状上有一些减轻、緩解或降低，和/或在病情的发展上存 在抑制或延迟，和/或预防或延迟病症或疾病的发病。因此，术语"治疗"、 "治疗"或"对...治疗"(或符合语法的相应术语)指预防和治疗方式。如此处所使用的，术语"足够的量"或"足量的"获得特定的效果指本 发明的适量的抗体或组合物，其能有效产生预期效果，所述效果是选择 性的治疗效果(即通过治疗有效量的给药)。例如，"足够的量"或"足 量的"可为有效消耗B细胞的量。此处所用的"治疗上有效的"量是在至少一个临床症状上提供某些减轻、緩解和/或降低的量。本领域技术人员已知与可用本发明的方法治 疗的病症相关的临床症状。进一步地，本领域技术人员理解治疗效果不 必是完全的或能治病的，只要能给对象提供 一 些益处即可。 4.附图的简要描述
图1A-lE说明hCD19TG小鼠细胞系的CD19表达。图1A显示来自 hCD19TG ( TG-1仏)小鼠的B细胞的人和小鼠的CD19表达。图1B显示来 自hCD 19TG小鼠的CD19+血液B细胞的人并且小鼠CD19表达的相对平 均密度。图1C显示来自TG-1+/—小鼠组织的CD19+B细胞的hCD19和 mCD19表达的相对密度。图1D显示CD19抗体在来自TG-1仏小鼠的小鼠 血液和脾8220+ B细胞上的结合密度。图1 E显示结合到hCD 19 cDNA转染 的300.19细胞上的抗CD19抗体。图2A-2D显示在hCD 19TG小鼠中血液、脾和淋巴结B细胞的消耗。 图2A表明在TG-1 +/—小鼠的CD 19或同种型匹配的对照(CTL )抗体治疗后 7天，典型的来自血液、脾和淋巴结的B细胞消耗。图2C和图2D显示在 用标明剂量的CD19 (填充的条带)或对照(空的条带)抗体治疗TG-1仏 小鼠后，脾和淋巴结B细胞分别的数目(士SEM)。图3A-3F描述在抗CD 19抗体治疗之后骨髓B细胞的消耗。图3A显示 用流细胞计数分析的四色免疫荧光染色测定的TG-1仏骨髓B细胞子代的 典型的hCD19和mCD19表达。图3B显示用流细胞计数分析的四色免疫荧 光染色测定的，在FMC63或同种型匹配的对照抗体(250吗)治疗之后 七天，hCD19TG小鼠的骨髓中hCD19+细胞的消耗。图3C显示在CD19或 同种型匹配的对照抗体(250吗)治疗TG-1仏小鼠七天，在骨髓中代表 性的B220+B细胞消耗。图3D显示在FMC63或同种型匹配的对照抗体 (250吗)治疗TG-l+ 、鼠七天，用三色的免疫荧光染色测定的在骨髓 中代表性的B细胞亚型消耗。根据CD43表达(下图)进一步将IgM-B22010 原/前B细胞细分。图3E显示在FMC63或同种型匹配的对照抗体(250)tig) 治疗hCD 19TG小鼠品系七天，用双色的免疫荧光染色测定的代表性的 CD2^B22010前B细胞的消耗。图3F显示在用FMC63 (封闭的条带)或 对照(开放的条带)将>3对同窝出生仔畜进行抗体治疗七天，表示在 两侧大腿中的原B细胞(pro-Bcell)、前B细胞、不成熟的和成熟的B细 胞的数目(士SEM)的条带图。图4A-4C表明腹膜腔B细胞对抗CD 19抗体治疗敏感。图4A显示由腹膜腔CD5+B220+B化和CD5-B220hLB2 (常规的)B细胞的人和小鼠CDW表 达。图4B显示来自用CD19 ( 250昭的HB12a、 HB12b和FMC63; 50ing的 B4和HD237 )抗体或对照抗体(250pg )治疗的TG-l+"小鼠的腹膜腔8220+ 细胞的消耗。图4C显示在抗CD19或对照抗体治疗hCD19TG小鼠七天， 代表性的CD25+B220+B^和CD5-B22()h182 B细胞的消耗。图5A描述HB12a抗CD 19抗体的重链VH-D-JH^妻合序列的核苷酸 (SEQIDNO: 1 )和预测的氨基酸(SEQ ID NO: 2)序列。图5B描述 HB12b抗CD19抗体的重链VH-D-JH接合序列的核苷酸(SEQIDNO: 3) 和预测的氨基酸(SEQ ID NO: 4 )序列。图6A描述HB12a抗CD19抗体的轻链序列的核苷酸(SEQ ID NO: 15)和预测的氨基酸(SEQIDNO: 16)序列。图6B描述HB12b抗CD19 抗体的轻链序列的核苷酸(SEQ ID NO: 17 )和预测的氨基酸(SEQ ID NO: 18)序列。图7A-7B描述公开的小鼠抗(人)CD19抗体的氨基酸序列。图7A 显示包括共有序列(SEQ ID NO: 5) 、 HB 12a ( SEQ ID NO: 2) 、 4G7 (SEQ ID NO: 6 ) 、 HB12b ( SEQ ID NO: 4 ) 、 HD37 ( SEQ ID NO: 7 )、 B43 (SEQ ID NO: 8)和FMC63 (SEQ ID NO: 9)的重链VH画D-JH接合 序列的序列。图7B显示抗CD19抗体的轻链VK氨基酸序列分析。定位了 共有序列(SEQ ID NO: 10) 、 HB12a ( SEQ ID NO: 16) 、 HB12b ( SEQ ID NO: 18) 、 HD37 ( SEQ ID NO: 11) 、 B43 ( SEQ ID NO: 12)、 FMC63 (SEQ ID NO: 13)和4G7 (SEQ ID NO: 14)。图8A-8C表明CD 19浓度影响了体内由抗CD 19抗体的B细胞消耗的 效率。显示了按照HB12b (图8A)或FMC63 (图8B)抗体治疗(七天、 250吗/小鼠)后，在hCD19TG小鼠中代表性的血液和脾的B细胞消耗。 图8C显示在来自TG-1仏小鼠的血液B22(y" B细胞上的相对抗CD19和抗 CD20抗体结合浓度。图8D显示在来自TG-1仏小鼠的脾8220+ B细胞上的 相对抗CD19和抗CD20抗体结合浓度。图9A-9D表明由抗CD19抗体治疗的B细胞的消耗是FcR，和单核细 胞依赖性的。图9A在hCD19TG-l仏FcRy仏同窝出生仔畜的CDW或同种 型对照抗体治疗之后7天代表性的血液和脾的B细胞消耗。图9B在第0天 FcR^-同窝出生仔畜的抗体治疗之后7天血液和组织的B细胞消耗。图9C 在单核细胞消耗的hCD19TG-l+ 、鼠中代表性的B细胞数目。图9D在抗体治疗之后七天血液和组织的B细力包消專毛。图10A-10D表明由抗CD19抗体治疗的B细胞消耗的持续时间和剂量 反应。图10A显示在第0天由FMC63或同种型对照抗体治疗的TG-1仏小鼠 的大量血液B220+B细胞和Thy-l+T细胞。图IOB-C显示抗体治疗之后11 、 16和30周后图10A所示的在小鼠中代表性的组织B细胞消耗。图10D显示 对应于血液、骨髓和脾的B细胞消耗的抗CD19抗体剂量。图11A-11C表明CD19在体内不是由抗体结合而内在化的。在用 HB12a (图11A) 、 HB12b (图11B) 、 FMC63 (图11C)或同种型匹配 对照抗体(250)ug)体内治疗TG-l+z—小鼠中细胞表面CD19表达和B细胞 清除。图12A-12C表明体内由抗CD19抗体结合的CD19饱和剂量。图12A显 示体内在用FMC63或同种型匹配对照抗体(250pg)治疗的TG-1仏小鼠 中B细胞的清除。图12B显示FMC63抗体治疗(250jig )在给药1小时之内 使hCD19上的抗体结合位点饱和。图12C显示HB12b抗CD19抗体治疗 (250pg )如在图12B所确定的那样在给药1小时之内使hCD19上的抗体 结合位点饱和。图13A-13B表明抗CD19抗体治疗在TG-1仏小鼠中降低了血清免疫 球蛋白和自身抗体的水平。图13A描述血清免疫球蛋白的水平，而图13B 描述在抗CD19抗体治疗之后的抗dsDNA、抗ssDNA和抗组蛋白自身抗体 的水平。图14A-14B表明抗CD19抗体治疗阻断了 TG-1估小鼠中的由体液引 起的免疫应答。用图14A的TNP-LPS、图14B的DNP-Ficoll和图14C-14D 的DNP-KLH免疫抗体治疗的小鼠。在首次免疫第0天之前7天(A-C)或 之后14天(D ),用FMC63 (密闭的圈)或对照(开放的圈)抗体(250pg) 治疗同窝出生仔畜。图15表明同时添加抗CD19和抗CD20抗体治疗。图16表明抗CD19抗体的皮下(s.c.)、腹内(i.p.)和静脉(i.v.)给 药有效地纟肖耗体内循环的和组织中的B细胞。图17A-17B抗CD19抗体治疗阻止了体内hCD19+淋巴瘤的生长(图 17A),并且增加了存活率(图17B)。5.发明的详细说明本发明涉及用于治疗人体B细胞疾病和紊乱的免疫治疗组合物和方法，例如，但不仅限于，用结合CD19抗原的治疗性抗体，优选人抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)来治疗B细胞恶性肺瘤。本发明涉 及包含人的、人源化的或嵌合的IgGl或IgG3人同种型抗CD19抗体的药物 组合物。本发明还涉及包含IgG2或IgG4人同种型的人的或人源化的抗 CD19抗体，优选介导人类ADCC的药物组合物。在某些实施方案中，本 发明还涉及可用本领域已知的方法生产的包含单克隆人的、人源化的或 嵌合的抗CD19抗体的药物组合物。描述治疗诊断为由B细胞和及其前体衍生的B细胞恶性肺瘤的人类 患者的治疗的处方和给药方案，所述B细胞和及其前体衍生的B细胞恶'性 肿瘤，包括但不仅限于，急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、霍奇金氏 淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、 多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、前-淋巴细胞白血症、毛 细胞白血病、普通急性淋巴细胞白血病和某些非急性淋巴母细胞性白血 病。5.1抗CD19抗体的产生 5丄1多克隆抗CD19抗体多克隆抗体优选通过将相关抗原和辅药多次皮下(s.c.)或腹内 (i.p.)注射，在动物体内产生。用双功能试剂或书f生试剂，例如马来酰 亚胺基苯曱酰基(maleimidobertzoyl)硫基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨 酸残基结合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀 酸酐、S0C12,将相关抗原与免疫物种免疫原蛋白，例如钥孔血蓝素、 血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制剂结合可能是有用 的。用抗原、免疫共辄物或衍生物来免疫动物，例如将100ng或5pg蛋白 质或共轭物(分别对于兔子或老鼠)与3倍量的完全弗氏佐剂混合，将 溶液在多个位置上真皮内注射。 一个月后，给动物在多个位置上皮下注 射含有1/5到1/10原量的肽或共轭物的不完全弗氏佐剂。7到14天后，给 动物抽血，测定其血清的抗体滴度。对动物加强免疫直到滴度不变。优 选地，用相同的但由不同的蛋白结合的和/或通过不同的交联试剂来结合 的抗原共轭物给动物加强免疫。也可以在重组细胞培养物中以蛋白融合 物的形式来制备共轭物。聚合体例如明矾也适合用来增强免疫反应。5.1.2单克隆的抗CD19抗体本发明的单克隆抗CD19抗体表现出与人CD19抗原的结合特异性， 并可优选介导人的ADCC。这些抗体可用本领域已知的多种技术，包括 利用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合来获得。抗体是高度特异 性的，其针对单个的抗原位点。此外，与一般包括针对不同决定簇(抗 原表位)的传统的(多克隆)抗体制剂相比，每个单克隆抗体针对人CD 19 抗体上的单个决定簇。例如，根据本发明所使用的单克隆抗体可用Kohler 等人，iVa化"，256: 495 ( 1975 )首次描述的杂交瘤方法来制备其可用 于产生鼠抗体(或来源于其它非人哺乳动物的抗体，例如鼠、山羊、 绵羊、牛、骆驼等。)或来源于转基因动物的人抗体(参见，美国专利 号6,075,181、 6,114,598、 6,150，584和6,657,103 )。选择性地，可用重组 DNA技术来制备单克隆抗体(参见，例如美国专利号4,816,567),并 且所述单克隆抗体包括嵌合的和人源化的抗体。"单克隆抗体"也可用如 Clackson等人，Atowre, 352: 624-628 ( 1991 )与Marks等人，丄^fo/A'o/, 222: 581-597 ( 1991 )所描述的方法从噬菌体抗体文库中分离出来。可用本领域已知的任何方法来制备工程化抗CD19抗体，包括但不 仅限于，下述方法及这些方法的改进。大规模的高产量生产一般涉及培 养产生工程化抗CDW抗体的寄主细胞，并从寄主细胞培养物中回收抗 CD19抗体。5.1.3杂交瘤技术可用杂交瘤技术来制备单克隆抗体，其中包括本领域和教导中已知 的才支术,例^口在Harlow等人,y4w/7力o&ef j丄(3Z)ora/107^ A^mwa/, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed, 1988 ) ; Hammerling等人,在 M6woc/(9""/ J胎力(9(i^ <37 J 71 Ce〃外Z)rW謂oy， 563-681 ( Elsevier， N.Y., 19")中(所述参考文献以其整体作为参考并入此处)。例如，在杂交 瘤方法中，将老鼠或其它适当的宿主动物，例如仓鼠或猕猴免疫以得到 产生或能够产生与用于免疫的蛋白进行特定性结合的抗体的淋巴细 胞。替代性地，可在体外免疫淋巴细胞。然后将淋巴细胞与骨髓瘤细胞 利用适当的助熔剂混合，例如聚乙二醇，产生杂交瘤细胞(Goding， Mowoc/owa/ Jw/7力oJ/eAV /V/wc/p/es 尸n2c/7ce, 59-103 ( Academic Press,在适当的培养基中接种并培育如此制备的杂交瘤细胞，所述培养基 优选包含一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞的生长或存活率的1986)。物质。例如，如果亲代的骨髓瘤细胞缺乏次黄噤呤鸟噪呤转磷酸核糖基酶(HGPRT或HPRT ),那么杂交瘤的培养基一般就要包括次黄嘌呤、 氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT介质)，该物质阻碍HGPRT-缺陷型细 胞的生长。优选高效融合的骨髓瘤细胞，用挑选的抗体产生细胞维持稳定高水 平的抗体产生，并且所述细胞对介质敏感，例如HAT介质。这些细胞之 中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，例如来源于Salk institute Cell Distribution Center, San diego, CA, USA获得的MOPC-21和MPC曙 ll小鼠月中瘤中，以及从American Type Culture Collection, Rockville， MD， USA得到的SP-2或X63-Ag8.653细胞的细胞系。人骨髓瘤和小鼠 人heteromyeloma细胞系也被描述为可产生人的单克隆抗体(Kozbor,丄 /mw丽o/, 133: 3001( 1984 ); Brodeur等人,Mowoc/o腦/勘"力c^/Vo<iwc/7c 7"ec/z—認s v4，//ca"ow, 51-63 (Marcel Dekker, Inc, New York, 1987)。为生产针对人CD19抗原的单克隆抗体，测定杂交瘤细胞生长的培 养基。优选地，用免疫沉淀反应或通过体外结合试-验，例如力丈射免疫试 验(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)来检验用杂交瘤细胞生产的 单克隆抗体的结合特异性。在鉴定了杂交瘤细胞所产生的抗体具有要求的特异性、亲合力和/ 或活性之后，可通过有限稀释的方法亚克隆该细胞，并按照标准方法培 养(Goding, Mowoc/o a/ ^4 /7'^0<^'&5",. 尸r/wc0/e5 aw J尸n2c/7'ce， 59-103 (Academic Press, 1986 ))。可达此目的的适当培养基包括，例如 D-MEM或RPMI1640培养基。此外，杂交瘤细胞可能会在动物体内生长 成腹腔肺瘤。将由亚克隆分泌出的单克隆抗体从通过传统的免疫球蛋白纯化方 法获得的培养基、腹腔积液或血清中适当地分离出来，所述纯化方法例 如蛋白质A-琼脂糖凝胶、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱 法。5丄4重组DNA技术利用常规程序(例如利用能特异性结合编码抗CD19抗体的重链 和轻链的基因的寡聚核苷酸探针)，分离和测序编码本发明中抗CD19 抗体的DNA。将杂交瘤细胞作为优选的该DNA的来源。 一旦分离出来，可将DNA放入表达载体中，然后将其转染入寄主细胞，例如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不再产生免疫球蛋 白的骨髓瘤细胞，以实现重组寄主细胞中的抗CD19抗体的合成。在噬菌体展示技术中，在噬菌体粒子的表面上展示了功能性抗体结 构域，其带有编码它们的多核苷酸序列。尤其是，从动物cDNA文库(例 如感染组织的人或鼠cDNA文库)中扩增编码VH和VL结构域的DNA 序列。利用PCR将编码VH和VL结构域的DNA序列与scFv连接子重 组在一起，并克隆入噬菌粒载体。将载体电转化到五.co"中，并用辅助 噬菌体感染五.co/z。在此方法中所用的噬菌体一般为丝状噬菌体，其包 括fd和M13,并且VH和VL结构域通常被重组融合到噬菌体基因III 或基因VIII中。可用抗原选择或鉴定表达结合到特定抗原的抗体结合结 构域的噬菌体，例如用标记的抗原或结合或捕获到固体表面或珠上的 抗原。可用来制造本发明的抗体的噬菌体展示技术的实例包括Brinkman 等人，1995，丄/wmw"o/.M"/w&, 182: 41-50; Ames等人，1995, /.//'wwwwo/.A/e/^o^is*, 182: 41-50; Ames等人,1995,丄/附mw"o/.Me〖/zo^s", 184: 177-186; Kettleborough等人，1994， E,乂/ww丽o/， 24: 952-958; Persic等人，1997, 187: 9-18; Burton等人，1994， y^ra"ce""/mw朋o/ogy， 57: 191—280;国际申请号PCT/GB91/01134;国际
发明者H·格伦, N·雅扎瓦, T·F·特德, Y·哈马古基 申请人:杜克大学