专利名称：用于禽流感病毒检测和分型的引物系统和方法
技术领域：
本发明属于生物芯片领域。具体而言，本发明涉及一种用于对禽流感病毒全部亚型进行检测和分型的基因芯片，制备该基因芯片使用的型特异性探针、质控探针，利用该基因芯片进行检测和分型的方法，以及检测和分型研究中使用的多重RT-PCR引物、多重不对称RT-PCR引物和通用引物。
背景技术：
禽流感(Avian Influenza，AI)，是由流感病毒属的A型流感病毒引起的禽类感染和疾病的总称。鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染，而对家养的鸡和火鸡引起的危害最为严重，候鸟、观赏鸟、散禽携带病毒迁徙可能是禽流感世界性流行的主要原因，猪等也可作为“混合器”传播本病。禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)血清型亚型众多、变异性强，存在抗原飘移和抗原转变，不同亚型、不同分离株病毒的差异很大，目前在全世界各种家禽和野生禽类中，已分离到上千株禽流感病毒，并已证明家禽或舍饲禽类在感染后，可表现为亚临床症状、轻度呼吸系统疾病、产蛋量降低或急性致死性疾病。国际兽疫局(OIE)将高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza，HPAI)确定为A类动物疫病，并列入国际生物武器公约动物类传染病名单，我国也将其列为I类传染病。
禽流感的爆发一直是困扰全球养禽业的一个难题，尤其是HPAI对世界养禽业及人类健康构成了严重威胁。从1959年第一次报道H5亚型的HPAI暴发以来，HPAI共有24次较大的流行，其中19次是在家禽中爆发，且每次都带来重大经济损失。禽流感的暴发几乎波及世界各地。多个国家先后爆发禽间高致病性禽流感疫情，并且出现人间禽流感疫情，全球共有近200人感染禽流感，病死率达51.7％。禽流感的爆发不仅造成了巨大的经济损失，而且带来了严重的公共卫生问题。
禽流感病原为正黏病毒科(Orthomyxoviridae)的A型流感病毒，AIV病毒核酸型为单股负链RNA，基因组分为8个片段，病毒粒子呈球形，亦可呈丝状，直径约80-120nm，有囊膜，表面有放射状排列的长度为12-14nm的数百个纤突，可分为两类，分别是棒状的三聚体血凝素(HA)和呈蘑菇状的四聚体神经氨酸酶(NA)，根据其表面血凝素(HA)抗原性的不同，可分为16个亚型，即H1～H16，根据神经氨酸酶(NA)抗原性的不同可分为9个亚型，即N1～N9。禽流感病毒存在众多亚型，核酸为多节段性使得抗原性容易发生漂移、基因突变及重排而不断变异，可在动物体中表型混合及核衣壳移植变异为新的致病亚型，而现有的检测方法只能鉴定我国仅有的几个亚型，无法鉴定国外已经发现的和可能发生的新变异型，导致检疫中存在漏检的隐患，而基因芯片可以检测数以万计的不同特异性基因序列，因此是进行病毒快速分型检测的强有力的工具。美国疾控中心从2003年就已经开始了禽流感病毒分型检测基因芯片的研究工作，香港也在着手这种新型检测技术的研究。分型检测基因芯片技术将帮助提供更好的全球流感监测方法，并使鉴定严重的流感病毒株变得更容易，这也使得基因芯片技术成为今后禽流感病毒新型检测技术研究的发展趋势。因此，建立一种既可以特异、快速的检测16个HA和9个NA亚型，又可以及时发现新的变异或基因重排病毒的高通量、快速、敏感可靠方法是非常必要和及时的，这对有效监控各种亚型禽流感疫情和AIV的变异以及为迅速有效防制禽流感具有重要意义。
目前，禽流感的主要诊断及检测方法主要包括病原学、免疫学、分子生物学三个方面AIV的分离和HA/HI试验是经典的实验室诊断方法，结果可靠但时间太长；琼脂扩散(AGP)试验由于具有简便快速的特点，成为AI检疫诊断中应用最广泛的血清学方法之一，也是我国禽流感诊断国家标准指定的方法之一，但此法的敏感性较低；中和试验(NT)准确且易操作常用于实验室诊断，但需较长的时间和花费较多的材料；荧光抗体(FA)试验具有快速、简便、易行、较敏感等特点，也常用于临床诊断；免疫酶标记技术(EIA)以酶联免疫吸附试验(ELISA)为主，尽管其重复性和稳定性有待提高，但具有快速、敏感度高(其敏感度要高于AGP试验和HI试验)的特点，常用于大批样品和血清学检测检疫。我国在这些诊断技术方面的研究已经较成熟，许多都实现了商品化，为我国禽流感病毒的检测诊断发挥了重要作用，但这些方法一次只能检测一个亚型。
随着分子生物学技术的发展，基因体外扩增技术PCR/RT-PCR成为一种重要的疾病诊断技术，它能在数小时内将单分子的靶基因特异地扩增上百万倍，由此检出痕量、甚至一个病毒粒子(病原分子)的存在，从而极大地提高了对病原分子的检测和分析能力，具有灵敏、特异、快速、准确和易于操作的特点。因此PCR/RT-PCR技术在疾病的检测、鉴别诊断方面得到广泛应用，并成为人们研究开发的重点方向。Wright等报道应用RT-PCR方法区分A、B、C型禽流感，此法关键在特异引物的设计。针对N1～N9亚型的RT-PCR反应分型在理论上可行，但目前还未见成功报道。David Suarez等将RT-PCR技术与荧光探针检测技术结合后，推出了实时荧光监测的RRT-PCR技术，敏感性远远高于普通的RT-PCR。2005年我国禽流感H5、H7、H9亚型多重RRT-PCR检测试剂盒在深圳研制成功，这意味着我国禽流感病毒检测获得重大突破，该成果将让荧光RT-PCR一次只能检测一个禽流感亚型成为历史，实现一次同时检测三个禽流感亚型。
常规PCR/RT-PCR技术一次PCR反应只能检测诊断一种病原体，当临床出现多种病原体混合感染或一种病原多个亚型时，就必须进行多次的PCR/RT-PCR反应才能最后确诊。多重PCR技术是一项特殊的PCR方法，具有高效性，系统性，经济简便性等优点，对混合感染病原体的鉴别检测只需一次PCR反应，就可同时鉴别多种病原体或一种病原的多个亚型，这不仅节约昂贵的生物试剂，而且简化了操作程序，加快了检测诊断速度，具有很高的临床应用价值，很多学者已进行了大量研究。
基因芯片技术是20世纪90年代发展起来的融生物学、物理学、化学、计算机科学和微电子学一体的高度交叉的前沿技术。基因芯片技术不仅具有快速、敏感、特异、高通量和自动化的优点，而且通过计算机软件进行数据处理和结果判定，减少了结果判定受主观因素影响的可能，提高了检测结果的可靠性与稳定性，其独到的优点是一次可同时鉴别诊断多个病毒或者一个病毒的多个亚型，因此，基因芯片技术在快速鉴别诊断和检测方面具有十分广阔的应用前景。美国、香港等一些国家和地区早已着手研究检测禽流感病毒基因芯片。该技术是一种比较系统、完善的检测技术，该方法的建立不仅有助于禽流感疫情的有效监控，而且可在第一时间内准确的发现新变异或基因重排的新亚型病毒，为应对新疫情暴发提供可靠的技术储备，禽流感基因芯片技术将成为目前禽流感防控的理想技术。
本发明根据Genebank中已发表的禽流感病毒不同亚型的基因组序列，利用DNAStar、Bioedit、Primer5.0和OMIGA软件进行分析筛选，并成功地设计了进行禽流感病毒基因芯片技术研究的多重不对称RT-PCR分型检测的25对特异性引物、1对通用引物和进行禽流感病毒基因芯片分型技术的52条特异性探针和3条质控探针，通过优化反应条件，建立了特异性强、敏感性高的禽流感病毒基因芯片分型检测方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于多重不对称RT-PCR扩增进而用于禽流感病毒检测和分型的引物系统。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述引物系统进行禽流感病毒检测和分型的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现收集Genebank中发表的不同亚型禽流感病毒的基因组序列，用DNAStar/Bioedit软件分别对已发表的所有型AIV的全基因序列进行分析，选择保守基因片段作为目的扩增片段，利用Primer5.0和OMIGA软件进行引物设计，对可获得标准毒株的亚型用所设计的型特异性引物对直接进行RT-PCR扩增(在P3实验室、按照CDC规定标准操作)，对无法获得标准毒株的亚型，设计满足搭桥PCR要求的引物对，通过搭桥PCR扩增获得相应的目的片段。将扩增产物纯化回收后连接于T载体上在JM109中克隆扩增并保存菌种(以备后用)，再以保存的阳性质粒为模板将25对引物分成四组进行多重PCR，根据核酸电泳结果对引物进行筛选或重新设计，直到扩增出理想的目的条带，并通过调整反应体系中的镁离子浓度和对退火温度进行优化，最后以病毒样品为模板把四组多重引物进行多重RT-PCR(在P3实验室、按照CDC规定标准操作)进行验证并做敏感性特异性试验。在多重RT-PCR建立的基础上，设计出1对通用引物并对25特异性引物进行修饰建立多重不对称RT-PCR。最后用保存菌液样品和病毒样品进行多重不对称PCR/RT-PCR验证，具体试验过程参见实施例1-11。
一个方面，本发明提供了一种用于禽流感病毒检测和分型的引物系统，其中包括25对多重不对称RT-PCR引物和1对通用引物，其中每一对所述多重不对称RT-PCR引物各针对一种禽流感病毒亚型，所述引物对应的型别及其核苷酸序列如表3所示。其中的TAMRA为荧光染料。
特异性和敏感性试验结果证明本发明提供的引物对都具有良好的型特异性和敏感性。可用于对待检样品进行多重不对称RT-PCR扩增，进而用于禽流感病毒检测和分型。
另一方面，本发明提供了一种不对称扩增禽流感病毒RNA的方法，该方法包括下列步骤1)病毒RNA的提取采集样品，常规方法提取RNA；2)多重不对称RT-PCR扩增以步骤1)中提取的RNA为模板进行多重不对称RT-PCR扩增，其中使用本发明所述的引物系统，PCR扩增的反应条件为50℃30min；95℃15min；94℃20s，52℃1min，72℃90s，共20个循环；然后94℃20s，70℃90s，共20个循环；最后72℃延伸10min；扩增产物可用于通过核酸杂交所进行的禽流病毒的检测和分型。
另一方面，本发明提供了使用本发明所述引物系统对禽流感病毒进行检测和分型的方法，该方法包括下列步骤1)病毒RNA的提取采集样品，常规方法提取RNA；2)多重不对称RT-PCR扩增以步骤1)中提取的RNA为模板进行多重不对称RT-PCR扩增，其中使用权利要求3所述的引物系统，扩增的反应条件为50℃30min；95℃15min；94℃20s，52℃1min，72℃90s，共20个循环；然后94℃20s，70℃90s，共20个循环；最后72℃延伸10min；3)杂交与洗涤加入步骤2)得到的多重不对称扩增产物与基因芯片，在适于与所选基因芯片进行杂交的条件下反应足够的时间，然后洗涤后甩干；4)结果判定将芯片插入芯片扫描仪中进行扫描分析，保存结果，然后根据出现阳性结果的微矩阵排列位置，查找该微矩阵排列位置点样时所对应的禽流感病毒亚型。
在本发明的一个具体实施方案中，所述检测和分型的方法包括下列步骤(1)采集样品和核酸的提取按常规方法提取RNA。
(2)多重不对称RT-PCR以提取的RNA为模板进行多重不对称RT-PCR。反应体系在0.2mL反应管中依次加入10μL QIAGENE onestep RT-PCR buffer(5×)，10mM dNTP 2.0μL，Enzyme mix 2.0μL，RNase inhibitor 0.5μL，上、下游通用引物分别为0.5μL和5μL(10μM)，上、下游特异性引物分别为0.5μL和1μL(10μM)，RNA模板5μL，补RNas-freewater至50μL。将样品管放入MJ RESEARCH PTC-200PCR仪后，设置如下条件进行反应50℃30min；95℃15min；94℃20s，52℃1min，72℃90s，共20个循环；然后94℃20s，70℃90s，共20个循环；最后72℃延伸10min。
(3)基因芯片的杂交试验与洗涤取多重不对称RT-PCR扩增产物5.2μL，加杂交缓冲液6μL，质控探针0.8μL混匀，95℃变性5min，立即冰浴3min，4000rpm离心5～10s，将离心管放回冰浴；在杂交盒(HybriCassettesTM，北京博奥生物芯片有限责任公司)的沟槽中加入200μL蒸馏水以防杂交体系蒸发，将芯片正面向上放入盒中。用移液器吹打均匀后取样品杂交液7μL于芯片点样区，迅速盖上盖片和杂交盒并密封，水平放到52℃水浴中杂交2.5hr。杂交完毕，将杂交盒水平拿出，立即将芯片取出，放入预热至45℃的洗涤液I(2×SSC，0.1％SDS)中，100rpm洗涤5min。取出芯片放入45℃的洗涤液I中再洗一次。取出芯片，放入预热至45℃的洗涤液II(0.2×SSC，0.1％SDS)，100rpm洗涤5min，洗涤两次。取出芯片，放入洗液III(0.2×SSC)，100rpm室温洗涤5min。将芯片在无水乙醇中浸提几次，然后把芯片放入芯片盒中，1000r/min离心5min甩干。
(4)基因芯片的扫描将芯片插入PerkinElmer ScanArray Gx plus扫描仪中进行扫描分析，保存结果。
(5)芯片扫描结果的判读根据禽流感基因芯片的微矩阵排列进行判读。
图1图示的是用所设计的引物进行的多重RT-PCR琼脂糖核酸电泳结果，其中M为DL 2000DNA Marker。图1A为第一组结果(泳道1、2、3、4、5、6和7分别为H1N1、H3N2、H5N1、H6、H7N1、H9N2和阴性对照)；图1B为第二组结果(泳道1、2、3、4、5、6、7、8和9分别为H2、H4、H8、H10、H11、H13、H15、H16和阴性对照)；图1C为第三组结果(泳道1、2、3、4、5、6分别为H14、N4、N6、N7、N9和阴性对照)；图1D为第四组结果(泳道1、2、3、4、5分别为H12、N3、N5、N8和阴性对照)。
图2图示的是多重RT-PCR特异性试验核酸电泳结果，其中M为DL 2000DNA Marker。图2A为第一组试验结果(泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9和10分别为鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、呼肠孤病毒、传染性法氏囊病毒、传染性鼻炎、H7N1和H5N1混合RNA、H3N2和H9N2混合RNA、H1N1RNA、阴性对照)。图2B为第二组试验结果(泳道1、2、3、4、5、6、7、8和9分别为鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、呼肠孤病毒、传染性法氏囊病毒、传染性鼻炎、H8、H15和阴性对照)；图2C为第三组多特异性试验结果(泳道1、2、3、4、5、6、7、8和9分别为鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、呼肠孤病毒、传染性法氏囊病毒、传染性鼻炎、N4、N9和阴性对照)；图2D为第四组试验结果(泳道1、2、3、4、5、6、7、8和9分别为鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、呼肠孤病毒、传染性法氏囊病毒、传染性鼻炎、N3、N5和阴性对照)。
图3图示的是用所设计的引物进行的多重不对称RT-PCR琼脂糖核酸电泳结果，其中M为DL 2000 DNA Marker。图3A为第一组试验结果(泳道1、2、3、4、5、6和7分别为H1N1、H3N2、H5N1、H6、H7N1、H9N2和阴性对照)；图3B为第二组试验结果(泳道1、2、3、4、5、6、7、8分别为H2、H4、H8、H10、H11、H13、H15、H16和阴性对照)；图3C为第三组试验结果(泳道1、2、3、4、5、6分别为H14、N4、N6、N7、N9和阴性对照)；图3D为第四组试验结果(泳道1、2、3、4、5分别为H12、N3、N5、N8和阴性对照)。
图4图示的是芯片表面的探针微矩阵排列分布图。QC质控探针 PC阳性探针 NC阴性参照 DP(H1-16，N1-9)检测探针图5图示的是应用所涉及探针和引物进行基因芯片研究的基因芯片扫描结果图5-1为阴性对照；图5-2、5-3、5-4、5-5、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-11、5-12、5-13、5-14、5-15、5-16、5-17、5-18、5-19、5-20、5-21、5-22、5-23、5-24、5-25、5-26、5-27和5-28分别为H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、8个常见亚型AIV和25个亚型AIV的杂交扫描结果。
本发明的优点1.本发明的试剂及检测方法充分利用了PCR技术的高效扩增性、核酸杂交的良好特异性和荧光检测技术的敏感性，对不同型禽流感进行快速、敏感、准确的检测。利用本发明所述引物系统和检测及分型方法，能同时准确、快速的鉴定出禽流感病毒株的各种神经氨酸酶亚型(N1～9)，还能区分感染人的H3N2、H2N2、H1N1、和H1N2等亚型。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。
实施例实施例1引物的设计和合成根据Genebank中发表的不同亚型禽流感病毒的基因组序列，利用DNAStar/Bioedit软件对其进行序列分析，采用Primer5.0、OMIGA和Beacon Designer 2.1软件设计25对引物，由上海生工生物工程有限公司合成，序列如表1所示。
表1.多重PCR/RT-PCR的引物
注Y＝(C，T)，W＝(A，T)。
实施例2可获得标准毒株的禽流感病毒亚型的RT-PCR扩增本实施例中，对于能够获得标准毒株的8个禽流感病毒亚型(H1、H3、H5、H6、H7、H9、N1和N2)，通过从标准毒株提取RNA，然后以此为模板直接进行常规RT-PCR扩增。
2.1模板RNA的提取按QIAamp Viral RNA Mini Kit(购自QIAGEN公司)说明书提供的方法，从禽流感病毒标准株中提取禽流感病毒基因组RNA。
2.2RT-PCR反应体系参照一步法RT-PCR试剂盒(购自QIAGEN公司)操作说明，稍加修改进行。反应体系在0.2mL反应管中依次加入QIAGENE onestep RT-PCR buffer(5×)10μL，10mM dNTP 2.0μL，Enzyme mix 2.0μL，RNase inhibitor 0.5μL，上、下游引物各0.5μL(10μM)，RNA模板5μL，补RNas-free water至50μL。其中所使用的上下游引物为选自针对H1、H3、H5、H6、H7、H9、N1和N2其中之一亚型的引物对。反应条件为50℃30min，95℃15min，然后94℃30s，52℃40s，72℃1min，共40个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后取5μL产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳-溴化乙锭染色分析。
电泳结果表明扩增得到了预期大小的目的DNA片段。对回收产物进行测序鉴定，测序鉴定表明所设计引物特异敏感，然后把上述扩增产物连于T载体克隆保存以备后用。
实施例3无法获得标准毒株的禽流感病毒基因亚型相应基因片段的人工合成本实施例中，对于其余17个不能获得标准毒株的亚型(包括H2、H4、H8、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9)，则通过搭桥PCR扩增合成得到相应的目的DNA片段。
本实施例中合成了上述所有17个基因型的目的DNA片段，在此仅以H15为例详细记述合成过程，其余16个基因型目的DNA片段的合成过程，除分别选用相应的不同引物对外，其他步骤都相同。
3.1引物设计利用DNAStar和Bioedit软件分别对已发表的所有H15型AIV的全基因序列分析，采用Primer5.0和OMIGA软件设计五条上游引物H15-F、H15-F1、H15-F2、H15-F3、H15-F4，五条下游引物H15-R、H15-R1、H15-R2、H15-R3、H15-R4。H15-F和H15-R按常规的引物合成原则进行设计和合成。而其它引物的设计和合成则需满足搭桥PCR的要求，其长度为59bp，其中H15-F1/H15-R1、H15-R1/H15-F2、H15-F2/H15-R2、H15-R2/H15-F3、H15-F3/H15-R3、H15-R3/H15-F4、H15-F4/H15-R4之间各有平均20bp的互补碱基，引物序列见表4。
表2.搭桥PCR合成H15亚型目的片段所用引物
3.2DNA片段延伸首先由H15-F1/H15-R1、H15-F2/H15-R2、H15-F3/H15-R3、H15-F4/H15-R4四对引物进行DNA链延伸反应，得到四个短片段；将前两个短片段进行DNA链延伸、后两个短片段DNA链延伸，可得到两个中等长度片段；接着将这两个中等长度片段进行DNA链延伸，得到预期大小的DNA片段即为所要的目的基因。
3.2.1短片段DNA链延伸的反应体系和条件10×buffer 5μL，dNTP 4μL，H15-F1/H15-R1(H15-F2/H15-R2、H15-R2/H15-F3、H15-F3/H15-R3、H15-F4/H15-R4)上下游引物各1μL，AccuPoLTMDNA Polymerase 1μL，补灭菌无离子水至50μL。反应条件为94℃30s，72℃15min。
3.2.2中等长度片段DNA链延伸的反应体系和条件10×buffer 1μL，dNTP 4μL，AccuPoLTMDNA Polymerase 1μL，两个短DNA片段产物(由3.2.1产生)各22μL，总体系为50μL。反应条件为94℃30s，72℃15min。
3.3目的DNA片段的合成和鉴定以3.2.2中链延伸反应获得的DNA片段为模板，H15-F/H15-R为引物进行PCR反应，反应体系10×buffer 5μL，dNTP 4μL，上下游引物各1μL，AccuPoLTMDNA Polymerase 1μL，模板2μL，补灭菌无离子水至50μL。反应条件94℃5min；94℃30s，52℃40s，72℃1min，共40个循环；72℃，10min。
经过电泳和测序鉴定结果表明，扩增获得了预期的300bp的目的DNA片段。证明本发明设计合成的引物特异敏感。将目的DNA片段连接于T载体克隆保存以备后用。
实施例4多重RT-PCR扩增将禽流感病毒25个亚型分为四组。第一组为已获得禽流感病毒标准毒株的亚型组。第二、三、四组为禽流感病毒其余17亚型的随机分组，具体为第一组H1、H3、H5、H6、H7、H9、N1和N2；第二组为H2、H4、H8、H10、H11、H13、H15、H16；第三组为H14、N4、N6、N7、N9；第四组为H12、N3、N5、N8。
4.1多重RT-PCR反应体系参照一步法RT-PCR试剂盒操作说明，稍加修改进行。反应体系在0.2mL反应管中依次加入10μL QIAGENE onestep RT-PCR buffer(5×)，10mM dNTP 2.0μL，Enzyme mix 2.0μL，RNase inhibitor 0.5μL，上、下游特异性引物各0.5μL(10μM)，RNA模板5μL，补RNas-free water至50μL。
4.2多重RT-PCR反应条件将样品管放入MJ RESEARCH PTC-200PCR仪后，设置如下条件进行反应50℃预变性30min；95℃，15min；94℃，30s，52℃，40s，72℃，1min，40个循环；72℃，10min。反应结束后，取5μl扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分析。
实施例5多重不对称RT-PCR扩增
5.1多重不对称PCR/RT-PCR的引物的设计和合成在表1中引物序列的5’端加上相应通用引物序列(即特异性上游引物加通用上游引物，特异性下游引物加通用下游引物)，并在下游引物的5’端进行荧光修饰，得到不对称扩增引物，由上海生工生物工程有限公司合成，序列见表3。
表3不对称多重PCR/RT-PCR的引物
其中TAMRA为荧光染料。
参照一步法RT-PCR试剂盒操作说明，进行修改。反应体系在0.2mL反应管中依次加入10μL QIAGENE onestep RT-PCR buffer(5×)，10mM dNTP 2.0μL，Enzyme mix 2.0μL，RNase inhibitor 0.5μL，表3中的上、下游通用引物分别为0.5μL和5μL(10μM)，上、下游特异性引物(表3中的引物)分别为0.5μL和1μL(10μM)，RNA模板5μL，补RNas-free water至50μL。
将样品管放入MJ RESEARCH PTC-200 PCR仪后，设置如下条件进行反应50℃30min；95℃15min；94℃20s，52℃1min，72℃90s，共20个循环；然后94℃20s，70℃90s，共20个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后取5μL产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳-溴化乙锭染色分析。
实施例6基因芯片的制备6.1探针的设计与合成根据Genebank中发表的不同亚型禽流感病毒的基因组序列，利用Bioedit、Primer5.0和OMIGA软件分别对已发表的所有型AIV的全基因序列进行分析筛选，设计了进行禽流感基因芯片分型技术的52条特异性探针和3条质控探针，由上海生工生物工程有限公司合成，见表4。
表4禽流感基因芯片探针
6.2基因芯片的制备芯片设计的微矩阵为14×9阵列(见图4)，矩阵设计图包括4个部分QC为点样阳性参照，8个重复位点；NC为阴性参照，10个重复位点；PC为杂交阳性参照，2个重复位点；其它位点为检测探针，25个亚型52条特异性探针，每条探针2个重复位点。委托北京华大基因研究中心点样。芯片使用的固相载体为醛基玻片(购自CELAssociates，Inc.Pearland，Texas)。
实施例7利用基因芯片的杂交试验(1)杂交缓冲液(提前配制)ddH2O 0.84μL，20×SSC 1.80μL，50×Denhardt’s 1.80μL，50％硫酸葡聚糖3.60μL，4％SDS 1.80μL。
(2)杂交反应体系杂交缓冲液6μL，多重不对称扩增产物5.2μL，质控探针0.8μL混匀。
(3)将(2)中的杂交反应体系95℃变性5min，立即冰浴3min，立即冰浴3min，4000rpm离心5～10s，将离心管放回冰浴。
(4)在杂交盒(HybriCassettesTM，北京博奥生物芯片有限责任公司)的沟槽中加入200μL蒸馏水以防杂交体系蒸发，将芯片正面向上放入盒中。
(5)用移液器吹打均匀后取取样品杂交液7μL于芯片点样区，迅速盖上盖片和杂交盒并密封，水平放到52℃水浴中杂交2.5hr。
(6)杂交完毕，将杂交盒水平拿出，立即将芯片取出，放入预热至45℃的洗涤液I(2×SSC，0.1％SDS)中，100rpm洗涤5min。取出芯片放入45℃的洗涤液I中再洗一次。
(7)取出芯片，放入预热至45℃的洗涤液II(0.2×SSC，0.1％SDS)，100rpm洗涤5min，洗涤两次。
(8)取出芯片，放入洗液III(0.2×SSC)，100rpm室温洗涤5min。
(9)将芯片在无水乙醇中浸提几次，然后把芯片放入芯片盒中，1000r/min离心5min甩干，用PerkinElmer ScanArray Gx plus进行芯片扫描。
实施例8基因芯片检测有效性试验将禽流感病毒H1N1、H3N2、H5N1、H6N2、H7N1和H9N2型多重不对称RT-PCR扩增产物等比例混合后与芯片杂交，又将全部亚型的扩增产物等比例混合与芯片杂交，结果表明在所有对应的检测位点都能检测到阳性杂交信号(如
5-27、5-28所示)。
实施例9基因芯片检测敏感性试验通过噬斑形成试验对禽流感病毒(H1、H3、H5、H6、H7、H9、N1和N2)尿囊液进行病毒定量，用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取RNA，并对其进行10倍递进稀释，进行多重不对称RT-PCR(见实施例5)，然后按照实施例6进行基因芯片的杂交与洗涤(每型AIV作3个芯片微矩阵的重复试验)，最后将芯片1000r/min离心5min甩干，用PerkinElmer ScanArrayGx plus进行芯片扫描和结果判读。
敏感性试验结果以H5N1为例，噬斑总数为2.47×107pfu/mL，其敏感度可达247pfu/mL。
实施例10基因芯片检测特异性试验按常规方法分别提取各亚型AIV、传染性支气管炎病毒(IBV)AV10、禽呼肠孤病毒(ARV)AV2311 CEK3、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)等常见病毒核酸，进行基因芯片检测。
每个样品重复3次，结果相一致。除各亚型AIV检测结果在相应位点出现阳性杂交信号外，其他病毒的检测结果均为阴性传染性支气管炎病毒(IBV)AV10、禽呼肠孤病毒(ARV)AV2311 CEK3、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)基因芯片检测结果均为阴性，除QC和PC阳性参照荧光信号外其它位点均无检测信号(结果如
5-1所示)；而每个亚型AIV的检测结果只在各自相应的位点出现阳性信号(结果如
5-2～5-26所示)。
实施例11基因芯片检测初步应用试验对395份口岸检样(4省20多个地区)，分别采用基因芯片和经典病原分离两种检测方法进行了平行检测。两种方法检测结果完全一致，表明所建立基因芯片检测技术具有良好的可靠性与实用性。
序列表<110>中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所<120>用于禽流感病毒检测和分型的引物系统和方法<130>
<160>52<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(19)<223>
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<221>引物<222>(1)..(20)<223>
<400>2ggtttcggat gttacagcgt 20<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(40)<223>
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<220>
<221>引物<222>(1)..(41)<223>
<400>4ggtttcggat gttacagcgt gacactctcc tattgtgact g 41<210>5<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(39)<223>
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<220>
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<221>引物<222>(1)..(42)<223>
<400>7tcacttgctt ccgttgagga gtgaattgga atatggtaac tg42<210>8<211>43<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(43)<223>
<400>8ggtttcggat gttacagcgt aactgagtgt tcattttgtc aat 43<210>9<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>引物<222>(1)..(40)<223>
<400>12ggtttcggat gttacagcgt tcyccttgtg cattttgatg 40<210>13<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(40)<223>
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<221>引物<222>(1)..(41)<223>
<400>14ggtttcggat gttacagcgt ggatcttact cgcaatgtct g 41<210>15<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(39)<223>
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<221>引物<222>(1)..(42)<223>
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<221>引物<222>(1)..(39)<223>
<400>18ggtttcggat gttacagcgt acatgctgag cacttcctg39<210>19<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(40)<223>
<400>19
tcacttgctt ccgttgaggc gtcattcttc aggaacatgg 40<210>20<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(40)<223>
<400>20ggtttcggat gttacagcgt ggccttgttg ctatttcwgg 40<210>21<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(40)<223>
<400>21tcacttgctt ccgttgaggt tgttayccat ttgatgtgcc 40<210>22<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(40)<223>
<400>22ggtttcggat gttacagcgt gtractcttc cagggttgtt 40<210>23<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(40)<223>
<400>23tcacttgctt ccgttgagga aggttggtca tacatagtgg 40<210>24<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>24ggtttcggat gttacagcgt gtcctcttac taatggtctg g 41<210>25<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>
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<221>引物<222>(1)..(43)<223>
<400>26ggtttcggat gttacagcgt ttactyactc tactaggtgc tat 43<210>27<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物
<222>(1)..(39)<223>
<400>27tcacttgctt ccgttgagga cttagaaatg tcccagcaa39<210>28<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>引物<222>(1)..(40)<223>
<400>29tcacttgctt ccgttgagga gtacaagaac accagagatt 40<210>30<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>30ggtttcggat gttacagcgt ctggccatcc gccttctat 39<210>31<211>38<212>DNA<213>人工序列
<220>
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<220>
<221>引物<222>(1)..(39)<223>
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<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(40)<223>
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<400>46
ggtttcggat gttacagcgt cactcttcta tatgctgtgc 40<210>47<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>引物<222>(1)..(40)<223>
<400>48ggtttcggat gttacagcgt ccggaatagc ctgaccaatt 40<210>49<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(39)<223>
<400>49tcacttgctt ccgttgaggg ggcamtgatg tatggatgg39<210>50<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(40)<223>
<400>50ggtttcggat gttacagcgt aagaatagct ccatcgtgcc 40<210>51<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(39)<223>
<400>51tcacttgctt ccgttgaggt tctatgctct cagccaagg39<210>52<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(40)
<223>
<400>52ggtttcggat gttacagcgt tggcatacgc attcagattc 40
权利要求
1.一种用于禽流感病毒检测和分型的引物系统，其中包括25对多重不对称RT-PCR引物和1对通用引物，其中所述多重不对称RT-PCR引物其中每一对各针对禽流感病毒的一种亚型，所述引物所对应的型别及其核苷酸序列分别为
其中TAMRA为荧光染料。
2.一种不对称扩增禽流感病毒RNA的方法，该方法包括下列步骤1)病毒RNA的提取采集样品，常规方法提取RNA；2)多重不对称RT-PCR扩增以步骤1)中提取的RNA为模板进行多重不对称RT-PCR扩增，其中使用权利要求3所述的引物系统，扩增的反应条件为50℃30min；95℃15min；94℃20s，52℃1min，72℃90s，共20个循环；然后94℃20s，70℃90s，共20个循环；最后72℃延伸10min；扩增产物可用于通过核酸杂交所进行的禽流病毒的检测和分型。
3.一种用于禽流感病毒检测和分型的方法，该方法包括下列步骤1)病毒RNA的提取采集样品，常规方法提取RNA；2)多重不对称RT-PCR扩增以步骤1)中提取的RNA为模板进行多重不对称RT-PCR扩增，其中使用权利要求3所述的引物系统，扩增的反应条件为50℃30min；95℃15min；94℃20s，52℃1min，72℃90s，共20个循环；然后94℃20s，70℃90s，共20个循环；最后72℃延伸10min；3)杂交与洗涤加入步骤2)得到的多重不对称扩增产物与基因芯片，在适于与所选基因芯片进行杂交的条件下反应足够的时间，然后洗涤后甩干；4)结果判定将芯片插入芯片扫描仪中进行扫描分析，保存结果，然后根据出现阳性结果的微矩阵排列位置，查找该微矩阵排列位置点样时所对应的禽流感病毒亚型。
全文摘要
本发明提供了用于禽流感病毒检测和分型的引物系统和不对称扩增禽流感病毒RNA的方法。本发明采用根据Genebank中已发表的禽流感病毒所有亚型的基因组序列设计筛选出了25对多重不对称RT－PCR引物、1对通用引物，以及52条特异性探针和3条质控探针，所述25对多重不对称RT－PCR引物其中的每一对各针对禽流感病毒的一种亚型，由所述25对多重不对称RT－PCR引物和1对通用引物组成的引物系统可用于禽流感的检测和分型。进一步，使用所述引物系统建立了不对称扩增禽流感病毒RNA的方法和检测和分型禽流感病毒的方法。通过有效性试验、特异性试验、敏感性试验检测，证明本发明建立的方法特异性强、敏感性高，并进行了初步应用。
文档编号C12N15/11GK101058833SQ20071000345
公开日2007年10月24日 申请日期2007年2月8日 优先权日2007年2月8日
发明者韩雪清, 林祥梅, 吴绍强, 梅琳, 朱忠武, 廉慧峰, 贾广乐 申请人:中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所