专利名称：抗肿瘤活性物质二酮哌嗪pj147和pj157的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及的是从海洋真菌Gliocladium sp.YUP08的菌丝体中分离得到的具有抗肿瘤活性的二酮哌嗪化合物PJ147和PJ157。
背景技术：
海洋抗肿瘤天然产物在海洋药物研究中一直占据主要地位，不仅开展得最早而且具有扎实的研究基础。现已发现的海洋生物提取物中至少有10％具有细胞毒活性。美国每年有1500个海洋化合物单体被分离出来，1％具抗肿瘤作用。目前已有多个海洋抗癌药物进入临床或临床前研究阶段，预计不久的将来，部分品种将可正式投入临床使用。
海洋微生物抗肿瘤活性的研究与其他海洋生物相比，相对较晚，但前景却更为广阔。虽然在海洋动植物中已发现了许多高效低毒的抗肿瘤生物活性物质，但是由于海洋动植物来源的有限性，使海洋动植物抗肿瘤药物的应用受到一定的限制。而利用海洋微生物进行发酵生产抗肿瘤活性物质，则不受此限制，可避免因为过度采集海洋动植物而造成的生态破坏，而且海洋微生物可通过诱变等方法提高活性物质的产量。因此，海洋微生物的开发为抗肿瘤药物的工厂化生产带来了更加诱人的前景。
对海洋真菌次级代谢产物的研究起步相对较晚，从1988年开始才有相关的文献报道，到1992年从海洋真菌中发现的新化合物只有15个。从1994年开始对海洋真菌次级的研究得到了研究者的重视，研究工作发展迅猛，蓬勃兴起，越来越多的结构新颖的化合物被发现。
美国DMI生物科学公司2004.05.14在中国申请了名称为“T-细胞介导的疾病的治疗”的发明专利，申请号是200480013249.0，它提供合成二酮哌嗪类的方法和包含某些二酮哌嗪类的药物组合物。其中二酮哌嗪类的合成方法与本发明不同，产物的结构也不同。
发明内容
本发明的目的在于利用丰富的海洋微生物资源寻找新的环肽类抗肿瘤化合物，为研究开发新的抗癌药提供先导化合物。本发明所涉及的两个二酮哌嗪PJ147和PJ157，是一对几何异构的化合物，已发现的同类化合物中，还没有具有同样的牻牛儿基取代集团的二酮哌嗪化合物。
本发明是利用从乳山采集的海泥分离得到海洋真菌Gliocladium sp.YUP08的菌丝体的丙酮提取物为原料，综合利用各种色谱手段分离得到了这两个化合物。并利用各种化学和光谱手段，鉴定了这两个化合物的平面和立体结构。命名为二酮哌嗪PJ147和PJ157，这两个化合物的结构如下所示
本发明是按照如下方案实现的，培养基配方如下马铃薯浸汁200ml，海泥浸汁80ml，蛋白胨2g，葡萄糖15g，NaCl 12g，MgCl26H2O 1.1g，KCl0.1g，蒸馏水1000ml；菌株在该培养基上菌落灰褐色，有粘液，分生孢子梗顶端排列成帚状间枝，分生孢子浅灰褐色，球形或卵圆形，聚集成团，根据此特征鉴定为青霉属Gliocladium sp；在24℃的温度下，150rpm摇床，振荡培养9天，大量发酵生产菌Gliocladium sp.YUP08菌株，得到发酵液35L，16层纱布过滤，得到菌丝体和水层，菌丝体晾干后净重200g，置于2000mL容量瓶中，用丙酮超声提取，直至减压回收溶剂后无残留物为止，干燥浸膏用甲醇反复溶解，得到甲醇可溶性浸膏36g，菌丝体提取物丙酮溶解，用硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮梯度洗脱，得到各流份，再利用色谱技术分离得到化合物二酮哌嗪PJ147和二酮哌嗪PJ157。
本发明所用的原料海洋真菌采自乳山采集的海泥，经国家海洋局第一海洋研究所田黎教授鉴定为Gliocladium sp.。
本发明提供了两个二酮哌嗪PJ147和PJ157，是一对几何异构的化合物，已发现的同类化合物中，还没有具有同样的牻牛儿基取代集团的二酮哌嗪化合物，二酮哌嗪PJ147和PJ157具有较强的抗肿瘤活性，本发明为研究开发新的抗癌药提供了先导化合物。
具体实施例方式菌株经培养条件测试，在马铃薯海泥浸汁培养基上产生的抑真菌活性最高，培养配方如下马铃薯浸汁200ml，海泥浸汁80ml，蛋白胨2g，葡萄糖15g，NaCl 12g，MgCl26H2O 1.1g，KCl 0.1g，蒸馏水1000ml。
菌株在该培养基上菌落灰褐色，有粘液，分生孢子梗顶端排列成帚状间枝，分生孢子浅灰褐色，球形或卵圆形，聚集成团，根据此特征鉴定为青霉属Gliocladium sp.。
24℃的温度下，150rpm摇床，振荡培养9天，大量发酵生产菌Gliocladium sp.YUP08菌株，得到发酵液35L。16层纱布过滤，得到菌丝体和水层。菌丝体晾干后净重200g，置于2000mL容量瓶中，用丙酮超声提取，直至减压回收溶剂后无残留物为止(提取4次)，干燥浸膏用甲醇反复溶解，得到甲醇可溶性浸膏36g。菌丝体提取物丙酮溶解，用硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮梯度洗脱，得到各流份，再利用各种色谱技术分离得到这2个化合物。物理常数及波谱数据如下二酮哌嗪PJ147白色无定形粉末，[α]D20-150°(c 0.1，CH3OH)，UV(CH3OH)λmaxnm 315，225，203 UV(CH3OH)λmaxnm 315，225，203，IR(KBr)νmax(cm-1)3310，2921，1688，1606，1521，1442，1251；1H and13C NMR数据见表2；EI-MS m/z368[M]+，248，232，217，133，81，69(base)，41；HRFABMS m/z368.4689(calcd for C22H28N2O3，368.4693).
二酮哌嗪PJ157白色无定性粉末(甲醇)，[α]D20-78(c 0.5，CH3OH)，UV(CH3OH)λmaxnm319，230，202；IR(KBr)νmax(cm-1)3319，2922，1670，1641，1510，1466，1386，1253；1H and13C NMR数据见表2；EI-MS m/z368[M]+，248，217，133，81，69(base)，41；HRFABMS m/z368.4685(calcd for C22H28N2O3，368.4693).
表2.PJ147和PJ157的核磁数据(DMSO-d6)
经体外抗肿瘤活性试验，两个化合物对小鼠白血病P388、人肺腺癌A-549、人白血病HL-60、人肝癌BEL-7402、人黑色素瘤A375-S2、人宫颈癌Hela等肿瘤细胞的IC50如表1所示表1PJ147和PJ157对6种肿瘤细胞系的细胞毒活性(IC50，μmol/L)
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权利要求
1.抗肿瘤活性物质二酮哌嗪PJ147和PJ157，其特征在于以从采集的海泥分离得到海洋真菌Gliocladium sp.YUP08的菌丝体的丙酮提取物为原料，利用色谱手段分离得到的化合物，二酮哌嗪PJ147和PJ157，化合物的结构式如下。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤活性物质二酮哌嗪PJ147和PJ157，其特征在于所述海泥为乳山采集的海泥。
3.一种如权利要求1所述的抗肿瘤活性物质二酮哌嗪PJ147和PJ157的制备方法，其特征在于培养基配方如下马铃薯浸汁200ml，海泥浸汁80ml，蛋白胨2g，葡萄糖15g，NaCl 12g，MgCl26H2O 1.1g，KCl 0.1g，蒸馏水1000ml；菌株在该培养基上菌落灰褐色，有粘液，分生孢子梗顶端排列成帚状间枝，分生孢子浅灰褐色，球形或卵圆形，聚集成团，根据此特征鉴定为青霉属Gliocladium sp；在24℃的温度下，150rpm摇床，振荡培养9天，大量发酵生产菌Gliocladium sp.YUP08菌株，得到发酵液35L，16层纱布过滤，得到菌丝体和水层，菌丝体晾干后净重200g，置于2000mL容量瓶中，用丙酮超声提取，直至减压回收溶剂后无残留物为止，干燥浸膏用甲醇反复溶解，得到甲醇可溶性浸膏36g，菌丝体提取物丙酮溶解，用硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮梯度洗脱，得到各流份，再利用色谱技术分离得到化合物二酮哌嗪PJ147和二酮哌嗪PJ157。
4.抗肿瘤活性物质二酮哌嗪PJ147和PJ157在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了两种抗肿瘤活性物质二酮哌嗪PJ147和PJ157。它们是以从采集的海泥分离得到海洋真菌Gliocladium sp.YUP08的菌丝体的丙酮提取物为原料，利用色谱手段分离得到的化合物，结构式如图所示。本发明的菌株为青霉属Gliocladium sp；经大量发酵得到发酵液，过滤得到菌丝体和水层，菌丝体晾干置于瓶中，用丙酮超声提取，直至减压回收溶剂后无残留物为止，干燥浸膏用甲醇反复溶解，得到甲醇可溶性浸膏，菌丝体提取物丙酮溶解，用硅胶柱色谱分离，以石油醚－丙酮梯度洗脱，得到各流份，再利用色谱技术分离得到化合物二酮哌嗪PJ147和二酮哌嗪PJ157，可用于制备抗肿瘤药物，为抗癌药物提供了先导化合物。
文档编号C12P17/12GK101041640SQ200710006650
公开日2007年9月26日 申请日期2007年1月22日 优先权日2006年7月9日
发明者裴月湖, 黄永富, 田黎 申请人:沈阳药科大学