专利名称：一种双歧杆菌活菌制剂及其专用保护剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种双歧杆菌活菌制剂及其专用保护剂。
背景技术：
双歧杆菌(Lactobacillus bifidus)是一类革兰氏阳性厌氧菌，它是健康人肠道数量最多、最常见的正常菌群之一。1899年由法国巴斯德研究所的Tissier博士首次从健康的母乳喂养的婴儿粪便中分离得到。之后，以日本为主以及包括欧洲国家在内各国家的研究人员通过30多年的研究，渐渐发现了双歧杆菌对人体的有益作用，并已成为衡量机体健康、评价改善胃肠菌群的功能性食品的标志之一。双歧杆菌在健康成年人及长寿老人胃肠道是优势菌，其随年龄变化呈动态趋势，并与许多病理毒理现象有密切相关，当肌体患病或衰老时肠道的双歧杆菌数量较正常少。大量的研究表明，双歧杆菌数量上的多少对人的生理与健康有着重要影响，对于维持肠道菌群平衡和防治各种肠道疾病有重要意义。在肠道内，双歧杆菌具有如下几种生理功能1.通过细胞上的磷酸与肠黏膜上皮细胞特异性地结合，从而占据肠粘膜表面，形成与肠上皮细胞相连接的细菌生物膜(膜菌群)，构成生物学屏障，阻止各种致病菌、条件致病菌的定植和入侵。2.营养作用在肠内发酵后可产生乳酸和醋酸，可提高钙、磷、铁的利用率，促进铁和维生素D的吸收。3.抗肿瘤作用由于双歧杆菌的存在及其生成的代谢产物优化了肠道菌群的组合，所以增强免役功能，抑制了肿瘤细胞的增殖和致癌物质的产生，并能激活机体吞噬细胞的吞噬活性，促进特异性和非特异性IgA抗体的产生，增强免役系统的功能，提高抗体抗病能力。此外双歧杆菌还有抗感染、降低胆固醇、延缓肌体衰老等作用。
双歧杆菌等微生态制品具有保健以及预防和治疗疾病的作用，主要依赖制品的功能活菌的存在，而如何提高发酵生产的活菌数，以及保持产品活菌的存活稳定性，对于制品的作用效果来说是一个非常关键的问题。由于双歧杆菌是专性厌氧菌，对空气和温度十分敏感，因此在实际应用中也出现一些问题。菌种在生产、运输和保存的过程中，容易失活。为了使产品的活菌数保持在一定的水平，国内外的研究人员做了大量关菌种基因改造、微囊技术、菌体包埋技术等方面的研究，但从目前来看，产品常常被要求在低温下保存，绝大多数含双歧杆菌的产品都没有解决常温保存的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种双歧杆菌活菌制剂及其专用保护剂。
本发明所提供的用于双歧杆菌活菌制剂的专用保护剂，由下述重量份的组分组成甘油0.01-5.0份；聚乙烯吡咯烷酮0.1-6.0份；聚乙二醇0.1-5.0份；脱脂奶粉1.0-10.0份；海藻糖0.5-15.0份；谷氨酸钠0.1-5.0份，L-天冬氨酸0.1-5.0份；维生素C钠0.1-5.0份；鸟氨酸盐酸盐0.1-5.0份。
所述双歧杆菌活菌制剂的保护剂，优选由下述重量份的组分组成甘油2.5份；聚乙烯吡咯烷酮3.0份；聚乙二醇3.0份；脱脂奶粉8.0份；海藻糖5.0份；谷氨酸钠0.5份，L-天冬氨酸0.5份；维生素C钠0.5份；鸟氨酸盐酸盐3.0份。
所述双歧杆菌活菌制剂的保护剂的各组分以溶液形式存在，所述甘油溶液为含有质量百分含量为0.01-5.0％甘油溶液；所述聚乙烯吡咯烷酮溶液为含有质量百分含量为0.1-6.0％聚乙烯吡咯烷酮溶液；所述聚乙二醇溶液为含有质量百分含量为0.1-5.0％聚乙二醇的溶液；所述脱脂奶粉溶液为含有质量百分含量为1.0-10.0％脱脂奶粉溶液；所述海藻糖溶液为含有质量百分含量为0.5％-15.0％海藻糖溶液；所述谷氨酸钠溶液或L-天冬氨酸溶液为含有质量百分含量为0.1％-5.0％谷氨酸钠和质量百分含量为0.1％-5.0％L-天冬氨酸的溶液；所述维生素C钠溶液为含有质量百分含量为0.1％-5.0％维生素C钠的溶液；所述鸟氨酸盐酸盐溶液为含有质量百分含量为0.1％-5.0％鸟氨酸盐酸盐的溶液。
所述甘油溶液优选为含有质量百分含量优选为2.5％甘油溶液；所述聚乙烯吡咯烷酮溶液优选为含有质量百分含量为3.0％聚乙烯吡咯烷酮溶液；所述聚乙二醇溶液优选为含有质量百分含量为3.0％聚乙二醇溶液；所述脱脂奶粉溶液优选为含有质量百分含量为8.0％脱脂奶粉溶液；所述海藻糖溶液优选为含有质量百分含量为5.0％海藻糖溶液；所述谷氨酸钠溶液或L-天冬氨酸溶液优选为含有质量百分含量为0.5％谷氨酸钠和质量百分含量为0.5％L-天冬氨酸的溶液；所述维生素C钠溶液优选为含有质量百分含量为0.5％维生素C钠的溶液；所述鸟氨酸盐酸盐溶液优选为含有质量百分含量为3.0％鸟氨酸盐酸盐溶液。
本发明提供的双歧杆菌活菌制剂，是在双歧杆菌菌体中加入上述的保护剂后，经冷冻干燥后得到的。
所述保护剂按照1.0×108-1.0×1012cfu/L菌体的量加入所述双歧杆菌菌体中并混合均匀。
所述冷冻干燥是将添加了保护剂套剂后的双歧杆菌菌体冻结后，依次进行下述三个步骤的进行干燥1)在-20-30℃，真空度为10-30Pa，升华干燥4-48小时；2)加热使双歧杆菌菌体温度为-10℃-50℃，真空度为10-30Pa，干燥2-24小时；3)在真空为10Pa以下，温度为26-29℃，干燥2-24小时。
所述冷冻干燥的步骤1)中的干燥温度优选为-5℃，干燥时间优选为12小时；步骤2)中的干燥温度优选为26℃-28℃，干燥时间优选为4小时；步骤3)中的干燥温度优选为28℃，干燥时间优选为4小时。
所述双歧杆菌菌体是用改良BS培养基或改良TPY培养基在温度33-40℃，压力为0.05MPa～0.08MPa，厌氧发酵双歧杆菌菌株6-24小时后，收集菌体得到的；所述改良BS培养基是由下述组分制成西红柿汁200ml，大豆蛋白胨15g，酵母提取物6g，葡萄糖10g，吐温801g，胰蛋白胨10g，牛肉膏0.3g，可溶性淀粉0.5g，牛肝浸出液5ml，复合盐溶液4.0ml，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，琼脂15g；所述复合盐溶液为含有K2HPO41.0g，CaCl20.2g，MgSO4·7H2O 0.48g，KH2PO41.0g，NaHCO310.0g，NaCl 2.0g的溶液；所述改良TPY培养基是由下述组分制成胰蛋白胨12g/L，示胨3g/L，大豆蛋白胨5g/L，葡萄糖5g/L，麦芽低聚糖5g/L，酵母浸出粉5g/L，吐温-801.0g/L，L-半胱氨酸盐酸0.5g/L，牛肝浸液200mL/L，西红柿汁100mL/L，混合盐溶液5mL/L，蒸馏水675mL/L，维生素B1 10mg/L，维生素B6 10mg/L，维生素B12 0.1mg/L；所述混合盐溶液为1L中含有K2HPO420.0g，MgCl2·6H2O 5.0g，ZnSO4·7H2O 2.5g，CaCl21.5g，FeCl30.5g。
所述双歧杆菌菌株的发酵温度优选为37℃。
实验表明，本发明的双歧杆菌活菌制剂在常温下保存24个月活菌数仍保持在较高的水平，并且在温度较高(37℃)的环境下，可以保持较长时间(10个月以上)有效。本发明的方法简便、易操做，适合大批量制备所有株型的双歧杆菌制剂，解决了用常规方法生产的双歧杆菌制品常温保存困难的问题，具有很高的应用价值。
具体实施例方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、双歧杆菌活菌制剂的制备及其保存时间测试一、双歧杆菌活菌制剂的制备1、双歧杆菌菌种活化将菌种青春双歧杆菌DM8504(购自大连医学院)接种于改良BS琼脂斜面培养基上。然后在放进厌氧培养箱中，在37±0.5℃的温度下厌氧培养48-72hr。
改良BS培养基的组分西红柿汁200ml，大豆蛋白胨15g，酵母提取物6g，葡萄糖10g，吐温80 1g，胰蛋白胨10g，牛肉膏0.3g，可溶性淀粉0.5g，牛肝浸出液5ml，复合盐溶液4.0ml，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，琼脂15g(配制固体培养基用时使用)。其中复合盐溶液的组分为K2HPO41.0g，CaCl20.2g，MgSO4·7H2O 0.48g，KH2PO41.0g，NaHCO310.0g，NaCl 2.0g。
上述改良BS培养基配制方法为称取大豆蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、胰酶解酪沅、牛肉膏、可溶性淀粉放入烧杯中，加入配制总量100～200的纯化水，用药勺搅匀，置于电炉上加热，边加热边搅拌至溶解，把烧杯从电炉上取下，称取L-半胱氨酸盐酸盐，趁热加入烧杯中，搅拌至溶解。加入西红柿液、牛肝浸出液、复合盐溶液、吐温80混合。加纯化水定容至所需总体积1000ml。将pH调至7.0-7.2，高压蒸汽121℃灭菌20min。配置固体培养基时加入琼脂后在灭菌。
其中复合盐溶液的制备方法为将CaCl2和MgSO4·7H2O在3ml蒸馏水中混合溶解，加500ml水，一边搅拌一边缓慢加入其它盐类。搅拌至溶解，加入200ml蒸馏水，混合后储存于冰箱中。
2、双歧杆菌的发酵培养1)一级种子液的培养取上述已活化培养的斜面种子，将菌落洗脱，以无菌操作法加入改良BS液体培养基(培养基的成分与斜面相同)，37℃厌氧培养36小时，得到一级种子液。
2)二级种子液的培养将一级种子液，接入改良BS液体培养基，接种量10％(体积比)，培养温度37℃，厌氧培养24小时，即为二级种子液。
3)发酵增殖培养改良BS培养基经高压蒸汽121℃灭菌20min后，充入氮气并冷却至37℃后备用。将二级种子液，接入充入氮气并冷却的改良BS液体培养基，接种量15％(体积比)， 发酵温度37±0.5℃，罐压为0.05MPa～0.08Mpa，厌氧发酵18小时发酵成熟(活菌数1.0×107-1.0×1010cfu/L)。
3、双歧杆菌活菌制剂的制备1)收集菌体将步骤4得到发酵成熟后的发酵液通过管道导入离心机，在低温(2-10℃)的条件下，用大容量离心机离心，8000rpm，离心15分钟。收集离心筒中的泥状菌体。
2)添加保护剂制备双歧杆菌活菌制剂的保护剂的组成为含有质量百分含量为2.5％甘油溶液；含有质量百分含量为3.0％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液；含有质量百分含量为3.0％药用聚乙二醇(PEG)的溶液；含有质量百分含量为8.0％脱脂奶粉的溶液；含有质量百分含量为5.0％海藻糖的溶液；含有质量百分含量为0.5％谷氨酸钠和质量百分含量为0.5％L-天冬氨酸的溶液；含有质量百分含量为0.5％维生素C钠(Vc-Na)的溶液；含有质量百分含量为3.0％鸟氨酸盐酸盐的溶液；将上述保护剂的各组分等体积混合，得到保护剂。
将收集的菌体，加入由上述保护剂均按照1.0×108菌体的量加入，搅拌混匀后，得到菌体悬浮液。
上述保护剂配制完成后，放置于2-8℃冰柜中冷却，备用。
3)冷冻干燥将步骤2)得到的菌体悬浮液，过滤，将含菌体的分装到冻干盘中，进行冷冻干燥。
冷冻干燥时，制品在搁板温度为20℃时入箱，并冻结至-40℃以下，保持4小时，干箱真空度达到20Pa时，开始第一阶段干燥，加热使温度升为-5℃，干燥箱真空度控制在10-30Pa，进行升华干燥12小时。升华干燥结束后，开始第二阶段干燥，加热使温度升至28℃，至制品温度升至26℃以上，干燥箱真空度控制在10-30Pa，保温4小时。最后进入真空控制在10Pa以下，温度28℃，干燥4小时，得到青春双歧杆菌DM8504活菌菌粉。
4)包装将步骤3)冷冻干燥后的双歧杆菌菌粉分装入铝膜袋中，进行抽真空包装。
二、双歧杆菌活菌制剂的稳定性检测将按照步骤一的方法制备青春双歧杆菌DM8504(购自大连医学院)活菌菌粉三个批次制剂B-1、B-2、B-3，分别分成两份，放置于37℃或25℃留样箱，37℃放置的样品每个月取样检测一次活菌数和活菌指数，25℃放置的菌粉每三个月取样检测一次活菌数和活菌指数，与常规冻干保护剂作为敷料制备的菌粉作为对照。常规冻干保护剂作为敷料的青春双歧杆菌DM8504(三个批次制剂A-1、A-2、A-3)购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
活菌数检测方法1.充分振摇液体样品，吸取3ml液体样品于三角瓶中(或称取3.0克菌粉)，加入27ml稀释液，盖上胶塞，按充分振摇，即成1∶10供试液；2.稀释吸取9ml稀释液到三角瓶中，盖上胶塞。吸取1∶10的供试液1ml，到装有9ml稀释液的三角瓶里，振摇均匀，使成1∶100的稀释度，重复上述操作，作10倍系列稀释，直至所需的稀释度；3.滴样吸取所需测定的稀释度(一般是最后一稀释度)的菌液0.1ml滴于BS平板培养基，用玻璃棒涂布均匀，共做3个平皿；4.培养将涂布均匀的平板正放于厌氧培养箱中，37℃厌氧培养48小时；5.菌落计数培养后观察每个平皿菌落的生长情况并在平皿上点计菌落数，如有2个或2个以上菌落重叠在一起，应全部计数，注意平皿菌落数应在10-300个之间，否则应调整稀释级，重新测定，点计后，按公式计算活菌数，填写记录。
6.计算公式
活菌指数＝lg(活菌数)以《中国生物制品规程》2000版对双歧杆菌菌粉活菌数的规定(1g菌粉的活菌数应不低于1.0×109CFU)作为参照标准，符合这个规定即为有效。
25℃放置的菌粉制剂的活菌数和活菌指数的检测结果如表1所示，结果表明，步骤一的方法制备的活菌菌粉制剂，在室温24个月后仍有效，活菌数均在450亿CFU/g以上，而以常规冻干保护剂作为敷料制备的菌粉制剂，保藏6-9个月后菌剂就低于1.0×109CFU/g了，表明本发明的方法制备的活菌制剂在室温的条件下，比常规方法制备的活菌制剂具有更高的菌存活能力，有效期远比常规方法长。
37℃放置的菌粉制剂的活菌数和活菌指数的检测结果如表2所示，结果表明，应用本发明活菌制品，37℃放置半年后仍高于1.0×109CFU/g，而以常规冻干保护剂作为敷料制备的菌粉，保藏2个月后活菌数就低于1.0×109CFU/g，表明步骤一的方法制备的活菌制剂在室内温度较高的情况下，有效期远比常规方法长。
表1本发明制备的菌粉与常规方法制备的菌粉室温保藏情况比较
(表中“—”表示菌粉活菌数低于1.0×106CFU/g)。
表2本发明制备的菌粉与常规方法制备的菌粉37℃加速试验比较
(表中“—”表示制品活菌数低于1.0×106CFU)。
实施例2、双歧杆菌活菌制剂的制备及其保存时间测试一、双歧杆菌活菌制剂的制备1、双歧杆菌菌种活化将菌种婴儿双歧杆菌ATCC 15697(购自美国ATCC菌种保藏中心)接种于改良TPY培养基斜面培养基上。然后在放进厌氧培养箱中，在37±0.5℃的温度下厌氧培养48-72hr。
上述改良TPY培养基是由下述组分制成胰蛋白胨12g/L，示胨3g/L，大豆蛋白胨5g/L，葡萄糖5g/L，麦芽低聚糖5g/L，酵母浸出粉5g/L，吐温-801.0g/L，L-半胱氨酸盐酸0.5g/L，牛肝浸液200mL/L，西红柿汁100mL/L，混合盐溶液5mL/L，蒸馏水675mL/L，调pH至7.0-7.2，121℃，灭菌15-20分钟。
混合盐溶液K2HPO420.0g，MgCl2·6H2O 5.0g，ZnSO4·7H20 2.5g，CaCl21.5g，FeCl30.5g。
上述培养基灭菌后，在使用之前，在无菌条件下加入维生素维生素B1 10mg/L，维生素B6 10mg/L，维生素B12 0.1mg/L。
西红柿汁的制作新鲜西红柿洗净后切块榨汁，然后按1∶1(质量比)加蒸馏水，隔水煮沸20分钟，补足蒸发损失量，经六层纱布过滤后(2次)，分装入点滴瓶中，以115℃，20分钟高压蒸汽灭菌。
肝浸液的制作新鲜牛肝剔去大的血管、筋腱和脂肪，经斩拌机斩碎，按1∶2(重量比)加入水浸泡，在2-8℃冰箱放置24小时，隔水煮沸2小时，补足蒸发损失量，经六层纱布过滤后(2次)，分装入点滴瓶中，以115-121℃，20分钟高压蒸汽灭菌。
2、双歧杆菌的发酵培养1)一级种子液的培养取上述已活化培养的斜面种子，将菌落洗脱，以无菌操作法加入改良BS液体培养基(培养基的成分与斜面相同)，33.0℃厌氧培养24小时，得到一级种子液。
2)二级种子液的培养将一级种子液，接入改良BS液体培养基，接种量15％(体积比)，培养温度33.0℃，厌氧培养12小时，即为二级种子液。
3)发酵增殖培养改良BS培养基经高压蒸汽121℃灭菌20min后，充入氮气并冷却至33℃后备用。将二级种子液，接入充入氮气并冷却的改良BS液体培养基，接种量15％(体积比)，发酵温度37±0.5℃，罐压为0.05MPa～0.08Mpa，厌氧发酵24小时发酵成熟。
3、双歧杆菌活菌制剂的制备制备双歧杆菌活菌制剂的保护剂的组成为含有质量百分含量为0.01％甘油溶液；含有质量百分含量为6.0％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液；含有质量百分含量为0.1％药用聚乙二醇(PEG)的溶液；含有质量百分含量为1.0％脱脂奶粉的溶液；含有质量百分含量为0.5％海藻糖的溶液；含有质量百分含量为0.1％谷氨酸钠和质量百分含量为5.0％L-天冬氨酸的溶液；含有质量百分含量为0.1％维生素C钠(Vc-Na)的溶液；含有质量百分含量为0.1％鸟氨酸盐酸盐的溶液。
将上述保护剂的各组分等体积混合，得到保护剂。
将收集的菌体，加入由上述保护剂均按照1.0×1012cfu/L菌体的量加入，搅拌混匀后，得到菌体悬浮液。
上述保护剂配制完成后，放置于2-8℃冰柜中冷却。
3)冷冻干燥将步骤2)得到的菌体悬浮液，过滤，将含菌体的滤液分装到冻干盘中，进行冷冻干燥。
冷冻干燥时，制品在搁板温度为30℃时入箱，并冻结至-40℃以下，保持4小时，干箱真空度达到10-30Pa时，开始第一阶段干燥，加热使温度升为-20℃，干燥箱真空度控制在20-25Pa，进行升华干燥4小时。升华干燥结束后，开始第二阶段干燥，加热使温度升至-10℃，至制品温度升至-10℃以上，干燥箱真空度控制在10-15Pa，保温2小时。最后进入真空控制在10Pa以下，温度28℃，干燥4小时，得到婴儿双歧杆菌ATCC 15697活菌菌粉。
4)包装将步骤3)冷冻干燥后的双歧杆菌菌粉分装入铝膜袋中，进行抽真空包装。
二、双歧杆菌活菌制剂的稳定性检测将按照步骤一的方法制备婴儿双歧杆菌ATCC 15697(购自美国ATCC菌种保藏中心)活菌菌粉三个批次制剂B-1、B-2、B-3，分别分成两份，放置于37℃或25℃留样箱，37℃放置的样品每个月取样检测一次活菌数和活菌指数，25℃放置的菌粉每三个月取样检测一次活菌数和活菌指数，与常规冻干保护剂作为敷料制备的菌粉作为对照。常规冻干保护剂作为敷料的婴儿双歧杆菌ATCC 15697(三个批次制剂A-1、A-2、A-3)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
按照实施例1的方法进行活菌数和活菌指数的检测；以《中国生物制品规程》2000版对双歧杆菌菌粉活菌数的规定(1g菌粉的活菌数应不低于1.0×109CFU)作为参照标准，符合这个规定即为有效。
25℃放置的菌粉制剂的活菌数和活菌指数的检测结果如表3所示，结果表明，步骤一的方法制备的活菌菌粉制剂，在室温24个月后仍有效，活菌数均在505CFU/g以上，而以常规冻干保护剂作为敷料制备的菌粉制剂，保藏12个月后菌剂就低于1.0×109CFU/g了，表明本发明的方法制备的活菌制剂在室温的条件下，比常规方法制备的活菌制剂具有更高的菌存活能力，有效期远比常规方法长。
37℃放置的菌粉制剂的活菌数和活菌指数的检测结果如表4所示，结果表明，应用本发明活菌制品，37℃放置4后仍高于1.0×109CFU/g，而以常规冻干保护剂作为敷料制备的菌粉，保藏4个月后活菌数就低于1.0×109CFU/g，表明步骤一的方法制备的活菌制剂在室内温度较高的情况下，有效期远比常规方法长。
表3本发明制备的菌粉与常规方法制备的菌粉室温保藏情况比较
(表中“—”表示菌粉活菌数低于1.0×106CFU/g)。
表4本发明制备的菌粉与常规方法制备的菌粉37℃加速试验比较
(表中“—”表示制品活菌数低于1.0×106CFU)。
实施例3、双歧杆菌活菌制剂的制备及其保存时间测试一、双歧杆菌活菌制剂的制备1、双歧杆菌菌种活化将菌种青春型双歧杆菌CGMCC 1.2190(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)接种于改良BS琼脂斜面培养基上。然后在放进厌氧培养箱中，在37±0.5℃的温度下厌氧培养48-72hr。
改良BS培养基的组分西红柿汁200ml，大豆蛋白胨15g，酵母提取物6g，葡萄糖10g，吐温80 1g，胰蛋白胨10g，牛肉膏0.3g，可溶性淀粉0.5g，牛肝浸出液5ml，复合盐溶液4.0ml，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，琼脂15g(配制固体培养基用时使用)。其中复合盐溶液的组分为K2HPO41.0g，CaCl20.2g，MgSO4·7H2O 0.48g，KH2PO41.0g，NaHCO310.0g，NaCl 2.0g。
上述改良BS培养基配制方法为称取大豆蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、胰酶解酪沅、牛肉膏、可溶性淀粉放入烧杯中，加入配制总量100～200的纯化水，用药勺搅匀，置于电炉上加热，边加热边搅拌至溶解，把烧杯从电炉上取下，称取L-半胱氨酸盐酸盐，趁热加入烧杯中，搅拌至溶解。加入西红柿液、牛肝浸出液、复合盐溶液、吐温80混合。加纯化水定容至所需总体积1000ml。将pH调至7.0-7.2，高压蒸汽121℃灭菌20min。配置固体培养基时加入琼脂后在灭菌。
其中复合盐溶液的制备方法为将CaCl2和MgSO4·7H2O在3ml蒸馏水中混合溶解，加500ml水，一边搅拌一边缓慢加入其它盐类。搅拌至溶解，加入200ml蒸馏水，混合后储存于冰箱中。
2、双歧杆菌的发酵培养1)一级种子液的培养取上述已活化培养的斜面种子，将菌落洗脱，以无菌操作法加入改良BS液体培养基(培养基的成分与斜面相同)，40.0℃厌氧培养48小时，得到一级种子液。
2)二级种子液的培养将一级种子液，接入改良BS液体培养基，接种量1％(体积比)，培养温度38.0℃，厌氧培养48小时，即为二级种子液。
3)发酵增殖培养改良BS培养基经高压蒸汽121℃灭菌20min后，充入氮气并冷却至40℃后备用。将二级种子液，接入充入氮气并冷却的改良BS液体培养基，接种量15％(体积比)，发酵温度37±0.5℃，罐压为0.05MPa～0.08Mpa，厌氧发酵6小时发酵成熟。
3、双歧杆菌活菌制剂的制备1)收集菌体将步骤4得到发酵成熟后的发酵液通过管道导入离心机，在低温(2-10℃)的条件下，10℃，14000RPM连续流离心15-20分钟。收集离心筒中的泥状菌体。
2)添加保护剂制备双歧杆菌活菌制剂的保护剂的组成为含有质量百分含量为5.0％甘油；含有质量百分含量为6.0％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液；含有质量百分含量为5.0％药用聚乙二醇(PEG)的溶液；含有质量百分含量为10.0％脱脂奶粉的溶液；含有质量百分含量为15.0％海藻糖的溶液；含有质量百分含量为5.0％谷氨酸钠和质量百分含量为5.0％L-天冬氨酸的溶液；含有质量百分含量为5.0％维生素C钠(Vc-Na)的溶液；含有质量百分含量为5.0％鸟氨酸盐酸盐的溶液；将上述保护剂的各组分等体积混合，得到保护剂。
将收集的菌体，加入由上述保护剂均按照1.0×1010菌体的量加入，搅拌混匀后，得到菌体悬浮液。
上述保护剂配制完成后，放置于2-8℃冰柜中冷却，备用。
3)冷冻干燥将步骤2)得到的菌体悬浮液，过滤，将含菌体的滤液分装到冻干盘中，进行冷冻干燥。
冷冻干燥时，制品在搁板温度为20℃时入箱，并冻结至-40℃以下，保持4小时，干箱真空度达到20Pa时，开始第一阶段干燥，加热使温度升为30℃，干燥箱真空度控制在10-30Pa，进行升华干燥48小时。升华干燥结束后，开始第二阶段干燥，加热使温度升至50℃，至制品温度升至48℃以上，干燥箱真空度控制在10-30Pa，保温24小时。最后进入真空控制在10Pa以下，温度28℃，干燥24小时，得到青春型双歧杆菌CGMCC 1.2190活菌菌粉。
4)包装将步骤3)冷冻干燥后的双歧杆菌菌粉分装入铝膜袋中，进行抽真空包装。
二、双歧杆菌活菌制剂的稳定性检测将按照步骤一的方法制备青春型双歧杆菌CGMCC 1.2190(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)活菌菌粉三个批次制剂B-1、B-2、B-3，分别分成两份，放置于37℃或25℃留样箱，37℃放置的样品每个月取样检测一次活菌数和活菌指数，25℃放置的菌粉每三个月取样检测一次活菌数和活菌指数，与常规冻干保护剂作为敷料制备的菌粉作为对照。常规冻干保护剂作为敷料的青春型双歧杆菌CGMCC1.2190(三个批次制剂A-1、A-2、A-3)(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)活菌制剂。
按照实施例1的方法进行活菌数和活菌指数的检测；以《中国生物制品规程》2000版对双歧杆菌菌粉活菌数的规定(lg菌粉的活菌数应不低于1.0×109CFU)作为参照标准，符合这个规定即为有效。
25℃放置的菌粉制剂的活菌数和活菌指数的检测结果如表5所示，结果表明，步骤一的方法制备的活菌菌粉制剂，在室温24个月后仍有效，活菌数均在511CFU/g以上，而以常规冻干保护剂作为敷料制备的菌粉制剂，保藏12个月后菌剂就低于1.0×109CFU/g了，表明本发明的方法制备的活菌制剂在室温的条件下，比常规方法制备的活菌制剂具有更高的菌存活能力，有效期远比常规方法长。
37℃放置的菌粉制剂的活菌数和活菌指数的检测结果如表6所示，结果表明，应用本发明活菌制品，37℃放置4个月后仍高于1.0×109CFU/g，而以常规冻干保护剂作为敷料制备的菌粉，保藏2个月后活菌数就低于1.0×109CFU/g，表明步骤一的方法制备的活菌制剂在室内温度较高的情况下，有效期远比常规方法长。
表5本发明制备的菌粉与常规方法制备的菌粉25℃加速试验比较
(表中“—”表示菌粉活菌数低于1.0×106CFU/g)。
表6本发明制备的菌粉与常规方法制备的菌粉37℃加速试验比较
(表中“—”表示制品活菌数低于1.0×106CFU)。
权利要求
1.一种用于制备双歧杆菌活菌制剂的保护剂，由下述重量份的组分组成甘油0.01-5.0份；聚乙烯吡咯烷酮0.1-6.0份；聚乙二醇0.1-5.0份；脱脂奶粉1.0-10.0份；海藻糖0.5-15.0份；谷氨酸钠0.1-5.0份，L-天冬氨酸0.1-5.0份；维生素C钠0.1-5.0份；鸟氨酸盐酸盐0.1-5.0份。
2.根据权利要求1所述的保护剂，其特征在于所述双歧杆菌活菌制剂的保护剂，由下述重量份的组分组成甘油2.5份；聚乙烯吡咯烷酮3.0份；聚乙二醇3.0份；脱脂奶粉8.0份；海藻糖5.0份；谷氨酸钠0.5份，L-天冬氨酸0.5份；维生素C钠0.5份；鸟氨酸盐酸盐3.0份。
3.根据权利要求1或2所述的保护剂，其特征在于所述双歧杆菌活菌制剂的保护剂的各组分以溶液形式存在，所述甘油溶液为含有质量百分含量为0.01-5.0％甘油溶液；所述聚乙烯吡咯烷酮溶液为含有质量百分含量为0.1-6.0％聚乙烯吡咯烷酮溶液；所述聚乙二醇溶液为含有质量百分含量为0.1-5.0％聚乙二醇的溶液；所述脱脂奶粉溶液为含有质量百分含量为1.0-10.0％脱脂奶粉溶液；所述海藻糖溶液为含有质量百分含量为0.5％-15.0％海藻糖溶液；所述谷氨酸钠溶液或L-天冬氨酸溶液为含有质量百分含量为0.1％-5.0％谷氨酸钠和质量百分含量为0.1％-5.0％L-天冬氨酸的溶液；所述维生素C钠溶液为含有质量百分含量为0.1％-5.0％维生素C钠的溶液；所述鸟氨酸盐酸盐溶液为含有质量百分含量为0.1％-5.0％鸟氨酸盐酸盐的溶液。
4.根据权利要求3所述的保护剂，其特征在于所述甘油溶液为含有质量百分含量为2.5％甘油溶液；所述聚乙烯吡咯烷酮溶液为含有质量百分含量为3.0％聚乙烯吡咯烷酮溶液；所述聚乙二醇溶液为含有质量百分含量为3.0％聚乙二醇溶液；所述脱脂奶粉溶液为含有质量百分含量为8.0％脱脂奶粉溶液；所述海藻糖溶液为含有质量百分含量为5.0％海藻糖溶液；所述谷氨酸钠溶液或L-天冬氨酸溶液为含有质量百分含量为0.5％谷氨酸钠和质量百分含量为0.5％L-天冬氨酸的溶液；所述维生素C钠溶液为含有质量百分含量为0.5％维生素C钠的溶液；所述鸟氨酸盐酸盐溶液为含有质量百分含量为3.0％鸟氨酸盐酸盐溶液。
5.一种双歧杆菌活菌制剂，是在双歧杆菌菌体中加入权利要求1-4中任一所述的保护剂后，经冷冻干燥后得到的。
6.根据权利要求5所述的双歧杆菌活菌制剂，其特征在于所述保护剂按照1.0×108-1.0×1012cfu/L菌体的量加入所述双歧杆菌菌体中并混合均匀。
7.根据权利要求6所述的双歧杆菌活菌制剂，其特征在于所述冷冻干燥是将添加了保护剂套剂后的双歧杆菌菌体冻结后，依次进行下述三个步骤的进行干燥1)在-20-30℃，真空度为10-30Pa，升华干燥4-48小时；2)加热使双歧杆菌菌体温度为-10℃-50℃，真空度为10-30Pa，干燥2-24小时；3)在真空为10Pa以下，温度为26-29℃，干燥2-24小时。
8.根据权利要求7所述的双歧杆菌活菌制剂，其特征在于所述冷冻干燥的步骤1)中的干燥温度为-5℃，干燥时间为12小时；步骤2)中的干燥温度为26℃-28℃，干燥时间为4小时；步骤3)中的干燥温度为28℃，干燥时间为4小时。
9.根据权利要求8所述的双歧杆菌活菌制剂，其特征在于所述双歧杆菌菌体是用改良BS培养基或改良TPY培养基在温度33-40℃，压力为0.05MPa～0.08MPa，厌氧发酵双歧杆菌菌株6-24小时后，收集菌体得到的；所述改良BS培养基是由下述组分制成西红柿汁200ml，大豆蛋白胨15g，酵母提取物6g，葡萄糖10g，吐温80 1g，胰蛋白胨10g，牛肉膏0.3g，可溶性淀粉0.5g，牛肝浸出液5ml，复合盐溶液4.0ml，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，琼脂15g；所述复合盐溶液为含有K2HPO41.0g，CaCl20.2g，MgSO4·7H2O 0.48g，KH2PO41.0g，NaHCO310.0g，NaCl 2.0g的溶液；所述改良TPY培养基是由下述组分制成胰蛋白胨12g/L，示胨3g/L，大豆蛋白胨5g/L，葡萄糖5g/L，麦芽低聚糖5g/L，酵母浸出粉5g/L，吐温-801.0g/L，L-半胱氨酸盐酸0.5g/L，牛肝浸液200mL/L，西红柿汁100mL/L，混合盐溶液5mL/L，蒸馏水675mL/L，维生素B1 10mg/L，维生素B6 10mg/L，维生素B12 0.1mg/L；所述混合盐溶液为1L中含有K2HPO420.0g，MgCl2·6H2O 5.0g，ZnSO4·7H2O 2.5g，CaCl21.5g，FeCl30.5g。
10.根据权利要求9所述的双歧杆菌活菌制剂，其特征在于所述双歧杆菌菌株的发酵温度为37℃。
全文摘要
本发明公开了一种双歧杆菌活菌制剂的制备方法及其专用保护剂。该保护剂，由下述重量份的组分组成甘油0.01－5.0份；聚乙烯吡咯烷酮0.1－6.0份；聚乙二醇0.1－5.0份；脱脂奶粉1.0－10.0份；海藻糖0.5－15.0份；谷氨酸钠0.1－5.0份，L－天冬氨酸0.1－5.0份；维生素C钠0.1－5.0份；鸟氨酸盐酸盐0.1－5.0份。本发明的方法，解决了常规方法生产的双歧杆菌制品常温保存困难的问题。
文档编号C12N1/20GK101016527SQ200710006529
公开日2007年8月15日 申请日期2007年2月2日 优先权日2007年2月2日
发明者苏日佳, 胡振湘, 徐乐意, 王云华, 王燕清 申请人:丽珠医药集团股份有限公司