专利名称：酶法水解制备晶体叶黄素的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶法水解制备晶体叶黄素，特别是一种酶法水解万寿 菊花叶黄素酯制备晶体叶黃素。
技术背景我国种植用于生产叶黄素的万寿菊达30万亩，年生产千花约5万吨， 制备成含量12-18%的叶黄素酯约5千吨，多以这种半成品出口，再于国外 加工成晶体叶黄素出售。叶黄素是类胡萝卜素类的一种，在水果、蔬菜中广泛存在，但含量甚 少。叶黄素主要存在于人眼视网膜的视黄斑区，起着向视神经传递光能和 抗光氧化的作用，叶黃素缺乏引起视黄斑退化，视力减弱直至失明。目前 国际上己将其加入到复合维生素中，1995年美国FDA已列为食品添加剂。 近年来，还发现它有利于皮肤健康，在降低乳腺癌和结肠癌发病率、预防 心血管疾病等方面有广泛应用。它也是禽类和鱼类饲料中着色的添加剂。自万寿菊花制备的叶黄素酯每分子中含有两分子脂肪酸，在生产上从 叶黄素酯除去脂肪酸制备叶黄素多采用化学皂化法，即在溶剂存在下加入 碱液，皂化后析出叶黄素结晶，用水或乙醇水溶液洗去脂肪酸，叶黄素被 纯化，脂溶性的叶黄素微胶囊化，成水溶性产物，即美国Kemin公司的主 要制备方法。这一方法的优点是容易获得高纯度的叶黄素，但废液中和后 含有大量的盐污染环境。进入21世纪，许多人，包括我国科学家都在考虑用酯酶水解叶黄素 酯产生叶黄素。在许多微生物中，包括酵母、细菌、和霉菌都可分泌出胞 外酯酶，仅Sigma试剂名录中酯酶就有来自不同物种的19种酯酶之多， 目前己报道利用购卖的假丝酵母(Candidasp。)酯酶，以胆汁酸(cholic acid) 为乳化剂，水解叶黄素酯可获得含量80%的叶黄素。但还很少有人从生产角度用酶法制备叶黄素。参考文献有J 。 AO AC (Association of Official Analytical Chemists) 53: 181(1970)J。 AOAC (Association of Official Analytical Chemists)56: 748(1973) J。 AOAC (Associationof Official Analytical Chemists) 57: 511(1974)发明内容本发明的目的是提供一种酶法水解制备晶体叶黄素，所采用的酯酶来自食用蕈菌可避免非食用微生物所产生的有害物质造成食用产品污染;乳化剂使用医学上己获得安全证明的、用于医学的微胶囊材、膜剂和涂膜剂 的聚乙烯醇(polyvinyl alcohol),废液回收做成饲料添加剂的无污染产品。为达到上述目的，本发明采用以下步骤(1) 、食用葷菌菌丝液体培养，该培养液内含用聚乙烯醇溶液乳化的叶黄 素酯诱导液的马玲薯一葡萄糖培养基,离心分离酯酶，滤液为酯酶粗提液；(2) 、叶黄素酯溶液中，加入聚乙烯醇溶液和(1)中的酯酶提取液，进 行酶促水解，水解的温度为2(TC—50°C;(3) 、叶黄素纯化；(4) 、真空干燥法脱水干燥叶黄素。 所述的食用蕈菌菌丝为黄白侧耳孢子经液体培养得到的黄白侧耳菌丝。所述的进行酶促水解时，叶黃素酯粗提液用量与酯酶提取液用量及聚 乙烯醇溶液用量体积比为1:2:3。所述的纯化采用冷水(1(TC—4CTC)、热水(5(TC—8(TC)洗涤，以除去 酶、聚乙烯醇，其它水溶性物质以及脂肪酸。纯化叶黄素时，用正己烷和/或其它烷烃(丁烷、石油醚等)洗涤除去未 水解的叶黄素酯和其它酯溶性化合物。在水解叶黄素酯时加入抗坏血酸或其它还原剂(维生素E)防止叶黃素 被氧化的方法。所述的聚乙烯醇包括PVA05 —88， PVA17 —88, PVA—124等。 本发明的优点l.本发明使用了食用蕈菌菌丝的酯酶对叶黄素酯进行水解，可不用纯 化酯酶，也不会有任何有害人体物质掺入，对人是安全的；2.使用己作为 药用辅料的聚乙烯醇为乳化剂，保证了安全性，又降低了生产成本；3.用酶解取代强碱皂化的化学法，而用温和的生物酶法，有利于生产的安全性，也防止对环境的污染；4.减少了有机溶剂(如丙二醇或乙醇)的使用量；5.也可用于有机溶剂提取其它不含羟基的类胡萝卜素类纯化，水解了甘油酯和其它酯类，从而提高了产品类胡萝卜素类的含量。
具体实施方式
1. 液体培养黄白侧耳(Pleurotuscomucopiae)(俗称小平菇，市场有售)(1)培养基制备100g马铃薯块在8(TC的500ml水中浸泡1小时， 纱布过滤，滤液加入5g葡萄糖，再加入10ml叶黄素酯乳化液(依(2)计 算，每毫升乳化液含纯的叶黄素酯45mg)， pH7.0，灭菌后使用。(2)乳化液配方4.5%聚乙烯醇叶黄素酯乳化液3g聚乙烯醇，加蒸 馏水150ml，加热溶解，制成2%聚乙烯醇溶液。向150ml聚乙烯醇溶液 中加入50ml自万寿菊干花中提取的18%叶黄素酯提取物，8000rpm高速 匀浆成乳化液。(3)菌丝体培养斜面培养的黃白侧耳接种在己灭菌的马铃薯液体培养 基中， 液体培养基接种后，在3(TC 200rpm下振荡培养，诱导产生酯 酶(E.C.3丄1.3〗。由于酯酶水解叶黄素酯后，产生脂肪酸，pH下降，在菌丝 液体培养12小时后，每隔一定时间，取一定量的培养液离心的上清液用 0.05N氢氧化钠溶液滴定，以1滴1%酚酞为指示剂，滴定培养液，当氢氧 化钠溶液用量最多时终止培养，这时酯酶含量最高。终止培养后，菌丝液 离心过滤，滤液即酯酶粗提液，用于酶解叶黄素酯。2. 叶黄素酯的酶促水解将万寿菊干花中提取的叶黄素酯加热至60-7(TC溶化，如1. (2)的方 法使聚乙烯醇乳化，400ml乳化液加入100ml酯酶粗提液，在50rpm下、 4(TC预温水解。由于酯酶是不稳定的酶，在预温4小时后再加入100ml酯 酶粗提液，继续预温，在酶解率达到90%以上时终止反应。由于聚乙烯醇 和水解后脂肪酸都起乳化剂作用，乳化效果始终是很好的。3. 酶解率的测定叶黄素酯溶于正己烷中，但叶黄素不溶于正己烷， 一定量的酶解反 应的起始混合液用正己烷提取，在474nm测定OD值，以此OD值定为叶 黄素酯100%未水解的值，当隨着水解时间延长，正己烷提取液的OD值 逐渐下降，与初始OD值比较，即可计算出酶解率。如取起始水解液0.3ml， 加入lml正己烷，充分混勻，静置分层后上层用正己烷稀释一定倍数后， 在474nm比色，测定OD值为A1(0D值X稀释倍数)，在水解6-8小时后 再取样测定OD值为(A2 Ax)，以Al值为100%，用(1-A2/A1) X100% 公式计算水解率。4. 叶黄素的纯化当水解率达90。/。以上时终止水解，加入5-10倍水，在40'C离心脱水过 滤，以去除水溶性物质，如酶、聚乙烯醇和部分脂肪酸；收集的叶黄素晶 体用70-78'C水洗，以除去大量脂肪酸和水溶性物质；再用乙醇洗涤，除 去醇溶性物质並除菌；最后再用正己垸洗涤，除去未被水解的叶黄素酯。 真空干燥后，纯化的叶黄素含量达80-85%。 5.叶黃素含量测定采用AOAC(Association of Official Analytical Chemists)的方法在美 国Beckman DU640分光光度计上、以重结晶苏丹红I为标样，在474nm 进行测定叶黄素含量。本方法的原理是在474nm下，浓度为2.38mg/ml 的叶黄素与在丙酮异丙醇(l: l)溶剂中5mM苏丹I 0.4ml定容在50ml 丙嗣异丙醇(l: l)溶液中，在量程1cm的比色杯中OD值相等，值为0.561 ，按如下公式计算叶黄素含量叶黄素％ = ^乂11. 9)/(MXf) X100%其中，M为叶黄素总量； f=0.561; A二474nm的0D值实施例1.取金蛊菊(Calendula officinalis)、万寿菊(Tagetes erecta)或百曰草 (Zinnia elegans)等菊科植物的花辨100克8000rpm匀浆后，加入400ml 95%乙醇提取叶黄素酯，取滤液。沉淀再用400ml 95%乙醇提取，取滤液合 并，将200ml正己烷加到滤液中，再加入100ml水，搅拌混合后静置分层， 取正己垸部分，在70'C减压浓縮,回收正己垸，剩余约l克油状物为叶黄 素酯粗提液。取3ml 2%聚乙烯醇溶液与1克叶黄素酯粗提液混合，高速匀浆后加 入lml黄白侧耳的酯酶提取液，在40。C、 50rpm振荡下酶促水解，在预温 4小时后再加入1ml酶液，当由于产生脂肪酸而使pH下降时，不断滴加 40%氧氧化钾溶液，使pH保持在6左右。6小时后每隔30分钟取出0.3ml 加入lml正己垸，在1.5ml离心管中振荡后2000rpm下离心，上层正己垸 层用正己烷稀释，在474mn比色测定0D值，以反应开始时用同样方法取 样比色的总0D值为100%比较，计算酶解率。在酶解率达到90%以上时终 止反应。加入10倍40'C纯净水，混匀后在1000目滤器上过滤，收集叶黄素晶 体。用75'C纯净水洗涤叶黄素晶体，再分别用5ral 95%乙醇和正己垸洗涤。TC下真空干燥。干燥的叶黄素晶体含量在80%以 上。实施例2.将500ml己灭菌的黄白侧耳培养液(内含用聚乙烯醇溶液乳化的叶黄 素酯诱导物的马铃薯-葡萄糖培养液)接入试管培养的黄白侧耳孢子，在30 。C、200rpm下振荡培养菌丝，在12小时后每小时取出2ml培养液，2000rpm 离心后上清液用水定容10ml，用0.05N氢氧化钠溶液滴定，记录氢氧化钠 溶液用量。在用量达到最大时，即水解叶黄素酯的酯酶含量最高，这时终 止培养，在2000rpm下离心培养液，收集上清液即为酯酶溶液，用于辣椒 红素酯酶解。用正己垸自干辣椒果实萃取的100g 12。/。的辣椒红素酯在60-7(TC溶 解后，与300ml 2%聚乙烯醇溶液混合，在8000rpm匀浆器中乳化，加入 100ml酯酶酶液，在4(TC、 50rpm的搅拌下酶促水解，在预温4小时后再 加入100ml酶液，当由于产生脂肪酸而使pH下降时，不断加入40%氢氧化 钾溶液，使pH保持在6左右。8小时后每隔30分钟取出0. 3ml加入lml 正己烷，在1.5ml离心管中振荡后2000rpm下离心，用上层正己烷层用正 己垸稀释，在474nm比色测定OD值，以反应开始时用同样方法取样比色 的总OD值为100%比较，计算酶解率。在酶解率达到90%以上时终止反应。加入10倍4(TC纯净水，混匀后在1400rpm脱水机上过滤，收集辣椒红 素晶体。用75'C纯净水洗辣椒红素晶体，再分别用50ml 95%乙醇和正己垸 洗涤。洗涤后的辣椒红素晶体在4(TC下真空干燥。干燥的辣椒红素晶体含 量在80%以上。 实施例3.将500ml己灭菌的黄白侧耳培养液(内含用聚乙烯醇溶液乳化的叶黄 素酯诱导物的马玲薯-葡萄糖培养液)接入试管培养的黄白侧耳孢子(也可 使用P. ostreatus、P. citrinopileatus或P. sapidus等菌种)，在30。C、200rpm 下振荡培养菌丝，在12小时后每小时取出2ml培养液，2000rpm离心后上 清液用水定容10ml,用0. 05N氫氧化钠溶液滴定，记录氢氧化钠溶液用量。 在用量达到最大时，即水解叶黄素酯的酯酶含量最高，这时终止培养，在 2000rpm下离心培养液，收集上清液即为酯酶溶液，用于叶黄素酯酶解。用正己烷自万寿菊干花颗粒萃取的100g的18%的叶黄素酯在60-70。C溶解后，与300ml 2%聚乙烯醇溶液混合，在8000rpm匀浆器中乳化,加入 100ml酯酶酶液，在4(TC、 50rpm的搅拌下酶促水解，在预温4小时后再 加入100ml酶液，当由于产生脂肪酸而使pH下降时，不断加入40%氧氧化 钾溶液，使pH保持在6左右。8小时后每隔30分钟取出0. 3ml加入lml 正己垸，在1.5ml离心管中振荡后2000rpm下离心，用上层正己垸层用正 己垸稀释，在474nm比色测定OD值，以反应开始时用同样方法取样比色 的总OD值为100%比较，计算酶解率。在酶解率达到90%以上时终止反应。加入10倍40。C纯净水，混勻后在1400rpm脱水机上过滤，收集叶黄 素晶体。用75。C纯净水洗涤叶黄素晶体，再分别用50ml 95%乙醇和正己 垸洗涤。洗涤后的叶黄素晶体在4(TC下真空干燥。干燥的叶黄素晶体含量 在80%以上。
权利要求
1. 一种酶法水解制备晶体叶黄素，其特征在于它包括以下几个步骤(1)、食用蕈菌菌丝液体培养，该培养液内含用聚乙烯醇溶液乳化的叶黄素酯诱导液的马玲薯-葡萄糖培养基，离心分离酯酶，滤液为酯酶粗提液；(2)、叶黄素酯溶液中，加入聚乙烯醇溶液和(1)中的酯酶提取液，进行酶促水解，水解的温度为20℃-50℃；(3)、叶黄素纯化；(4)、真空干燥法脱水干燥叶黄素。
2、 根据权利要求1所述的一种酶法水解制备晶体叶黄素，其特征在于所述的食用蕈菌菌丝为黄白侧耳孢子经液体培养得到的黄白侧耳菌 丝，经液体培养产生酯酶。
3、 根据权利要求1或2所述的一种酶法水解制备晶体叶黄素，其特征在于所述的进行酶促水解时，叶黃素酯粗提液用量与酯酶提取液用量 及聚乙烯醇溶液用量的体积比为1:2:3。
4、 根据权利要求1或2所述的一种酶法水解制备晶体叶黄素，其特 征在于所述的纯化采用冷水、热水洗涤，冷水温度在1(TC一4(TC，热水 温度在50。C一8(TC，以除去酶、聚乙烯醇、其它水溶性物质以及脂肪酸。
5、 根据权利要求3所述的一种酶法水解制备晶体叶黄素，其特征在 于所述的纯化采用冷水、热水洗涤，冷水温度在1CTC—4(TC，热水温度 在5(TC—8(TC，以除去酶、聚乙烯醇、其它水溶性物质以及脂肪酸。
6、 根据权利要求1或2所述的一种酶法水解制备晶体叶黄素，其特 征在于纯化叶黄素时，用正己烷或丁烷或石油醚或它们的混合物，洗涤 除去未水解的叶黄素酯和其它酯溶性化合物。
7、 根据权利要求1或2所述的一种酶法水解制备晶体叶黄素，其特 征在于在水解叶黄素酯时加入抗坏血酸或维生素E，以防止叶黄素被氧 化的方法。
8、 根据权利要求3所述的一种酶法水解制备晶体叶黄素，其特征在 于在水解叶黄素酯时加入抗坏血酸或维生素E，以防止叶黃素被氧化的 方法。
9、 根据权利要求6所述的一种酶法水解制备晶体叶黄素，其特征在于在水解叶黄素酯时加入抗坏血酸或维生素E，以防止叶黃素被氧化的 方法。
全文摘要
一种酶法水解制备晶体叶黄素，以下几个步骤(1)食用蕈菌菌丝液体培养，该培养液内含用聚乙烯醇溶液乳化的叶黄素酯诱导液的马玲薯-葡萄糖培养基，离心分离酯酶，滤液为酯酶粗提液；(2)叶黄素酯溶液中，加入聚乙烯醇溶液和(1)中的酯酶提取液，进行酶促水解，水解的温度为20℃-50℃；(3)叶黄素纯化；(4)真空干燥法脱水干燥叶黄素。本发明优点是使用了食用蕈菌菌丝的酯酶对叶黄素酯进行水解，可不用纯化酯酶，也不会有任何有害人体物质掺入，对人是安全的；聚乙烯醇为乳化剂，保证了安全性，又降低了生产成本；用酶解取代强碱皂化的化学法，而用温和的生物酶法，有利于生产的安全性，也防止对环境的污染。
文档编号C12R1/645GK101235409SQ200710063188
公开日2008年8月6日 申请日期2007年1月30日 优先权日2007年1月30日
发明者吴光耀, 朱梅玲 申请人:北京禹光生物科学研究中心有限公司