专利名称：用于水果保鲜和大棚蔬菜生产的枯草芽孢杆菌菌剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于水果保鲜和大棚蔬菜生产的枯草芽孢杆菌菌剂，属 于微生物应用技术领域。
技术背景引起水果腐烂、变质和大棚蔬菜病害的病原菌多为病原真菌。半个多世 纪以来，化学杀菌剂在水果保鲜和大棚蔬菜生产领域里起了十分重要的作用。 但是，随着化学杀菌剂的长期和大量使用带来的农药残留、环境污染、病原 真菌抗药性等问题的出现，化学杀菌剂的安全性引起了社会的普遍关注，开 发生物杀菌剂越来越受到人们的重视。特别是寻找那些对人畜安全，无毒害， 不污染环境等优点的生物杀菌剂已成为研究热点。目前研究证实具有较好开 发前景的微生物包括芽孢杆菌、木霉、放线菌等，其中以枯草芽孢杆菌的 研究开发最为活跃，在微生物杀菌剂市场中备受瞩目。枯草芽孢杆菌是一种 在自然界广泛存在的微生物，革兰氏阳性，产生耐热、抗逆的芽孢，在芽孢 形成初期分泌各种抗菌物质，对病原真菌有特异性的防治作用，具有显著的 生防潜力。枯草芽孢杆菌具生长快、营养简单，有利于生防菌剂的生产、剂 型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖，而且批量生产工艺简单，成本也较 低，施用方便，储存期长，是一种理想的生防微生物。尽管很多枯草芽孢杆 菌生防制剂已被证实具有防治作用，但仅有少数几种应用于生产，大部分仍 处于研究和探索阶段。 发明内容本发明的目的在于提供一种用于水果保鲜和大棚蔬菜生产的枯草芽孢杆 菌菌剂，替代目前使用的化学保鲜剂和杀菌剂，可延长水果的保鲜期并有 利于绿色无公害蔬菜的生产。本发明的目的还在于提供一种用于水果保鲜和大棚蔬菜生产的枯草芽孢 杆菌菌剂的制备方法。 实现本发明的目的采取的技术方案是这样的本发明人从田间玉米病叶 片上分离到一株对玉米小斑病菌C小种有拮抗作用的细菌。采用平板对峙法 测定了该菌株对致病真菌的拮抗作用，所测的病原真菌，包括玉米小斑病菌(鄉oAH7's臓W's)、水稻稻瘟病菌(她g"tf/w//^ y'sea)、 小麦赤霉病菌 (F附肌'"附 g"fl柳i'"eariim)、 棉花枯萎病菌 (FMSfli7'nm g，jw"附 f.sp.l^wiVi/"/"/w)、辣椒炭疽病菌(CW/eto/Wc/i"附c"/w/c/)、辣椒疫霉病菌 鄉/rom c"戸W)、黄瓜炭疽病菌(CW/"WWc/jm附/c^"a""附)、大蒜菌 核病菌(^^/^//"|7| ////)、棉花黄萎病菌(KeWd"/mw r/fl似/fle)、烟草赤星病菌 G^mmn' 曲mmto)等。结果表明，该菌株对上述病原真菌均有一定的抑 制作用，说明其具有广谱抗病原真菌特性。通过菌体革兰氏染色、菌落形态 特征的观察、生理生化测试及16S rDNA序列分析结果，菌株CGMCC No.1982符合枯草芽孢杆菌特征，因此将其鉴定为枯草芽孢杆菌(5""7/附 i6ft7&)。采用紫外线和氯化锂对菌株CGMCC No.1982进行复合诱变处理， 获得了遗传性状稳定的诱变菌株，其对致病真菌玉米小斑病菌的拮抗活性比 出发菌株提高了 66.2%。该菌株可分泌蛋白性质的拮抗物质，拮抗物质可使 玉米小斑病菌孢子不萌发或萌发异常；菌丝畸形，顶端及中部膨大、扭曲， 细胞质分布不均匀。菌株的大白鼠急性毒性实验表明，菌株微毒性，符合生 物制剂要求。本发明所说的用于水果保鲜和大棚蔬菜生产的枯草芽孢杆菌菌剂的有效 成分为枯草芽孢杆菌CGMCC No.1982湿菌体，所说的菌剂剂型可以是干粉、 水悬浮剂、可湿粉剂、泡腾颗粒或片剂的单剂，其中芽孢含量为200亿 500 亿/克。用于水果保鲜和大棚蔬菜生产的枯草芽孢杆菌干粉菌剂含有碳酸钙成 分，湿菌体与碳酸钙的质量比为l: 1，干粉菌剂中活芽孢数为(2.109±0.366 5.12士0.135)xl0" cfu/g。用于水果保鲜和大棚蔬菜生产的枯草芽孢杆菌水悬浮剂各组分的质量百 分比为湿菌体 0.1% Tersperse 2500 1%-10% 1%-5%0.1%-2%0.2o/o-2%黄原胶 可溶性甲壳质 苯甲酸钠 水pH 4画7 。用于水果保鲜和大棚蔬菜生产的枯草芽孢杆菌可湿粉剂各组分的质量百 分比为一 " 1%0.1o/o-10o/o1%-5% 0.1%-10% 0.1%-20/0湿菌体十二烷基苯磺酸钠 黄原胶 木素磺酸钠 硬脂酸钠 绢云母粉 pH4-，用于水果保鲜和大棚蔬菜生产的枯草芽孢杆菌泡腾颗粒或片剂的单剂各 组分的质量百分比为湿菌体十二烷基磺酸钠柠檬酸PEG4000可溶性淀粉 轻质碳酸钙1%0.2%-10% 20/o-15% 1%画15% 5%-20%本发明用于水果保鲜和大棚蔬菜生产的枯草芽孢杆菌菌剂湿菌体的制备 方法包括以下步骤(1) 菌种活化采用培养基含胰蛋白胨，大豆蛋白胨，NaCl ,水。 将保存的甘油菌种接到活化培养基固体斜面后，34'C培养48h。(2) 种子培养采用培养基含酵母膏，葡萄糖，CaC03，水。 将活化的斜面菌种用无菌水冲洗，制成菌悬液，按下列条件接到种子培养基中培养，培养温度35'C，摇瓶装量12%,接种量3%，初始pH值7.2。(3) 菌株补料分批发酵工艺 发酵培养基含葡萄糖，酵母膏，CaC03。 流加培养基含葡萄糖，酵母膏，制成混合液一起流加；流加时间发酵8h后开始；发酵时间34±2 h;选用食用豆油作为消泡剂。发酵液芽孢浓度(3.41±0.151) xio9cfu/mL。(4) 湿菌体的制备发酵得到的发酵液离心，弃上清，菌体加入无菌水悬浮混匀，再离心， 弃上清得湿菌体。本发明取得的积极效果是该菌剂对人畜无危害、无污染；该菌剂具广 谱抗病原真菌活性，对水稻、玉米等主要农作物病害的病原菌均表现较好抗 行；经水悬浮剂处理后的鲜桃、葡萄等水果烂果率明显降低，贮存期明显延 长；发芽黄瓜种子采用干粉菌剂拌种处理后，幼苗的抗病性明显增强；番茄 幼苗喷洒水悬浮剂后，抗灰霉病的能力明显增强，可广泛用于大棚黄瓜、番 茄等蔬菜的生产，有利于绿色、无公害蔬菜的生产。本发明提供的枯草芽孢 杆菌粉剂，芽孢含量明显高于市场上现有的产品，而且其制备工艺简单，适 合工业化生产。该菌株于2007年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.1982。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明。 实施例1枯草芽孢杆菌CGMCC No.1982的发酵工艺(1) 菌种活化TSA培养基胰蛋白胨15 g，大豆蛋白胨5g， NaCl 5g， 水1000 mL;将保存的甘油菌种接种到TSA固体斜面培养基后，34'C培养48 h;(2) 种子培养将活化的斜面菌种用无菌水冲洗，制成菌悬液，接种到 装有40mLTSA液体培养基的三角瓶中，接种量1%。 160r/min， 34。C振荡培 养20h;(3) 发酵培养 发酵培养基葡萄糖1%，酵母膏1%， CaC03l%， pH7.5; 流加培养基葡萄糖1.5%，酵母膏0.5%，葡萄糖和酵母膏制成混合液 800mL;将种子液以3%的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养，采用20L 搅拌式发酵罐进行补料分批发酵，装量为12 L，发酵过程中通过流加Na2C03 调节pH值，选用食用豆油作为消泡剂，从8.5 h后开始流加葡萄糖和酵母膏 的混合液，发酵时间为36土2h;发酵完成活菌数达1.5xl09cfu/mL,芽孢数达1.29xl09cfu/mL。 (4)湿菌体的制备将用发酵罐发酵培养所得的发酵液12000 r/min离心20min，弃上清，菌 体加入无菌水悬浮混匀，再12000 r/min离心15 min,弃上清得湿菌体。 实施例2水悬浮剂对鲜桃果实灰霉病的防治 (1)水悬浮剂的制备分别称取湿菌体lg，分散剂Tersperse2500 2g,黄原胶3g，可溶性甲壳 质0.5g,苯甲酸钠0.2g，加无菌水至1000 mL，搅拌混匀后检测芽孢数为2 X109。做下列实验时，稀释10倍。(2) 病菌孢子悬液的制备将长满桃灰霉的PDA平板中加入含0.01%吐温-80的无菌水，将孢子洗 下，经四层纱布过滤得孢子悬液，血球计数板计数，孢子浓度为lxl04 cfu/mL。(3) 剌伤接种选择健壮、无机械损伤、新鲜、大小一致的桃子，先用2 的NaClO消 毒，然后用无菌水冲洗干净，晾干后在每个桃子上用灭菌的接种针刺一个大 小为5x3mm，深度为3 mm的孔，孔中加入水悬浮剂20 jiL, 2 h后，每孔 中再加入桃灰霉孢子20 nL。以刺伤后接种无菌水，2h后再接种桃灰霉孢子 处理为对照。每处理9个果，各三次重复。每9个果放入一个塑料筐中，25 'C 储藏。每天统计桃发病情况。发病率％=(发病水果数一该处理的总水果数)X100% 防效％=(对照发病率一处理发病率)/对照发病率><100%(4) 结果
接种病菌4 d后水悬浮剂仍能显著抑制病菌在刺伤处的蔓延生长；而清 水处理的对照，所有桃子在剌伤接种的部位已经长出一个较大的病斑，且随 时间的延长病斑直径继续增大。处理组6d后生防菌株的水悬浮剂仍能抑制病 菌生长，没有灰霉病斑长出。水悬浮剂能显著降低灰霉病发病率，病菌接种4 d后防效达90o/o以上，6d后的防效达到80V。。 实施例3水悬浮剂对小批量鲜桃贮藏保鲜效果试验(1) 水悬浮剂的制备 制备方法同实施例2。(2) 喷洒接种选择健壮、无机械损伤、新鲜、大小一致的桃子，分别喷洒水悬浮剂， 晾干后，单果用纸包裹放入纸箱中25'C储藏。每处理9个果实，三次重复。 以不做任何处理为对照。随时观察发病情况，待有一部分果实发病时，统计 发病情况，计算发病指数。(3) 病果分级标准0级无病斑 l级病斑直径H.0cm2级病斑直径1.1—2.0 cm 3级病斑直径2.1 — 3.0 cm 4级病斑直径3.1—4.0 cm 5级病斑直径^4.1 cm 病情指数-i:(各级腐烂数X该级代表数)/ (总数X最高级代表数) 防效％-(对照病情指数一处理病情指数)/对照病情指数X100V。(4) 结果水悬浮剂对桃储藏有明显的保鲜、防病效果。3 d后的防效为92.8%, 6 d 后防效为80.74%。实施列4水悬浮剂对葡萄保鲜效果试验试验实施方法同实施列3基本相同，只是材料换成葡萄果实(巨丰)。试 验结果显示，水悬浮剂对葡萄果实有明显的保鲜、防病效果。15 d后的防效 为94.6%， 20 d后防效为78.31%。实施例5干粉菌剂拌种对黄瓜苗期黄瓜炭疽病的防治效果 (1)干粉的制备称取湿菌体10g,称取等重量的CaC03。 CaC03缓慢加入湿菌体中，边
加边搅拌，直至均匀。真空干燥箱中50'C烘干30min至粉末状，得到干 粉菌剂，干粉菌剂芽孢数为2X1011。(2) 拌种处理黄瓜种子经清水浸泡24h后，28'C保湿催芽，待芽长出至0.4cm时与干 粉拌种，种子与干粉的比例为100: 1，以无水CaC03做对照。将拌种处理 种子和对照分别栽种到塑料大棚中。拌种处理和对照各200棵，中间留隔离 带成两个小区。待苗长出两片真叶时,喷洒黄瓜炭疽孢子悬液(lx104 cfu/mL), 每棵苗喷洒量lOmL。 7d后连续观察发病结果。(3) 黄瓜炭疽病调查分级标准 0级叶片无病斑1级病斑点占整个叶片面积的5%以下 3级病斑点占整个叶片面积的6%-10% 5级病斑点占整个叶片面积的11%-25% 7级病斑点占整个叶片面积的26%-50% 9级病斑点占整个叶片面积的50%以上病情指数-E (各级发病数X该级代表数)/ (总数X最高级代表数) 防效％=[(对照病情指数一处理病情指数)/对照病情指数X 100%(4) 结果统计结果表明对照组病情指数为93.21%，干粉拌种处理组病情指数为 21.37%。菌剂防病效果可达77.1%。 实施例6 水悬浮剂对番茄灰霉病害的防治效果(1) 水悬浮剂的制备 水悬浮剂的制备同实施例2。(2) 病菌孢子悬液的制备将长满番茄灰霉病菌的PDA平板中加入含0.01%吐温-80的无菌水，将 孢子洗下，经四层纱布过滤得孢子悬液，血球计数板计数，孢子浓度为lxl05 cfu/mL(3) 接种病原菌孢子塑料大棚中做畦，栽种番茄苗共200棵。用中间留隔离带分成两个小区。
待苗长到5叶期时， 一小区(100颗)喷水悬浮剂，每棵苗喷洒lOmL; 另一小区以清水代替。4d后两小区同时喷洒番茄灰霉病菌孢子悬液，每棵苗 约喷lOmL。 7天后观察发病结果。(4) 番茄灰霉病调查分级标准、病情指数和防效的计算参照实施例5中 的黄瓜炭疽病调査标准。(5) 结果统计结果表明对照组病情指数为95.32%,水悬浮剂处理组病情指数为 16.56%。水悬浮剂对番茄灰霉病防效果为82.6%。 实施例7枯草芽孢杆菌CGMCC No.1982可湿性粉剂的配制方法称取按实施例1获取的湿菌体5g，加入十二烷基苯磺酸钠20g，木素磺 酸钠20g,黄原胶25g，硬脂酸钠2g,绢云母粉428g。充分研磨粉碎可制得 可湿粉剂。芽孢含量为2-3X10" cfu/mL。实施例8枯草芽孢杆菌CGMCC No.1982泡腾剂(颗粒剂或片剂)制备方 法按下列配方分别称取各组分。湿菌体 1%十二烷基磺酸钠 0.2%-10%拧檬酸 2%-15%PEG4000 10/0-15%可溶性淀粉 5%-20%轻质碳酸钙 余量上述原料用搅拌机混匀后，用压片机压片或用挤压造粒机造粒，即可获 得枯草芽孢杆菌CGMCC No.1982泡腾剂(颗粒剂或片剂)。
权利要求
1、 一种用于水果保鲜和大棚蔬菜生产的枯草芽孢杆菌菌剂，其特征在于含有枯草芽孢杆菌CGMCC No.1982湿菌体。
2、 按权利要求1所述的用于水果保鲜和大棚蔬菜生产的枯草芽孢杆菌菌 剂，其特征在于它可以是干粉、水悬浮剂、可湿粉剂、泡腾颗粒或片剂的单 剂，其中芽孢含量为200亿 500亿/克。
3、 按权利要求2所述的用于水果保鲜和大棚蔬菜生产的枯草芽孢杆菌干 粉菌剂，其特征在于其组成为湿菌体与碳酸钙的质量比为1: 1，活芽孢数 为(2.109士0.366 5.12士0.135)xl011 cfu/g。
4、 按权利要求2所述的用于水果保鲜和大棚蔬菜生产的枯草芽孢杆菌水 悬浮剂，其特征在于组成中各组分的质量百分比为湿菌体Tersperse 2500黄原胶可溶性甲壳质苯甲酸钠水PH0.1%1%-10%1%-5%0.1%陽2%0.2%國2%4-
5、按权利要求2所述的用于水果保鲜和大棚蔬菜生产的枯草芽孢杆菌可 湿粉剂的，其特征在于组成中各组分质量百分比为湿菌体十二烷基苯磺!黄原胶木素磺酸钠硬脂酸钠绢云母粉pH嘲1%0.1%-10% 1%-5% 0.1%-100/0 0.1%-2%4國7 。
6、按权利要求2所述的用于水果保鲜和大棚蔬菜生产的枯草芽孢杆菌泡腾颗粒或片剂的单剂，其特征在于组成中各组分质量百分比为-湿菌体 1%十二烷基磺酸钠 0.2%-10%柠檬酸 2%-15%PEG4000 1%-15%可溶性淀粉 5%-20% 轻质碳酸钙 余量。
7、 如权利要求1所述的用于水果保鲜和大棚蔬菜生产的枯草芽孢杆菌菌 剂枯草芽孢杆菌CGMCC No.l982湿菌体的制备方法，其特征在于包括以下'(1)菌种活化采用培养基含胰蛋白胨，大豆蛋白胨，NaCl ,水7 将保存的甘油菌种接到活化培养基固体斜面后，34'C培养48h;(2) 种子培养采用培养基含酵母膏，葡萄糖，CaC03，水； 将活化的斜面菌种用无菌水冲洗，制成菌悬液，按下列条件接到种子培养基中培养，培养温度35。C,摇瓶装量12%，接种量3%，初始pH值7.2;(3) 菌株补料分批发酵工艺 发酵培养基含葡萄糖，酵母膏，CaC03; 流加培养基含葡萄糖，酵母膏，制成混合液一起流加；流加时间发酵8h后开始；发酵时间34±2 h;选用食用豆油作为消泡剂；发酵液芽孢浓度(3.41±0.151) xl09cfu/mL;(4) 菌体的制备发酵得到的发酵液离心弃上清，菌体加入无菌水悬浮混匀，再离心，弃 上清得菌体；
8、 一种如权利要求3-6之任一所述菌剂的应用，其特征在于将所述菌剂 用于水果保鲜和大棚蔬菜生产。
全文摘要
本发明公开了一种含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCCNo.1982菌株的用于水果保鲜和大棚蔬菜生产的菌剂。经鉴定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.1982属于典型的枯草芽孢杆菌，与其它枯草芽孢杆菌相比其具有广谱抗病原真菌活性，其发酵液和芽孢对鲜桃、葡萄等水果保鲜效果较好；用于黄瓜、番茄等大棚蔬菜的生产抗病效果较好。本发明的菌剂其剂型有干粉、水悬浮剂、可湿粉剂、泡腾颗粒、片剂的单剂，芽孢含量为200亿-500亿/克。本发明的菌剂用于水果保鲜无毒、无污染，用于大棚蔬菜等生产，产品为绿色无公害产品，可替代目前使用的化学保鲜剂和杀菌剂，对环境无任何影响，制备方法简单，成本低，具有良好的生态效益和社会效益。
文档编号C12R1/125GK101121923SQ20071006250
公开日2008年2月13日 申请日期2007年8月2日 优先权日2007年8月2日
发明者兵 彭, 成丽霞, 李小俊, 王立安, 宇 贾 申请人:河北师范大学