含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的细胞生长抑制剂的制作方法

专利名称：含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的细胞生长抑制剂的制作方法
含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的细胞生长抑制剂本申请为国际申请PCT/JP2002/006237于2003年12月22日进入 中国国家阶段、申请号为02812570.3、发明名称为"含有抗磷脂酰肌 醇蛋白聚糖3抗体的细胞生长抑制剂"的分案申请。发明领域本发明涉及含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作为活性成分的细 胞生长抑制剂。发明背景磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族一直被报道为细胞表面上存在的硫酸乙 酰肝素蛋白聚糖的新家族。迄今，5种磷脂酰肌醇蛋白聚糖(磷脂酰肌 醇蛋白聚糖l、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、磷脂 酰肌醇蛋白聚糖4和磷脂酰肌醇蛋白聚糖5)已被报道成磷脂酰肌醇蛋 白聚糖家族的成员。这些家族成员具有大小一致的核心蛋白(约 60kDa)，享有特异和完全保守的半胱氨酸序列，并且通过糖基磷脂酰 肌醇(GPI)锚结合到细胞膜上。通过对在中枢神经系统发育中具有异常细胞分裂模式的果蝇 (Drosophila melanogaster)变体的基因进行筛选已鉴定了 Dally(分裂异 常延迟的)基因。已知Dally的cDNA代表一可读框(ORF)，所述ORF 编码其序列显示与含有所有磷脂酰肌醇蛋白聚糖特征的脊椎动物的跨 膜蛋白聚糖(GRIP)同源(24-26。/。的同源性)的产物。并且还已提示dally 基因在调节dpp(decapentaplegia)受体机制中发挥作用。这暗示哺乳动物 的磷脂酰肌醇蛋白聚糖可调节TGF和BMP之间的信号转导。具体而 言，已提示磷脂酰肌醇蛋白聚糖可起到一些肝素结合生长因子(例如 EGF、 PDGF、 BMP2和FGF)的共同受体的作用。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3已被分离为大鼠肠中发育调节下的转录物(Filmus, J.， Church， J.G.和Buick， R.n. (1988) Mol. Cell Biol. 8， 4243-4249)，然后鉴定成一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的GPI-连接的硫 酸乙酰肝素蛋白聚糖OCT-5，其核心蛋白的分子量为69kDa(Filmus， J.， Shi， W.， Wong， Z,M.和Wong, M丄(1995) Biochem. J. 311， 561-565)。同 样在人中，编码磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的基因已从人胃癌细胞系中被 分离为MXR-7(Hermann Lage等，Gene 188 (1997) 151-156)。已有报道， 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3与胰岛素样生长因子-2形成蛋白一蛋白复合体， 以便调节生长因子的作用(Pilia, G.等，(1996) Nat. Genet. 12， 241-247)。 此报道提出磷脂酰肌醇蛋白聚糖3不总是与含有硫酸乙酰肝素链的生 长因子相互作用。已有报道建议磷脂酰肌醇蛋白聚糖3可用作肝癌标记(Hey-Chi Hsu等，CANCER RESERCH 57， 5179-5184 (1997))。然而，没有发现 说明磷脂酰肌醇蛋白聚糖3和癌细胞增殖之间的明确关系。此外，也有提示磷脂酰肌醇蛋白聚糖可起到内皮抑素(endostatin) 受体的作用，所述内皮抑素可用作血管形成抑制剂(MolecularCell (2001), 7, 811-822)。但是，这种功能与细胞增殖之间的关系仍然未加以 阐述。如上所述，已说明了磷脂酰肌醇蛋白聚糖3参与细胞增殖。然而， 细胞增殖机制等是未知的，以及磷脂酰肌醇蛋白聚糖3对细胞增殖的 调节的应用从未尝试过。发明概述深入研究的结果发现，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体通过ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性)活性和CDC(补体依赖的细胞 毒性)活性而施加细胞增殖抑制活性，由此完成了本发明。此外，还预 测抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体也通过抑制生长因子的作用而施加细 胞增殖抑制活性。而且，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体也通过与诸如 放射性同位素、化疗剂或细菌衍生的毒素等的细胞毒性物质结合而施 加细胞增殖抑制活性。本发明的主题如下(1) 一种细胞生长抑制剂，其含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作 为活性成分；(2) (l)所述的细胞生长抑制剂，其中抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体 具有细胞毒性活性；(3) (2)所述的细胞生长抑制剂，其中细胞毒性活性为抗体依赖的细 胞介导的细胞毒性(ADCC)活性或补体依赖的细胞毒性(CDC)活性；(4) (1)-(3)中任一项所述的细胞生长抑制剂，其中细胞为癌细胞；(5) (4)所述的细胞生长抑制剂，其中细胞选自肝癌细胞、肺癌细胞、 结肠癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞 和胰腺癌细胞-，(6M5)所述的细胞生长抑制剂，其中细胞为肝癌细胞；(7) (1)-(6)中任一项所述的细胞生长抑制剂，其中抗体为单克隆抗体；(8) (1)-(6)中任一项所述的细胞生长抑制剂，其中抗体为人源化抗 体或嵌合抗体；(9) 一种抗体，.其磷脂酰肌醇蛋白聚糖3结合；(10) (9)所述的抗体，其具有细胞毒性活性；(11) (10)所述的抗体，其具有针对肝癌细胞的细胞毒性活性；以及(12) (ll)所述的抗体，其具有针对HuH-7肝癌细胞系的细胞毒性 活性。下文将详细说明本发明。本发明为一种含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗体作为活性成分的细 胞生长抑制剂。此外，本发明为一种含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗体 作为活性成分的细胞生长抑制剂，其可用于针对基于异常细胞增殖的 疾病的治疗，特别是针对癌症的治疗。本发明的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的例子包括已知抗体，例如人源化抗体、人抗体(W096/33735)、嵌合抗体(日本专利公布(Kokai) 号4-228089 A(1992))或小鼠抗体以及本发明中公开的抗体。另外，抗 体可以为多克隆抗体，并且优选单克隆抗体。本发明中所用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体可来自任何起源， 可属于任何类型(单克隆或多克隆抗体)以及可以是任何形式，只要其能 够抑制细胞增殖。1. 抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体本发明中所用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体可通过已知途径以 多克隆抗体或单克隆抗体的形式获得。本发明中所用的特别优选的抗 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为源自哺乳动物的单克隆抗体。源自哺乳 动物的单克隆抗体的例子包括由杂交瘤产生的抗体以及通过基因工程 技术利用含有抗体基因的表达载体转化的宿主所产生的抗体。该抗体 结合到磷脂酰肌醇蛋白聚糖3上以便抑制细胞增殖。这样一种抗体的例子为由本发明的杂交瘤克隆所产生的单克隆抗体。2. 产抗体的杂交瘤产单克隆抗体的杂交瘤可基本上利用如下已知的技术进行制备。 即，杂交瘤的制备方法如下根据标准免疫方法，利用磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作为免疫原进行免疫接种，通过标准细胞融合方法将上述获 得的免疫细胞与已知的亲本细胞融合，然后采用标准筛选方法对产单 克隆抗体的细胞进行筛选。具体而言，单克隆抗体可如下制备。如Lage， H.等所公开(Gene 188 (1997), 151-156)，通过表达磷脂酰 肌醇蛋白聚糖3(MXR7)基因(氨基酸序列)，首先获得准备用作免疫原诱 导抗体的人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3。具体而言，将编码磷脂酰肌醇蛋白 聚糖3的基因序列插入在一已知的表达载体系统中，转化适当的宿主 细胞，然后通过己知方法从宿主细胞或培养物上清液中纯化出靶人磷 脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白。 接着，该纯化的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白用作免疫原。或者， 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的部分肽可用作致敏抗原。这时，部分肽可以 从人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的氨基酸序列中通过化学合成获得。抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体与ADCC作用、CDC作用和生长因 子的活性一起抑制细胞增殖活性。此外，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗 体还可通过与诸如放射性同位素、化疗剂或源自细菌的毒素的细胞毒 性物质结合而抑制细胞增殖。因此，在本发明中，磷脂酰肌醇蛋白聚 糖3分子上的表位被抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体所识别，其不限于 特定的表位。抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体可识别任何表位，只要所 述表位存在于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上。因而，任何片段可用作 抗原来制备本发明的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，只要其在磷脂酰 肌醇蛋白聚糖3分子上含有所述表位。用免疫原进行免疫接种的哺乳动物不是特别受限，考虑到与准备 用于细胞融合的亲本细胞的相容性而优选加以选择。例如，通常使用 诸如小鼠、大鼠、仓鼠或兔子或猴子的啮齿类动物。根据已知方法，用免疫原对动物进行免疫接种。例如，将免疫原 腹膜内或皮下注射哺乳动物，采用这种常规方法进行免疫接种。具体 而言，将免疫原用适当体积的PBS(磷酸盐缓冲液)、生理盐水等稀释或 悬浮于其中；如果需要，把适当体积的诸如弗氏完全佐剂的标准佐剂 与产物混合；乳化；然后每4-21天，将溶液施用给哺乳动物若干次。 此外，适当的载体也可在免疫接种时与免疫原一起使用。如上所述对哺乳动物进行免疫接种，然后确认血清中所需抗体的 效价增加。随后，从哺乳动物中收集免疫细胞，并进行细胞融合。优 选的免疫细胞尤其为脾细胞。作为准备与上述免疫细胞相融合的配偶体细胞，使用哺乳动物的 骨髓瘤细胞。此处优选使用的骨髓瘤细胞的细胞系的例子包括各种已 知的细胞系，例如P3(P3x63Ag8.653)(J. Immuol. (1979) 123, 1548-1550)、 P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7)、 NS-l(Kohler. G.和Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519)、 MPC-1 l(Margulies. D.H.等，Cell (1976) 8， 405-415)、 SP2/0(Shulman, M.等，Nature (1978) 276, 269-270)、 FO(de St. Groth， S. F.等，J. Imimmol. Methods (1980) 35， 1-21)、 S194(Trowbridge， I. S. J. Exp. Med. (1978) 148， 313-323)和R210(Galfre， G.等，Nature (1979) 277, 131-133)。上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合可基本上按照已知方法， 例如Kohler和Milstein等(Kohler. G.和Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73， 3-46)的方法进行。更具体而言，上述细胞融合在含有例如细胞融合加速剂的标准营 养培养液中进行。作为细胞融合加速剂，例如，可使用聚乙二醇(PEG)、 日本血细胞凝集病毒(HVJ)等。如果需要，可加入佐剂，例如二甲亚砜，以进一步增强融合效率。对此处所用的免疫细胞与骨髓瘤细胞的任何比例可加以设定。例 如，免疫细胞数优选高出骨髓瘤细胞数i-io倍。作为准备用于上述细 胞融合的培养液，例如，可使用对上述骨髓瘤细胞系生长合适的RPMI1640培养液或MEM培养液，或者使用用于这种细胞培养的其他 标准培养液。此外，诸如胎牛血清(FCS)的血清流体可以组合形式使用。细胞融合的方法如下在上述培养液中混合足够数量的上述免疫 细胞和骨髓瘤细胞，加入在约37'C预先加热的PEG(例如，平均分子量 约为1000-6000)溶液(浓度一般为30-60%(w/v))，然后混合上述溶液， 以便形成靶融合细胞(杂交瘤)。随后，相继加入适当的培养液，并且重 复通过离心除去上清液的步骤，从而去除对杂交瘤生长不利的细胞融 合的试剂等。通过在诸如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷的培养 液)的标准选择性培养液中培养杂交瘤而对上述获得的杂交瘤加以选 择。在上述HAT培养液中持续培养一段时间，足够让细胞(未融合细胞) 而非靶杂交瘤死亡(通常数天至数周)。随后，采用标准限制稀释方法，从而对产生耙抗体的杂交瘤进行筛选和单克隆。除了用抗原对非人动物进行接种免疫来获得上述杂交瘤的方法以 外，通过用磷脂酰肌醇蛋白聚糖3体外致敏人淋巴细胞，并使致敏淋 巴细胞与具有永久分裂潜力的人衍生的骨髓瘤细胞融合的方法也可获 得与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3具有结合活性的所需的人抗体(参见日本专 利公布(Kokoku)号1-59878 B (1989))。此外，将磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作为抗原施用给具有全部人抗体基因库的转基因动物以获得产抗磷脂 酰肌醇蛋白聚糖3抗体的细胞，然后磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的人抗体 可从无限增殖化的产抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的细胞中获得(参见 国际专利公布号WO 94/25585、 WO 93/12227、 WO 92/03918和WO94/02602)。这样制得的产单克隆抗体的杂交瘤可在标准培养液中传代培养， 或者可长时间储存在液氮中。用于从杂交瘤中获得单克隆抗体的方法的一个例子包括根据标准 方法培养杂交瘤以及在培养物上清液中获得单克隆抗体。另一方法包 括将杂交瘤施用给与杂交瘤相容的哺乳动物以使它们增殖，并在腹水 中获得单克隆抗体。前一方法适用于获得高纯度的抗体。而后一方法 适用于大量生产抗体。3.重组抗体 .可用于本发明的单克隆抗体为重组单克隆抗体，其制备方法如下 采用基因工程技术从杂交瘤中克隆抗体基因，把基因整合到合适的载 体中，将载体导入宿主，然后使宿主产生重组单克隆抗体(例如，参见Vandamme， A. M.等，Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775， 1990)。具体 而言，将编码抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的可变(V)区的mRNA从产 抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的杂交瘤中分离出来。mRNA的分离方 法是已知的，例如胍超速离心法(Chirgwin, J. M.等，Biochemistry (1979) 18, 5294-5299)或AGPC法(Chomczynski, P等，Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159)，由此制备总RNA。然后采用mRNA纯化试剂盒 (Pharmacia)等制备耙mRNA。除此之外，mRNA也可利用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)直接制备。.利用反转录酶从上述制得的mRNA中合成抗体V区的cDNA。 cDNA的合成采用AMV反转录酶第一条链cDNA合成试剂盒 (SEIKAGAKU CORPORATION)等。此外，为了合成和扩增cDNA,例 如，可采用5，-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech)和5，-RACE法 (Frohman， M. A.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A.等，Nucleic Acids Res. (1989) 17， 2919隱2932)通过PCR进行。从这样获得的PCR产物中纯化靶DNA片段，然后连接到一载体 DNA上。而且，重组载体从产物中制备，并继续将载体导入大肠杆菌 (Escherichia coli)等中，挑选克隆，由此制备所需的重组载体。靶DNA 的核苷酸序列通过已知方法，例如双脱氧核苷酸链终止法而确认。在编码靶抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的V区的DNA获得之后， 将该DNA整合到一表达载体中，所述表达载体含有编码所需抗体的恒 定区(C区)的DNA。为了产生本发明所用的抗磯脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，将抗体基 因整合到表达载体中，以便基因在包括例如增强子和启动子的基因表 达控制区的调节下得以表达。下一步，用表达载体转化宿主细胞，使 宿主表达抗体。抗体基因的表达可将编码抗体重链(H链)的DNA或编码抗体轻链 (L链)的DNA分别整合到表达载体中，然后同时把这两个表达载体转 化宿主细胞；或者将编码H链和L链的DNA整合到单一表达载体中， 然后把此载体转化宿主细胞(参见WO 94/11523)。除了上述宿主细胞以外，转基因动物也可用来产生重组抗体。例 如，将抗体基因插入编码奶中独特产生的蛋白(例如，山羊P酪蛋白) 的基因，从而制备融合基因。将其中已插入抗体基因的含有融合基因 的DNA片段注射到山羊胚胎中，然后将此胚胎导入雌性山羊。从由转 基因山羊或已接受了胚胎的山羊生出的后代所产生的奶中获得期望的 抗体。此外，为了增加含有由转基因山羊所产生的期望抗体的奶量， 可对转基因山羊施用激素(Ebert, K.M.等，Bio/Technology (1994) 12, 699-702)。4.变造抗体(altered antibody)在本发明中，除了上述抗体外，诸如嵌合抗体或人源化抗体的人 工变造的基因重组抗体可用于例如降低针对人的异种抗原性。这些变 造抗体可采用已知的方法产生。嵌合抗体的制备方法如下将编码上述抗体V区的DNA连接到 编码人抗体C区的DNA上，把此产物整合到表达载体上，然后使载体 导入宿主以使宿主产生抗体。利用这种已知方法，可获得本发明中有 用的嵌合抗体。人源化抗体也称重构人抗体，其制备方法是将除人以外的哺乳动 物例如小鼠的抗体CDR(互补决定区)嫁接到人抗体的CDR。其总的基 因重组技术也是己知的(参见欧洲专利申请公布号EP 125023和WO 96/02576)。具体而言，DNA序列的合成是通过PCR方法利用若干寡核苷酸 作为引物进行的，所述寡核苷酸已事先制备，具有使小鼠抗体CDR的 终止区和人抗体的框架区(FR)重叠的部分(参见WO 98/13388中所述的 方法)。对与具有良好抗原结合部位的CDR连接的框架区加以选择。如果 需要，可替换抗体可变区中的框架区的氨基酸，以便重构人抗体的CDR 形成合适的抗原结合部位(Sato， K.等，Cancer Res. (1993) 53, 851-856)。对于嵌合抗体和人源化抗体的C区使用人抗体区。例如，对于H 链，可使用CYl、 Cy2、 Cy3或Cy4，而对于L链，可使用Ck或 C入。此外，为了提高抗体或其生产的稳定性，人抗体C区可加以修饰。嵌合抗体由源自除人以外的哺乳动物的抗体的可变区和衍生自人 抗体的恒定区组成。词时，人源化抗体由源自除人以外的哺乳动物的抗体的CDR和衍生自人抗体的框架区和C区组成。由于人源化抗体的 抗原性预定在人体中是低的，因此，其可用作本发明治疗剂的活性成 分。5.修饰抗体用于本发明的抗体不限于整个分子，只要其能与磷脂酰肌醇蛋白 聚糖3结合以及抑制细胞增殖即可，并且可以是抗体片段或其修饰产 物。二价抗体和单价抗体均包括在内。抗体片段的例子包括Fab、 F(ab，)2、 Fv、含有一个Fab和完整Fc的Fab/c以及单链Fv(scFv)，其 中H链或L链的Fv与适当的接头相连接。具体而言，通过采用诸如木 瓜蛋白酶或胃蛋白酶的酶处理抗体而合成抗体片段，或者构建编码这 些抗体片段的基因，将这些基因导入表达载体，然后通过适当的宿主 细胞表达基因(参见例如，Co., M.S.等，J. Immunol. (1994) 152， 2968-2976， Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Plueckth叫A. & Skerra， A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496， Academic Press, Inc., Lamoyi, E,， Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663， Rousseaux, J.等，Methods in Enzymology (1989) 121， 663-669，以及Bird, R. E.等，TIBTECH (1991) 9， 132-137)。将抗体的H链V区与L链V区连接获得scFv。在scFv中，H链 V区和L链V区通过接头或优选通过肽接头连接(Huston， J. S.等，Proc. Natl, Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85， 5879-5883)。 scFv中的H链V区和L链V区可源自如本说明书中所述抗体的任一种。作为连接V区的肽接 头，例如，使用任一含有12-19个氨基酸残基的单链肽。编码scFv的DNA可如下获得。通过PCR方法利用编码所需氨基 酸序列的整个或部分DNA(编码上述抗体的H链或H链V区的DNA 以及编码L链或L链V区的DNA)作为模板以及规定两端的引物对进 行扩增。然后通过组合使用编码肽接头部分的DNA和规定使两端各自与H链和L链连接的引物对，进一步进行扩增。此外，一旦制备了编码scFv的DNA，含有DNA的表达载体以及 转化有表达载体的宿主可根据标准方法获得。另外，通过使用宿主，scFv 可根据标准方法获得。利用宿主通过以与上述方法相似的方式获得其基因并且使基因表 达，可产生这些抗体片段。本发明中的"抗体"也包括这些抗体片段。作为修饰抗体，可采用与聚乙二醇(PEG)或诸如细胞毒性物质的各 种各样的分子之一结合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗体。本发明中的"抗 体"也包括这些修饰的抗体。这种修饰抗体可通过化学修饰得到的抗 体而获得。此外，抗体修饰方法在本技术领域中也已建立。而且，用于本发明中的抗体可以是双特异性抗体。双特异性抗体 可具有识别磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上不同表位的抗原结合部位。 或者， 一个抗原结合部位可识别磷脂酰肌醇蛋白聚糖3，而另一抗原结 合部位可识别诸如化疗剂、源自细胞的毒素、放射性物质等的细胞毒 性物质。在这种情况下，细胞毒性物质允许直接作用于表达磷脂酰肌 醇蛋白聚糖3的细胞上以特异性破坏肿瘤细胞，从而肿瘤细胞的增殖 可以得到抑制。双特异性抗体可通过结合两种抗体的H-L对而制备， 它也可通过融合产不同单克隆抗体的杂交瘤以制备产双特异性抗体的 融合细胞来获得。此外，双特异性抗体也可通过基因工程技术制备。6.重组抗体或修饰抗体的表达和生产如上所述构建的抗体基因可通过已知方法表达和获得。在哺乳动 物细胞的情况下，基因可通过可操作连接常用的有用启动子和待表达 的抗体基因以及通过连接位于其3'端下游的polyA信号而得以表达。例如，启动子/增强子是人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子。此外，另一可在本发明中用于抗体表达的启动子/增强子的例子包 括病毒启动子/增强子，如反转录病毒、多瘤病毒、腺病毒或猿猴病毒40(SV40)，或者源自哺乳动物细胞的启动子/增强子，如人延伸因子 la(HEFla)。当采用SV40启动子/增强子时，通过Mulligan等(Nature (1979) 277， 108)的方法可容易地进行基因表达，而当采用HEFla启动子/增强子时， 通过Mizushima等(Nucleic Acids Res. (19卯)18, 5322)的方法可容易地 进行基因表达。在大肠杆菌的情形下，将常用的有用启动子、用于抗体分泌的信 号序列以及待表达的抗体基因可操作连接，以便基因可得以表达。启 动子的例子包括lacz启动子和araB启动子。当采用lacz启动子时，通 过Ward等(Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) 的方法可表达抗体基因，而当采用araB启动子时，通过Better等(Science (1988) 240， 1041-1043)的方法可表达抗体基因。作为抗体分泌的信号序列，当抗体在大肠杆菌的周质中产生时， 可采用pelB信号序列(Lei， S. P.等，J. Bacteriol. (1987) 169， 4379)。在周质中产生的抗体被分离后，将抗体的结构适当地加以折叠和使用。可用的复制起点源自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV) 等。此外，为了在宿主细胞系统中扩增基因拷贝数，表达载体可含有 氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌 呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择 标记。为了生产用于本发明的抗体，可采用任何表达系统，例如真核细 胞系统或原核细胞系统。真核细胞的例子包括动物细胞，如建立的哺 乳动物细胞系统或昆虫细胞系统的细胞，以及丝状真菌细胞和酵母细胞。原核细胞的例子包括诸如大肠杆菌细胞的细菌细胞。优选地，用于本发明中的抗体在诸如CHO、 COS、骨髓瘤、BHK、 Vero或Hda细胞的哺乳动物细胞中表达。接着，将转化的宿主细胞体外或体内培养，以便使宿主细胞产生 靶抗体。根据已知方法，培养宿主细胞。例如，作为培养液，可采用 DMEM、 MEM、 RPMI1640、 IMDM等。诸如胎牛血清(FCS)的血清流 体可以组合形式使用。7. 抗体的分离和纯化-如上所述表达和生产的抗体可从细胞或宿主动物中分离，并纯化 成一致的水平。准备用于本发明中的抗体的分离和纯化可利用亲和柱 进行。利用蛋白A柱的例子为HyperD、 POROS、 Sepharose F.F.(Pharmacia)。其他用于蛋白的标准分离和纯化方法也可使用，对其 应用没有限制。例如，除了上述亲和柱以外的层析柱、渗滤、超滤、 盐析方法、透析等可适当加以选择并组合使用，以便分离和纯化抗体 (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring ■Harbor Laboratory, 1988)。8. 抗体活性的确认已知方法可用来分析本发明中所用的抗体的抗原结合活性 (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow， David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)以及抑制配体受体结合的活性(Harada， A.等， International Immunology (1993) 5， 681-690)。作为测定本发明中所用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的抗原结 合活性的方法，可采用ELISA(酶联免疫吸附测定)、EIA(酶免疫测定)、 RIA(放射免疫测定)或荧光抗体技术。例如，当采用酶免疫测定时，将 含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的样品，如产抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的细胞的培养物上清液，或者纯化的抗体加入到涂覆有磷脂 酰肌醇蛋白聚糖3的平板上。加入标记有诸如碱性磷酸酶的酶的第二 抗体。然后将平板温育，洗涤，加入酶底物，如对硝基苯基磷酸，接 着测定吸光度，以便对抗原结合活性加以评价。为了证实用于本发明的抗体的活性，对抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 抗体的中和活性进行测定。9. 细胞毒性活性用于本发明中的抗体具有ADCC活性或CDC活性作为细胞毒性 活性。通过混合效应细胞、靶细胞和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，然 后检测ADCC的水平，可对ADCC活性进行测定。作为效应细胞，例 如，可采用小鼠脾细胞、人外周血或分离自骨髓的单细胞。作为靶细 胞，例如，可釆用人建立的细胞系，如HuH-7人肝癌细胞系。耙细胞 事先用"Cr标记，将抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体加入到细胞中，然 后进行温育。接着，以效应细胞与靶细胞适当的比例加入效应细胞， 然后进行温育。温育后，收集上清液，对上清液中的放射性进行计数， 从而可测定ADCC活性。CDC活性的测定方法如下混合上述标记的靶细胞和抗磷脂酰肌 醇蛋白聚糖3抗体，加入补体，温育，培养，然后对上清液中的放射 性进行计数。抗体需要Fc部分施加细胞毒性活性。当本发明的细胞生长抑制剂 利用抗体的细胞毒性活性时，用于本发明的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 抗体需要含有Fc部分。10. 抑制血管形成本发明的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体可用于抑制血管形成。 11.给药方法以及药物制剂本发明的细胞生长抑制剂用于治疗或改善由基于异常细胞增殖的 疾病，特别是癌症引起的状况。本发明的细胞生长抑制剂的靶癌细胞的优选例子包括，但不特异 性限于，肝癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌 细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞和胰腺癌细胞。肝癌细胞是特别优选 的。有效剂量选自每次给药每kg体重为0.001mg至1000mg的范围内。 或者，可选择的剂量范围为每个患者0.01-100000mg。然而，含有本发 明的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的治疗剂不限于这些剂量。另外，作为本发明的治疗剂的服药时间，药剂可在疾病临床症状 发作之前或之后施用。根据标准方法(Remington，s Pharmaceutical Science,最新版，Mark Publishing Company, Easton， U.S.A.),含有本发明的抗磷脂酰肌醇蛋白 聚糖3抗体作为活性成分的治疗剂可加以配制，并且可一起含有可药 用的载体和添加剂。这种载体和药物添加剂的例子包括水、可药用有机溶剂、胶原蛋 白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、 聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤 维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、 双甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白 蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖以及可接受的表面活性剂作为药 物添加剂。上述添加剂的一种或适当组合在实践中根据本发明治疗剂的剂型 加以选择，但不限于此。例如，可用作注射用药物制剂的药剂的制备 方法是将纯化的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体溶解在诸如生理盐水、缓冲液或葡萄糖溶液的溶剂中，然后向溶液中加入诸如Tween80、 Tween20、明胶或人血清白蛋白的吸附抑制剂。或者，冻干剂可用来制 备剂型，其在用前复溶而溶解。作为冻干的赋形剂，例如，可采用诸 如甘露醇或葡萄糖的糖醇或糖类。附图简述

图1示出抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体(K6534)对HuH-7细胞的 ADCC活性。图2示出抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体(K6511)对HuH-7细胞的 CDC活性。图3示出磷脂酰肌醇蛋白聚糖在HuH-7细胞上的表达。图4A示出FACS分析由人肺癌细胞系表达GPC3的结果。它们是 用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体(K6534)分析的结果。图4B示出FACS分析由人白血病细胞系表达GPC3的结果。它们 是用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体(K6534)分析的结果。图4C示出FACS分析由人淋巴瘤细胞系表达GPC3的结果。它们 是用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体(K6534)分析的结果。图4D示出FACS分析由人结肠癌细胞系表达GPC3的结果。它们 是用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体(K6534)分析的结果。图4E示出FACS分析由人乳腺癌细胞系表达GPC3的结果。它们 是用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体(K6534)分析的结果。图4F示出FACS分析由人前列腺癌细胞系表达GPC3的结果。它 们是用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体(K6534)分析的结果。图4G示出FACS分析由人胰腺癌细胞系和人肝癌细胞系表达 GPC3的结果。它们是用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体(K6534)分析的 结果。实施发明的最佳方式本发明将参考下列实施例进一步描述。然而，本发明的技术范围 不受这些实施例等的限制。实施例1针对磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3合成肽的单克隆抗体的制备合成具有人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白的氨基酸序列(第355位到 第371位的氨基酸)(RQYRSAYYPEDLFIDKK)的肽。利用马来酰亚胺 苯甲酰氧基琥珀酰亚胺(MBS)型交联剂将合成肽结合到匙孔血蓝蛋白 (KLH)上，由此制备免疫原。将小鼠(BALB/c，雌性，6周龄)用免疫原 以每只小鼠100ug的剂量免疫接种3次。分析血清中的抗体效价。抗 体效价测定方法包括使稀释血清与固定在平板上的肽(0.5yg)反应，与 HRP标记的抗小鼠抗体进行反应，加入底物，然后在显色的450nm处 测定吸光度(肽固相ELISA方法)。在确认抗体效价后，收集脾细胞， 再与骨髓瘤细胞(P3/X63-AgS)融合(K6hler, G， Milstein， C: Nature， 256: 495 (1975)),由此制备杂交瘤。接着对5种杂交瘤生产的单克隆抗体进 行纯化。利用肽固相ELISA方法，测定对肽的结合活性，然后选择具 有高结合活性的IgGl抗体(下文称K6534)和IgG3抗体(下文称K6511)。实施例2利用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体抑制细胞增殖 根据Current Protocols in Immunology,第7章,Immunologic studies in humans, John E, Cologan等编,John Wiley & Sons, Inc., 1993 中所述的方法，对ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性)活性和 CDC(补体依赖的细胞毒性)活性进行测定。1.制备效应细胞从CBA/N小鼠(8周龄，雄性)摘出脾脏，然后将脾细胞分离在 RPMI1640培养基(GIBCO)中。把细胞洗涤在含有10。/。肽牛血清(FBS, HyClone)的同样培养基中，使制得的细胞浓度为5X 106/mL，由此制备 效应细胞。2. 制备补体溶液将幼兔补体(CEDARLANE)在10%含FBS的DMEM培养基 (GIBCO)中稀释10倍，由此制备补体溶液。3. 制备耙细胞将HuH-7人肝癌细胞系(Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB) No. JCRB0403, Human Science Research Support Bank (Human Science Kenkyu Shien Bank))用0.2mCi的"Cr-铬酸钠 (Amersham Pharmacia Biotech)在10%含FBS的DMEM培养基中37°C 下培养1小时，由此进行放射性标记。在放射性标记后，将细胞在10% 含FBS的RPMI1640培养基中洗涤3次，制得的细胞浓度为2X 105/mL， 由此制备靶细胞。4. 测定ADCC活性各50y 1的耙细胞和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体(K6534)加入到 96孔的U型底平板(BecktonDickinson)中，在冰上反应15分钟。然后 加入100yl的效应细胞，并在二氧化碳气体培养箱中培养4小时。抗 体的终浓度制成0或10y g/mL。培养后，收集100nL的上清液，并 利用Y计数器(COBRA II AUTO-GAMMA， MODEL D5005， Packard Instrument Company)测定放射性。细胞毒性活性(。/。)利用公式 (A-C)/(B-C)X100求出。其中，"A"代表各样品中的放射性(cpm)， "B" 代表补充有1。/。NP-40(nacalaitesque)的样品中的放射性(cpm)，以及"C" 代表仅含有耙细胞的样品中的放射性(cpm)。试验重复两次，并计算出 平均值。5. 测定CDC活性各50y 1的靶细胞和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体(K6511)加入到 96孔的平底平板(Beckton Dickinson)中，在冰上反应15分钟。然后加 入100yl的补体溶液，接着在二氧化碳气体培养箱中培养4小时。抗体的终浓度为0或3"g/mL。培养后，收集100uL的上清液，并利用 y计数器测定放射性。以在"4.测定ADCC活性"中所用的同样方式求出细胞毒性活性(％)。试验重复两次，并计算出平均值。图1示出ADCC活性，而图2示出CDC活性。这些结果揭示出 抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体对HuH-7人肝癌细胞系施加了 ADCC活 性和CDC活性，从而抑制了细胞增殖。实施例3测定磷脂酰肌醇蛋白聚糖在HuH-7细胞上的表达水平 将大约5X 105个HuH-7细胞悬浮在100 u 1的FACS/PBS(通过将 lg牛血清白蛋白(SIGMA)溶解在1L的CellWASH(Beckton Dickinson) 中来制备)。然后，把抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体(K6511)或小鼠 IgG2a(Biogenesis)作为对照抗体以25 U g/mL的浓度加入，并让溶液在 冰上放置30分钟。在用FACS/PBS洗涤后，产物悬浮在100ixl的 FACS/PBS中。加入4 y 1的山羊抗小鼠Ig FITC(Becton Dickinson),并 让溶液在冰上放置30分钟。在用FACS/PBS洗涤两次之后，将产物悬浮于1 ml的FACS/PBS 中。利用流式细胞仪(EPICS XL， BECKMAN COULTER)测定细胞的荧光强度。图3示出流式细胞仪测定的结果。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在HuH-7 细胞上表达，这提示抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体结合于在细胞上表 达的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3，从而抑制细胞增殖(图3)。实施例4利用FCM分析GPC3在癌细胞组上的表达利用FCM对人癌症细胞系(肺、结肠、直肠、乳腺、前列腺、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、胰腺和肝脏)表达的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)进行分析。将细胞培养2天，然后进行分析。利用已经细胞解离缓冲液(目录号13150-016,批号1098554, GIBCO)稀释10倍的胰蛋白酶-EDTA(目录 号25300-054，批号14210, GIBCO)收集附着的细胞。让收集的细胞在 冰上与抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体(K6534， 600 n g/ml)或mlgG2a抗 体作为阴性对照(Biogenesis, M-IgG2a-i，批号EA990719A， 1 mg/ml)(抗 体终浓度为10ug/ml)反应。洗涤后，让细胞与FITC标记的抗小鼠Ig 抗体(目录号349031， BD PharMingen)在冰上反应(2u 1/测试)。细胞洗涤 后，利用流式细胞仪(EPICS XL, BECKMAN COULTER)测定荧光强度。 结果，GPC3的表达在下列细胞系中得到证实肺癌细胞系(A549， NCI-H460, NCI-H23, NCI-H226, DMS114, EKVX， HOP-62和NCI-H322 M;白血病细胞系P30/OHK, BALL-l, THP-1和P39/TSU)、淋巴瘤细胞 系(MLMA, Ramos和U937)-,、结肠癌细胞系(SW480, COLO205, Lo Vo 和SW837)、乳腺癌细胞系(MDA-MB-231, SK-BR-3和MDA-MB-468)、 前列腺癌细胞系(LNCaP和22Rvl)、胰腺癌细胞系(MIAPaCa-2)和肝癌 细胞系(HepG2)。根据这些结果，可得出结论本发明的细胞生长抑制 剂在治疗肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、胰腺 癌等中是有用的。工业实用性根据本发明，提供了含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作为活性 成分的细胞生长抑制剂。而且，根据本发明，提供了含有抗磷脂酰肌 醇蛋白聚糖3抗体作为活性成分的癌细胞生长抑制剂。抗磷脂酰肌醇 蛋白聚糖3抗体与在人肝癌细胞系的HuH-7细胞上表达的磷脂酰肌醇 蛋白聚糖3结合，从而抑制细胞增殖。由此，含有抗磷脂酰肌醇蛋白 聚糖3抗体的药剂作为细胞生长抑制剂是有用的，特别是作为癌细胞 抑制剂。所有在此引用的出版物、专利和专利申请以其全文在此引作参考。 所以，本领域专业技术人员容易理解，在不背离如所附权利要求中所 述的本发明的技术概念和范围的情况下，有可能对本发明作出众多修 改和变化。本发明旨在包括这样的修改和变化。
权利要求
1. 具有胞毒活性的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
2. 权利要求l所述的抗体，胞毒活性为抗癌细胞的胞毒活性。
3. 权利要求1或2所述的抗体，其中癌细胞为肝癌细胞。
4. 权利要求3所述的抗体，其中肝癌细胞为HuH-7肝癌细胞系细胞。
5. 权利要求l-4任一项所述的抗体，其中胞毒活性为抗体依赖的 细胞介导的胞毒活性。
6. 权利要求l-4任一项所述的抗体，其中胞毒活性为补体依赖的 胞毒活性。
7. 权利要求l-6任一项所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
8. 权利要求l-7任一项所述的抗体，其中所述抗体为嵌合抗体。
9. 权利要求l-8任一项所述的抗体，其中所述抗体为人源化抗体。
10. 药物组合物，包含权利要求l-9任一项所述的抗体。
全文摘要
本发明提供了一种细胞生长抑制剂，其可用于治疗基于异常细胞增殖的疾病，尤其是癌症。细胞生长抑制剂含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作为活性成分。
文档编号C12N15/06GK101240022SQ20071009603
公开日2008年8月13日 申请日期2002年6月21日 优先权日2001年6月22日
发明者中村彻雄, 土屋政幸, 油谷浩幸 申请人:中外制药株式会社