专利名称：：用于乳腺癌预后的基因及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及乳腺癌的预后，尤其涉及一组用于乳腺癌预后的基因及其应用。
背景技术：
：乳腺癌(mammarycarcinoma)是女性最主要的恶性肿瘤，全国乳腺癌发病率以每年3%的比率递增，成为发病率增长最快的肿瘤。沪、京、津及沿海地区是我国乳腺癌的高发地区。以上海为例，过去30年间，上海乳腺癌发病率从17.7/10万上升至61/10万，列各类女性肿瘤发病的首位，即每6名女性癌症患者中就有一位是乳腺癌。仅上海市肿瘤医院的乳腺癌手术量，已从过去每一年不足70例，猛增至今年的每个月差不多120例。乳腺癌术后经系统的化疗或放疗或内分泌治疗等疗法，可以获得临床缓解。有些患者在治疗后可以恢复正常生活及工作，但有些患者术后一段时间甚至若干年后，又出现肿瘤复发或转移，其中一部分经再次手术及化疗，又可带瘤生存很长时间，而另一部分则可能死于肿瘤。因此，根据个体差异来选择合适的治疗乳腺癌的方法并有效地预防其复发，是乳腺癌治疗中待解决的最重要问题之一。由于乳腺癌的直接病因到现在仍未明了，引起乳腺癌复发的直接原因也不清楚，因此防止乳腺癌复发存在一定的困难，也就是说，人们不知道它是怎么引起的复发，也就无法防止其发生复发或阻断其复发的某一环节。尽管如此，通过各种研究手段和临床证明，人们还是发现了一些与乳腺癌预后相关的因子，如ER和HER-2。ER检测已成为患者内分泌治疗选择与否的重要条件，而HER-2检测更成为是否选用赫赛汀单抗治疗复发转移性乳腺癌的必要条件。经典预后和个体化治疗指标是患者年龄、肿瘤大小、组织学分级、组织学类型、腋淋巴结和激素受体状况等"传统指标"，但乳腺癌是一个具有极大异质性的复杂的系统性疾病，即使是上述指标完全相同的患者，其预后也可能显著不同。显然目前使用的临床、病理学指标仍无法准确预测乳腺癌患者复杂的预后情况，因而需要寻找更多与乳腺癌预后相关的因子。目前，临床上对乳腺癌患者进行预后的判断依据主要是根据免疫组化、酶联免疫吸附实验(ELISA)等技术的结果，但对乳腺癌患者进行预后的指标往往不止一个，需要进行很多次实验，费时费力，而且仍无法准确预测乳腺癌患者复杂的预后情况。由于肿瘤的发生和进展是在全基因组水平发生的多基因相关的疾病，利用基因芯片对乳腺癌相关基因表达模式可以再分类(分子分型)、疾病预后、预测对治疗的反应以及寻找治疗的较佳耙点及对应药物。利用基因芯片技术，国外对乳腺癌预后基因的筛选进行了很多的研究和产品开发。例如，比利时的Lacroix等在2002年制备了含250个乳腺癌分型相关基因的低密度表达谱芯片，并申请了专利；2002年Merck公司首先应用基因芯片技术建立包含70个基因的能准确进行乳腺癌患者预后的基因表达谱MammaPrint,该基因芯片在2007年2月获得美国FDA的批准；几乎同时荷兰另一研究组开发出包含76个基因的预测患者预后"Rotterdamsignature"。上述研究综述均基于欧洲和美国若干研究机构和医药公司对乳腺癌患者的大型实验和临床检验的权威研究报告。因各国地理环境、生活习惯的不同，乳腺癌的发病率有很大差异。鉴于我国乳腺癌发病的特点，以及人类种族之间存在差异的可能性，国外已有的基因表达谱数据在我国乳腺癌患者中的表达情况以及其与预后、个体化治疗的关系是否与国外报道一致尚需验证。
发明内容本发明要解决的技术问题之一是提供一组用于乳腺癌预后的基因，能对中国人群的乳腺癌患者在手术后5年内复发和不复发的情况进行预后和分类，以便及时地进行干预，有效指导临床治疗。本发明要解决的技术问题之二是提供一种用于乳腺癌预后的基因芯片。本发明要解决的技术问题之三是提供一种用于乳腺癌预后的试剂盒。本发明要解决的技术问题之四是提供本发明用于乳腺癌预后的基因的应用。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一个方面，提供了一组用于乳腺癌预后的基因，至少包括SEQIDNo.1SEQIDNo.23所示核苷酸序列中的一个或两个以上基因。较佳地，所述用于乳腺癌预后的基因，至少包括SEQIDNo.1SEQIDNo.23所示核苷酸序列中两个以上基因。更佳地，所述用于乳腺癌预后的基因，包括SEQIDNo.1SEQIDNo.23所示核苷酸序列的基因。在本发明的另一方面，提供了一种用于乳腺癌预后的基因芯片，包括固相载体和探针，所述探针与待测SEQIDNo.1SEQIDNo.23所示基因序列和/或其互补序列进行杂交。较佳地，所述探针包括下列核苷酸序列之一(1)SEQIDNo.24SEQIDNo.47所示序列;(2)SEQIDNo.24SEQIDNo.47所示序列中每条序列的互补链;(3)与SEQIDNo.24SEQIDNo,47所示的序列中每条序列有至少70%同源性的序列。更佳地，所述探针包括SEQIDNo.24SEQIDNo.47所示序列。在本发明的另一方面，提供了一种用于乳腺癌预后的试剂盒，包含与SEQIDNo.1SEQIDNo.23中至少一个基因序列进行杂交的探针。在本发明的另一方面，还提供了本发明的一组基因在乳腺癌预后中的应用，它是通过检测SEQIDNo.1SEQIDNo.23所示序列的基因的表达变化，对乳腺癌患者术后复发与不复发进行分类。所述检测基因的表达变化采用包括基因芯片的方法。本发明用于乳腺癌预后的基因，通过分子杂交手段，对乳腺癌组织样本中该些基因的表达改变状况进行检测，从而对中国人群的乳腺癌患者在手术后5年内复发和不复发的情况进行准确预后和分类，有效及时地指导临床用药。下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明通过训练组筛选出的23个基因的聚类分析图；图2是本发明验证组的聚类分析图。具体实施例方式实施例l样本的选择和分组所用乳腺癌组织样本取自2002年4月至2004年12月复旦大学附属肿瘤医院乳腺科收治的乳腺癌患者。其中髓样癌2例，粘液腺癌2例，浸润性小叶癌3例，余均为浸润性导管癌。将病例分为两组一组为训练组，共有65例，用于筛选可预后乳腺癌患者复发转移的基因表达谱。另一组为验证组，共有39例，用于验证基因表达谱的预后效果。随访62.5个月，训练组有29例出现复发或转移，验证组有17例出现复发或转移。每一病例取原发癌组织，并经病理组织学证实癌细胞达50%以上。实施例2基因表达谱实验(1)寡核苷酸探针的设计与合成选取了248个可能与乳腺癌预后相关的基因，使用ArrayDesigner4.1软件对这些基因进行探针设计，探针主要位于3'端。合成时需用氨基修饰。(2)芯片的制作合成的探针用灭菌的MiliQ水配成100一的浓度，点样前用200mM、pH7.4的含0.02%SDS的PB溶液稀释成25pmol/|il,分别排列到384孔板中。混匀后1500rpm离心5min。将稀释好的探针点于玻璃基片之上，UV固定2min。37。C放置在湿盒中过夜，放于干燥处备用。(3)乳腺癌样本总RNA抽提1)每lOOmg组织样本加入lmLTrizol，采用电动匀浆器充分打碎组织块。2)加入约l/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀1分钟左右，室温下静置5分钟。3)4°C,12,OOOrpm离心15分钟后小心取出上清液，将上清液转入新的1.5ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置5分钟(15mL离心管用7，500rpm离心20分钟)。4)4°C,12，000rpm离心IO分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70%乙醇，4°C，12,OOOrpm离心洗涤沉淀15分钟(15ml离心管用7，500rpm离心20分钟)。5)去上清，沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶的水充分溶解沉淀，测定0026。和0D2柳值。6)跑RNA电泳，看有无降解，并且28S的亮度要在18S两倍以上。(4)总RNA的纯化如果总RNA的纯度不高，会影响探针的标记效率和芯片杂交结果，因此使用QIAGENRNeasyMiniKit纯化总RNA。(5)荧光标记cRNA合成采用低RNA投入线性扩增试剂盒(Agilent)进行，方法参照试剂盒说明书。(6)荧光标记cRNA探针浓度及插入率计算癌组织用Cy3荧光标记，在552nm处测吸光值Abs，再用Abs值除以0.15计算浓度；正常组织用Cy5荧光标记，在650nm处测吸光值Abs，再用Abs值除以0.25计算浓度。(7)芯片杂交1)取出经定量的Cy3和Cy5标记的探针，癌Cy3取出80pmo1,正Cy5取出60pmo1,混合后浓缩到4pL。2)浓縮后加入的片断化试剂，置于94'CPCR仪中保温15min。同时配制杂交液。3)杂交液的配方如下20XSSC(pH7.0)6)alHumanCot-1DNA5plPolyA80(l吗/nl)2^12MHEPES1^12.5%SDS2pl无Rnase酶的7JC4^1总体积2(^14)待片断化反应结束后，加入相同体积的杂交液，混匀后，滴加于5(TC预热的芯片上，盖上盖玻片(50。C预热)。迅速放入预热过的杂交盒中，用胶带封闭，放入温箱中，5(TC杂交过夜。5)芯片洗涤分别用溶液i、n、ni进行洗涤。洗液配方见表l。表1<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>杂交结束后，用镊子取出片子，浸入洗液中按照上述顺序依次洗涤，上下抽动片子数次。最后用DEPC水，洗涤12min，1500rpm离心5min，之后用GenePix4000B芯片扫描仪进行扫描。(8)数据处理经GenePix4000B芯片扫描仪进行扫描，每个探针作为独立的基因进行处理，选用R软件包中的marray软件对数据进行标准化，SAM软件进行数据的筛查，选用Cluster3.0软件进行样本的层次聚类分析。在聚类之前，利用SAM软件，每个基因的表达水平在癌患病人和正常组织样本中相差2倍以上的被筛查出来，基因表达比值经对数(log2)转化后，对复发、转移组与无复发、转移组的基因表达值进行独立样本t检验，依据p值从小到大排序，选择P〈0.05的基因。(9)结果基于特异性标志基因组成的基因表达谱对训练组65例乳腺癌患者进行筛查，筛选出23个基因(SEQIDNo.1SEQIDNo.23)，该23个基因名称见表2，针对该23个基因设计的探针为SEQIDNo.24SEQIDNo.47所示序列(见表3或序列表)，该23个基因的聚类分析结果如图l所示。在图1中，最上方是聚类树状图，可以看出复发、转移的样本和无复发、转移的样本各自聚成一类，说明这23个基因可以很好地把乳腺癌术后复发和不复发样本区分开，聚类树状图下面是样本编号，右列是本发明探针所针对的该23个差异基因的名称，其中，PGR、PR-1是针对PGR基因的两条探针，再下面是表达图谱，红色表示基因上调(相对于该基因的平均数)，绿色表示下调，黑色表示未变化，灰色表示数据缺失。由图1可知，训练组中，复发、转移的29个患者中有24个被准确分类(正确率为82.76%)。图2为验证组的聚类分析图，该图的分析结果表明，在验证组的39例患者中，复发、转移的17个患者中有14个被准确分类(正确率为82.35%)，该验证结果说明本发明的23个基因能对中国人群的乳腺癌患者术后复发情况作出较为准确的预测。表2<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>序歹i」表<110〉上海华冠生物芯片有限公司〈120〉用于乳腺癌预后的基因及其应用<130〉NP-07-11767<160〉47<170〉Patentlnversion3.3<210〉1〈211〉2731<212〉腿<213〉Homosapiens<400〉1<sequence>complexsequenceseeoriginaldocumentpage11</sequence>tgtggccaggggtgctcctgtgctcaccctctcttggtgcatttttttggaagaataaaa2700ttgcctctctcttaaaaaaaaaaaaaaaaaa2731〈210〉2<211〉1722〈212〉DNA〈213〉Homosapiens〈400〉2gggattttcattactcg肌gagg3ttgtttttgt犯cgcctcttggtgtattttcaacgccfitctttgtggcttccgctcactgtcttgcaactaagtgtctgg犯aaaaatctaccccgaggtgctggccgcccgacgagaaagccgggctgccaccgagcgcgcacgccctgC3ag3tcg邓gacctactccgaacactgcccccctgccgcgccccgtgctcaaaccttccgctgccaggccgttgagtgatccagccagcatatatatctgCt鄉犯8Lgccctcctccgggtggc咖gtttttaatttacctgttctgagattttaagtccactgcattttttcccctcgtgcacctggggacctgctccgggggccc犯鄉gggcgtatgcggggcgccctctccaggctgctgcatgcgcccaggctgcacggcc3g3g3CtCCCccc犯gatct犯ggaccgcacacccccggaagacacatgggtgtacctgccgtggccgcaatggagtacgtgcgtcccccgcctccctccatcta/tttgaagctgcaaagttttcacccttggg柳犯3cttgatttcacggcgccgcgccgatctcatgcgctgccctcgcaggcaccctgctctacctcttggcccc￡LCt￡l3g3ga￡lcggccc卿gtgtgcccccctgacctgcgcggctgcgctggcggggmggtgagcacgatccggcccaatcatctctgcaggcttccctcc犯ttgtgaagcgtggcatttg3Cgggg3cccaacctttaccccaggacggaaaa犯aacagtgtgggctctccggactgaggtgttagacattttctccaccgctggcaaagataaattatttcggtgcccgctcagggcttcccccaccagccctcctgccagaaattttatccctggatggtgttgcctgggctcccagccccctgcctggccgagcctcccccggcctcaacgaaggagcccaccaceLcacccgcgacccagtccacctgsgatggc鄉agctcccgcaaaggactgctggtgcctttcagtgcccctcaccccgccactcatttttttccctttcgcgtagaaggtttggggtccaccctctc3gCtg3gggtccatttttctgttgctt鹏cUgagggtteicctgttgcaacctctctctttta犯acaacactctcgctctcaccgcggttcgtgcactggctgcgagcgggcsgtcgtcagg3cg鄉aagagctaccacctctgag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