专利名称：K-ras基因突变的定量检测方法
技术领域：
本发明涉及K-ras基因突变的检测，尤其涉及一种K-ras基因突变的 定量检测方法。
背景技术：
K-ras基因(GenBank:NC_000012)突变在胰腺癌的发生发展中起重 要作用。已报道，在胰腺癌组织、胰液或粪便、血液中可检测出K-ras 基因第12、 13或61密码子点突变(Takahashi， et al. Gastrointestinal Endo 2005.61:76—9; Luigi L， et al. Oncogene 2002.21:4301—6; Tada M， et al. Cancer Res 1993. 53: 2472—4; Lu XH, et al. Natl Med J China 2001. 81: 1050 — 3; N van Heek， et al. J. Clin. Pathol. 2005. 58:1315-1320)。
研究表明，检测体细胞DNA中K-ras基因突变与否可作为胰腺癌早 期诊断的一种方法。但在一些实验中发现慢性胰腺炎及胆道结石等良性疾 病中也存在K-ras基因突变，单纯定性分析，特异性较差，定量分析能更 好反映突变程度，以便于良恶性鉴别。目前普遍应用的K-ras基因突变检 测方法为限制性片断长度多态性分析法(RFLP法)和扩增受阻突变体系 法(ARMS法)。
RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法。但是该方法存在以下 缺点(1) 步骤烦琐，需要2天时间才能完成鉴定；
(2) 只能作定性研究，即只能明确是否存在K-ms基因突变，若要 求定量，则需用其他方法进行进一步检测；
(3) 存在第一轮酶切不完全导致的假阳性。 ARMS法的原理是根据3'端错配原则，在进行扩增反应时，若3'
端碱基对形成错配，链延伸反应就会因3' ， 5' 二磷酸二酯键形成的障 碍而受阻，因此，只有模板链是特定的等位基因时，才会检测出特异的扩 增产物。在ARMS的反应体系中，引物上标记2个不同荧光素，或加入荧 光探针等方法都是以实时荧光PCR为基础的基因分型方法。 ARMS法的步骤包括
(1) 设计针对K-ms基因某一种突变类型的特异性引物或探针；
(2) 对已知突变量的标准品进行实时定量PCR检测，得出标准曲线；
(3) 对未知样本进行实时定量PCR检测，根据上述标准曲线，得出未 知标本突变量。
但是，该方法的缺点是
(1 )每种特异性引物或探针只能针对某一种基因突变类型进行鉴定，
而K-ms基因在第12、 13密码子的突变类型可有十余种，需要逐一检测；
(2)可能出现由于单一碱基错配造成的假阳性。
肽核酸(P印tide Nucleic Acid， PNA)是一种DNA类似物，其骨架 由2-氨乙基甘氨酸取代了 DNA的磷酸二酯糖，其较之传统DNA探针具有 不少优点1. PNA十分稳定，正确配对的DNA/PNA的稳定性远远高于相 应的DNA/DNA，同时在PCR反应过程中PNA不可作为Taq酶的底物，亦不会被其他酶所降解；2.对于错配的PNA/DNA，哪怕只有一个碱基的错配， 也会造成其融解温度下降9一1(TC左右。目前，肽核酸己在多个领域得到 应用(张兵波等，《高分子通报》2006， 9:62-68; Egholm M， et al. Nature, 1993， 365:566 568)。
SYBR Green I是一种绿色荧光染料，它与双链DNA结合发出荧光，通 过检测荧光不但可以检测反应体系中的DNA扩增量，同时还能测定扩增产 物的DNA融解温度。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种K-ras基因突变的定量检测方 法，该方法只需设计一种针对野生型的PNA，并将该PNA与SYBR实时定 量PCR相结合，可对K-ras基因在第12、 13密码子的所有突变类型进行
为了解决上述技术问题，本发明K-ras基因突变的定量检测方法， 包括以下步骤
(1) 设计一种PNA，该PNA与野生型K-ras基因第一外显子中第12密 码子和/或第13密码子进行杂交，用于封闭野生型K-ms基因扩增；
(2) 构建突变型标准品和野生型标准品，该突变型标准品包含K-ras 基因第12和/或第13密码子的突变型序列，该野生型标准品包含野生型 K-ras基因序列； .
(3) 对已知拷贝数的突变型标准品进行加入PNA的SYBR—RT—PCR 定量检测，得出用于突变型K-ras基因定量的标准曲线；对己知拷贝数的 野生型和/或突变型标准品进行不加入PNA的SYBR—RT—PCR定量检测，得出用于总体K-ras基因定量的标准曲线；
(4) 由步骤(3)的SYBR-RT—PCR定量检测，得出用于定性判断待测 样品为野生型或突变型或突变/野生混合型的PCR产物融解曲线；
(5) 在与步骤(3)相同的反应条件下，用所述PNA对待测样品核酸进 行SYBR—RT—PCR定量检测，并根据步骤(4)的融解曲线的差异对待测样 品核酸进行定性判断后，根据步骤(3)的标准曲线得出待测样品核酸的 K-ras基因突变量及其占总体K-ras基因的比例。
所述突变型标准品和野生型标准品至少包括质粒、基因组DNA或人 工合成序列中的一种。
优选的，所述突变型标准品为质粒，该质粒包含K-ras基因第12和 /或第13密码子的突变型序列；所述野生型标准品为质粒，该质粒包含野 生型K-ras基因序列。
所述步骤(2)和步骤(3)之间，还包括对待检样品中的核酸进行提 取、纯化和浓度测定。
所述步骤(5)中待测样品核酸的K-ras基因突变量为突变K-ras基因 的拷贝数量，所述比例为拷贝数比值。
所述待检样品包括粪便、血液、组织液、细胞株或组织。
本发明K-ras基因突变的定量检测方法，将PNA与SYBR实时定量PCR 的结合应用于K-ms基因检测，由于PNA能同时覆盖K-ras基因第一外显 子中第12、 13密码子的6个碱基，任一突变均可导致PNA/DNA的错配， 使得融解温度发生明显改变，因此只需设计一种针对野生型的PNA，进行 一次PCR反应，即可将K-ras基因在第12、 13密码子的十余种突变型与野生型区分开。本发明方法操作简便、敏感性高、特异性高，可实时定量
检测K-ras基因突变量，并可应用于胰腺癌等疾病的早期辅助诊断。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1的质粒测序结果图2是本发明实施例1的标准品扩增曲线图3是根据图2绘制的标准曲线图4是本发明实施例1的扩增产物的融解曲线图5是本发明实施例1的定量方法示意图。
具体实施例方式
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例 中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人， 分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明采用联合肽核酸(PNA)的实时定量PCR法检测K-ras基因点 突变。所述K-ras基因可以是从慢性胰腺炎及胰腺癌患者的胰液、粪便及 血液中提取的DNA中的基因。因为PNA同时覆盖了 K-ras基因第一外显子 中第12、 13密码子的6个碱基，任一突变均可导致PNA/DNA的错配，使 得融解温度发生明显改变，故只需设计一种针对野生型K-ras基因的PNA， 进行一次PCR反应，即可区分野生型与突变型。
实施例1对已知突变量的质粒标准品进行实时定量PCR检测
l.主要试剂来源1.1 设计PNA
PNA是针对野生型K-ras基因第12、 13密码子设计的PNA，其序列 为Ac-ACGCCACCAGCTC-Lysine-C00H (SEQ ID NO: 1)，由韩国panagene 公司合成。
1.2 PCR引物
本发明用于扩增K-ras基因靶序列的引物，包括以下引物对 上游引物Fl: 5' -TACTGGTGGAGTATTTGATA-3' (SEQ ID NO: 2); 下游引物Rl: 5' -CAAGATTTACCTCTATTGTT-3' (SEQ ID NO: 3); 上述PCR引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
1.3 TA克隆试剂盒
TA克隆试剂盒(Target Clone)购买于TOYOBO公司。 1.4质粒抽提试剂盒 质粒抽提试剂盒购买于TIANGEN公司。
1. 5 SYBR Green realtime PCR Master Mix购买于ABI公司。
2. 细胞株DNA抽提
选取胰腺癌细胞株Panc-1、 BxPC-3、 CFPAC及SW1990 (细胞株来自 本实验室)，用酚提取法常规抽提细胞株DNA，并使用DNA纯化试剂盒 (Tiangen公司)进行纯化。
使用Gene公司NanoDrop ND1000型核酸微量测量仪测定所抽提DNA 浓度(OD260/OD280二1. 0 2. 0)。经检测，DNA浓度分别为Pane-1， 517ng/ Pi; BxPC-3， 337ng/ul; CFPAC， 425ng/ul; SW1990， 425ng/ul。
3. PCR方法克隆构建含突变型和野生型检测靶序列的质粒标准品3. 1 PCR反应液配制
PCR反应体系包括10 X Ex Taq缓冲液2 y 1 ， dNTP混合液200 u M， 引物F1 (SEQIDN0: 2)、 Rl (SEQIDN0: 3)各O. 5线DNA模板100ng， Taq酶1U用无菌双蒸水定容至20 ii 1 。
3. 2 PCR反应
所用仪器为德国Eppendorf公司5331型Thermal Cycler PCR仪。 PCR反应条件:94。C预变性5min， 94。C变性30s， 52。C退火40s， 72。C延 伸40s ，共35个循环，72'C延伸10min。
3.3电泳
2. 0%琼脂糖凝胶电泳确定产物正确性。
4. PCR产物克隆入质粒 4. 1菌株构建
将PCR产物纯化后，通过T载体连接，构建出携带突变和野生检测 靶序列的质粒，此质粒在E.coli DH5a (该大肠杆菌由本实验室培养所 得)进行大量扩增，并抽提纯化获得，测序正确后作为标准品。
4. 1. 1通过以下公式求得构建质粒时Xu 1以上的PCR产物X = 5 0Y + Z (Ykb: PCR产物的大小、Zng/ul: PCR产物浓度)。按以下组成 配制T载体连接液包括灭菌蒸馏水2u 1、 2X连接缓冲液1、 pTA2载 体(50ng/ul) lul、 T4 DNA连接酶lul、 PCR产物lyl，共10ul。 将反应液于室温(15 25°C)进行30分钟反应。
4. 1. 2制备感受态细胞，并加入上述连接液，用氯化钙方法转化大 肠杆菌，并进行X-gal和IPTG筛选(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版上册第96-99、 103页)。 4. 2质粒提取
挑取筛选所得的白色菌落，加入5ml预先加入氨苄青霉素(100mg/ml) 的LB培养基中，37"C振摇12 16小时。用Tiangen普通质粒小提试剂盒 (离心柱型)提取质粒。
4. 3质粒测序
质粒测序由invitrogen公司承接。
测序结果BxPC-3为野生型K-ras基因(第12、 13密码子为GGTGGC)， Pane-1、 CFPAC及SW1990为突变株，第12、 13密码子分别突变为G^TGGC、 GXTGGC、 GGTG^C (见图1)。
5. SYBR—RT—PCR实时定量检测K-ras基因突变 5.1标准品配制
根据测序结果，选取突变型细胞株Pane-1为标准品模板。 模板拷贝数换算拷贝数二质量/分子量X6. 02X1023 质粒分子量计算MW= (A碱基数X312) + (C碱基数X288) + (G
碱基数X328) + (T碱基数X303) —61"碱基数X324. 5;或是使用软
件DNAMAN计算。
本实验中合成的质粒为3457bp， 19Kda，因此lng质粒拷
贝数约为3X108。
将模板倍比稀释为107、 106、 105、 104、 103拷贝，作为标准品模板。 5.2 SYBR—RT—PCR荧光嵌合反应
在实时定量反应中以非特异性双链嵌合荧光染料SybrGreen I进行荧光标记，PCR反应后根据融解曲线判断PCR产物的特异性。实验中PNA 能将野生型基因的扩增进行抑制，因此仪器所检测的荧光量可反应突变基 因的拷贝量。
5. 2. 1反应体系及反应条件
仪器选用ABI公司的7500型实时定量PCR仪。
突变型K-ras基因检测反应体系包括2XTaqman realtime PCR Master Mix,引物F1 (SEQ ID NO: 2)、 Rl (SEQ ID NO: 3)各O. 4线 PNA (SEQ ID NO: 1) 3. 75线DNA标准品模板为108、 107、 106、 105、 104、 103、 102拷贝，用无菌双蒸水定容至25 u 1 。设定纯水为阴性对照(NTC)。
总体K-ras基因检测(不加PNA，针对突变/野生混合型)反应体系 包括2XTaqman realtime PCR Master Mix,弓l物Fl (SEQ ID NO: 2)、 Rl (SEQ ID NO: 3)各0.4nM， DNA标准品模板为108、 107、 106、 105、 104、 103、 102拷贝，用无菌双蒸水定容至25 p 1 。设定纯水为阴性对照(NTC)。
PCR反应条件95。C预变性60s， 95。C变性15s， 70。CPNA结合10s， 60。C退火60s，共40个循环；之后，95。C变性15s后，再以0. 7°C/s从 95"C降至6(TC，进行融解曲线分析。
5.2.2标准曲线绘制
根据步骤5. 2. 1中检测的结果分别绘制出相应突变型K-ras基因检 测标准曲线和总体K-ms基因检测标准曲线。
图2为突变型K-ras基因检测标准曲线，在该图中，上升的八条曲 线自左向右依次分别代表稀释倍比为108、 107、 106、 105、 104、 103、 102、 IO拷贝的突变型质粒标准品模板。图2中，横轴指循环数，纵轴指荧光检测值。由图2进一步绘制用十计算的标准曲线(见图3)。在图3中， 横轴指拷贝数的对数值，纵轴指Ct值，标准曲线的斜率为-3.01，截距 (Interc印t)为39. 06， R2为0. 997。
同样，可绘制出总体K-ras基因检测标准曲线(图略)。
5.2.3扩增产物的融解曲线分析
PNA分别封闭野生型和突变型序列后，扩增产物的融解曲线如图4所 示。多次重复测定可获得，野生型与突变型融解温度分别为83.5X:士0.5 (n=15)和80.8。C士0,6 (n=15)。在图4中，横轴指温度，纵轴指荧光 强度变化的导数(derivative),融解曲线1代表纯野生型不加PNA的产 物融解曲线，其Tm值为83.9'C;融解曲线2代表纯突变型不加PNA的产 物融解曲线，其Tm值为83.2'C;融解曲线3代表纯野生型或突变/野生 混合型，加入PNA未能完全抑制野生型扩增的产物融解曲线，其Tm值也 为83. 9°C;融解曲线4代表纯突变型或突变/野生混合型，加入PNA能完 全抑制野生型扩增的产物融解曲线，其Tm值为80.5"。 5.2.4定量方法
选用同一系列倍比稀释的质粒标准品(Panel)，分成两组， 一组标 准品反应体系中不加PNA，另一组加入PNA(终浓度为3.75uM)。同时， 待检模板也同样分为两组。这四组在同一条件下进行SYBR RT—PCR，反 应结束后，根据PNA加入和不加入的情况分别制作突变型和总体K-ras 基因定量检测标准曲线，并分别进行待检样本的定量。其中，对于未加入 PNA的反应，野生型与突变型均扩增，结果计算出的模板量为野生型基因 与突变型基因的总拷贝数；而加入PNA的反应，因为野生型基因受到抑制而无扩增，结果所得的模板量即为样本中所含的突变型基因的拷贝数(见 图5)。但应当注意，在定量时，应先进行上述的融解曲线分析，若根据
融解曲线判断样本为纯野生型或突变型时，只需进行总拷贝数计算；若判 断为突变/野生混合型时，在PNA加入突变型K-ras基因检测反应中，野 生型扩增完全抑制的前提下，依据突变型K-ras基因检测标准曲线，计算 出K-ras突变基因拷贝数，在PNA不加入的总体K-ras基因检测反应中， 依据总体K-ras基因检测标准曲线，计算出K-ras基因总体拷贝数。并由 此计算出样本中突变占总体拷贝数的比例。
实施例2临床样品(以血液和粪便样品为例)中K-ras基因突变的
1. 收集临床胰腺癌、慢性胰腺炎患者及正常人的粪便及血液，抽提
DNA。
2. 血液DNA抽提方法①抗凝全血0.5 12ml;②加入500 700ul TT缓冲液，剧烈振荡后，低温离心机以每分钟12000转离心5分钟；③ 收集沉淀，重复2， 3步骤，直至沉淀为无色； 加入200ulPCR裂解液A; ⑤37。C水浴过夜；⑥抽取PCR裂解物(约200ul)，加入200ul酚氯仿， 充分混匀后，以每分钟12000转离心20分钟；⑦取上清，加入200ul氯 仿充分混匀，12000转/分离心10分钟；⑧取上清，加入100ul乙酸铵及 2倍体积无水乙醇(约700ul)充分混匀，静置1分钟后，12000转/分离 心10分钟；⑨弃上清加入lml 70%乙醇洗涤，12000转/分离心5分钟; ⑩弃上清，自然风干，用100ulTE液溶解沉淀，分装于一80。C保存。
3. 粪便DNA抽提方法采用Qiagen公司的QIAamp DNA Stool MiniKit试剂盒进行。
4. DNA浓度测定方法同实施例1的步骤2。
5. 按照实施例1的5. 2. 1，对标本进行K-ras基因的PNA钳制SYBR -RT-PCR检测。
6. 结果分析根据标准曲线，得出胰腺癌K-ras基因突变拷贝数及 突变型与野生型的比例。序列表
〈110〉上海长海医院
〈120〉 K-ras基因突变的定量检测方法
〈130〉 NP-07-11857
〈160〉 3
〈170〉 Patentln version 3. 3
〈210〉 1
<211> 13
〈212〉 DNA 〈213>人工序列
<400> 1
acgccaccag etc 13
〈210〉 2
〈211〉 20
〈212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉
<221> misc—feature
<222〉 (l).'咖
〈223〉 引物
〈400〉 2
tactggtgga gtatttgata 20<210〉 3
〈211〉 20
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉 misc—feature
〈222〉 (1)..(20)
〈223〉 引物
〈400〉 3
caagatttac ctctattgtt 20
权利要求
1. 一种K-ras基因突变的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤(1)设计一种PNA，该PNA与野生型K-ras基因第一外显子中第12密码子和/或第13密码子进行杂交，用于封闭野生型K-ras基因扩增；(2)构建突变型标准品和野生型标准品，该突变型标准品包含K-ras基因第12和/或第13密码子的突变型序列，该野生型标准品包含野生型K-ras基因序列；(3)对已知拷贝数的突变型标准品进行加入PNA的SYBR—RT—PCR定量检测，得出用于突变型K-ras基因定量的标准曲线；对已知拷贝数的野生型和/或突变型标准品进行不加入PNA的SYBR—RT—PCR定量检测，得出用于总体K-ras基因定量的标准曲线；(4)由步骤(3)的SYBR—RT—PCR定量检测，得出用于定性判断待测样品为野生型或突变型或突变/野生混合型的PCR产物融解曲线；(5)在与步骤(3)相同的反应条件下，用所述PNA对待测样品核酸进行SYBR—RT—PCR定量检测，并根据步骤(4)的融解曲线的差异对待测样品核酸进行定性判断后，根据步骤(3)的标准曲线得出待测样品核酸的K-ras基因突变量及其占总体K-ras基因的比例。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述突变型标准品和野 生型标准品至少包括质粒、基因组DNA或人工合成序列中的一种。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述突变型标准品为质 粒，该质粒包含K-ras基因第12和/或第13密码子的突变型序列。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述野生型标准品为质 粒，该质粒包含野生型K-ras基因序列。
5. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)和步骤(5) 之间，还包括对待检样品中的核酸进行提取、纯化和浓度测定。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中待测样 品核酸的K-ras基因突变量为突变K-ras基因的拷贝数量，所述比例为拷 贝数比值。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品包括粪便、 血液、组织液、细胞株或组织。
全文摘要
本发明公开了K-ras基因突变的定量检测的方法，包括以下步骤设计一种与野生型K-ras基因第一外显子中第12密码子和/或第13密码子进行杂交的PNA；用所述PNA分别对已知拷贝数的突变型标准品和野生型标准品进行SYBR-RT-PCR定量检测，得出标准曲线和融解曲线；用所述PNA对待测样品核酸进行SYBR-RT-PCR定量检测；根据所述融解曲线判断待测样品核酸为野生型或突变型或突变/野生混合型后，根据所述标准曲线得出待测样品核酸的K-ras基因突变量。本发明方法操作简便、敏感性高、特异性高，并可应用于胰腺癌等疾病的早期辅助诊断。
文档编号C12Q1/68GK101434985SQ200710094239
公开日2009年5月20日 申请日期2007年11月15日 优先权日2007年11月15日
发明者李兆申, 杜奕奇, 寒 林, 军 高, 龚燕芳 申请人:上海长海医院