专利名称：E2f8基因的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因，尤其涉及一种E2F8基因的应用。
背景技术：
人E2F8基因(Genbank No.醒J)24680)是E2F转录因子家族的成员之一，其功 能不详。E2F最初作为腺病毒E2启动子的激活剂被发现，随后的研究陆续发现E2F 家族其它成员。E2F转录因子家族已被证明在细胞周期调控中发挥重要作用，它们通 过在细胞周期中调节靶基因的转录，来调控细胞的增殖。随着对E2F家族研究工作的 深入，E2F转录因子的功能已同细胞凋亡和肿瘤形成联系起来。
目前，关于E2F8基因与肿瘤发生的关系尚不清楚，有待进一步研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种E2F8基因的应用，该E2F8基因可作为 肝癌诊断的标记分子，提高了肝癌诊断的准确性。
本发明要解决的技术问题之二是提供一种E2F8基因在制备治疗肝癌的药物中的 应用。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现
在本发明的一个方面，提供了一种E2F8基因在制备诊断肝癌的产品中的应用。 所述诊断肝癌的产品包括用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或
基因芯片诊断肝癌的产品。
在本发明中，所述用RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增E2F8基因
的引物。
所述用实时定量PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增E2F8基因的引物。 所述用免疫检测诊断肝癌的产品包括与E2F8蛋白特异性结合的抗体，包括多 克隆抗体和单克隆抗体。
所述用原位杂交诊断肝癌的产品包括与E2F8基因的核酸序列杂交的探针。 所述用基因芯片诊断肝癌的产品包括与E2F8基因的核酸序列杂交的探针。 在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对E2F8蛋白特异的抗体。例如，将提纯的人E2F8基因产物或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆 抗体。同样，表达人E2F8蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产 生抗体。根据本发明制备的抗体也可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可用杂交瘤技 术制备(例如，Kohler et al. ， Nature 256: 495， 1975; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511， 1976; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 292， 1976)。本发 明的抗体包括可以阻抑E2F8功能的抗体，也可以是不影响人E2F8功能的抗体。每一 类抗体都可以通过对人E2F8基因产物的片段或功能域致免疫而产生，而人E2F8基因 产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的E2F8
基因产物结合的抗体，可以利用在原核细胞例如￡coW中产生的基因产物来免疫动 物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化E2F8蛋白或多肽结合的抗体，可以 利用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物来免疫动物而得到。
在本发明中，所述探针可以是DNA、 RNA、 DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。 所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任 何长度都可以。所述探针的长度可短至25、 20、 15、 13或10个碱基长度。同样，所 述探针的长度可长至60、 80、 100、 150、 300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于 不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是 14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25 个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
在本发明的另一方面，提供了一种E2F8基因在制备治疗肝癌的药物中的应用。
所述治疗肝癌的药物包括通过RNA干扰抑制E2F8基因表达的双链核糖核酸， 或用于抑制E2F8蛋白活性的蛋白质。
本发明实验证明E2F8基因在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织，因此E2F8 基因可作为诊断肝癌的特异标志基因，使肝癌诊断更加准确、快速。本发明E2F8基 因为防治肝癌提供了新的治疗靶点和有效新药。
图1是本发明通过RT-PCR验证E2F8基因在人肝癌组织和癌旁组织中的差异表达
图2是本发明通过实时定量PCR验证E2F8基因在人肝癌组织和癌旁组织中的差 异表达图；图3是本发明实施例7的流式细胞检测图。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条 件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议 的条件。
实施例1
用去甲基化药物MC (终浓度为2000nM)，处理15株肝癌细胞株后，使用基因芯片检 测处理前后基因表达水平的差异，发现在8株细胞株中，E2F8基因表达差异明显。其中， 基因芯片实验主要包括如下四个步骤芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测以及 结果分析。
1. 芯片制备目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体。通过点样法将靶基因 作为探针按顺序排列在载体上，靶基因可分为基因组DNA、 cDNA (或人工合成DNA)。
2. 样品制备待测样品中总RNA的抽提步骤如下分别取用去甲基化药物DAC 处理的15株肝癌细胞株和15株未经去甲基化处理的肝癌细胞株，再用TRIZol法抽 提总RNA。
提取的总RNA可进一步用于样品cDNA探针制备，其过程包括荧光探针的制备 (cDNA第一链标记)、纯化和定量。定量后的探针吸回至1.5 ml离心管中，加热抽 干，保存于-2(TC，待杂交。
3. 芯片杂交
1) 准备工作(1)洗涤盖玻片，将盖玻片依次放入ddH20、 95%乙醇、ddH20，各 3 min，最后放入干燥的50 ml离心管中1000 rpm，离心3 min，去除残留的水渍， 放置待用；(2)配制1(F。PBS溶液；(3)平衡杂交炉，用水平仪校准杂交炉，保持水 平；(4)配制如下洗片液:20XSSC溶液、10 %SDS溶液、洗液I (2XSSC / 0. 5 % SDS)、 洗液II (1XSSC / 0.1 % SDS)、洗片溶液III (0. 1XSSC)。
2) 预杂交预杂交液的配制是30yl的总体积中有9yl的20XSSPE缓冲液、 3ul的50XDenhandts缓冲液及18ul ddH20，再从干燥箱中取出芯片，将适量的 预杂交液滴加于芯片上，盖上盖玻片，然后将芯片放入加有PBS的杂交盒中，置于42'C杂交箱中预杂交约1小时。预杂交完成之后取出芯片用ddH20浸洗片刻，待盖玻片 脱落后将芯片放入干燥的离心管中离心，去除残留的水渍，放置待用。
3)杂交取出经定量的Cy3和Cy5标记的探针，各用9 15y 1 ddH20充分溶 解混合于L5ml离心管内，然后配制杂交液，Cy3/Cy5荧光标记探针的杂交液由20 X SSPE缓冲液、50X Denhandts缓冲液和溶解有探针的ddH20组成，接着，取杂 交液滴加在芯片上，并盖上盖玻片。最后，将该杂交芯片放入加有PBS的杂交盒，置 于42。C杂交箱中杂交12 20小时。
4.洗涤、扫描和数据分析芯片杂交反应结束后，需进行芯片洗涤。再通过特 定的扫描仪比如激光共聚焦扫描仪进行扫描，扫描后将图像转化为基于荧光强度的数 字信号，随后进行数据分析和处理。由于样本差异、荧光标记效率和检出率的不平衡， 需对原始提取信号进行均衡和修正才能进一步分析实验数据。经分析，由基因芯片检 测肝癌及癌旁组织中E2F8基因的表达差异，结果显示E2F8基因在肝癌组织中表达显 著上调。
实施例2
RT-PCR实验检测E2F8基因在肝癌组织中的表达情况。
1. 组织分离(Tissue isolation)
实验用组织来源于72例HBV阳性并表达甲胎蛋白的原发性肝癌的手术病人 (RT-PCR证实AFP在肝癌均为阳性而癌旁为阴性)。手术切除的肝脏一经离体，迅速切 取病灶及周围5公分外癌旁组织，放入液氮中(一8(TC)保存。癌和癌旁的诊断均以 病理诊断为最终依据。
2. 总RNA的抽提试剂盒
抽提RNA试剂采用TRIzol reagent (GIBC0/BRL)，该试剂是基于酸性酚一步抽提 法生产的。用于抽提RNA所用的器皿和水均要进行无RNA酶处理，以保证实验中无RNA 酶的环境。
3. RNA的抽提步骤
将碾杵和匀浆器等器皿在20(TC干烤4 h，去除RNA酶，冷却；加入液氮中预冷， 将组织从液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙将组织放入预先加入TRIzol试剂的匀 浆器中，匀浆数分钟；将匀浆后的液体转入无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4°C 离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4。C离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加异丙醇，4。C离心沉淀RNA;用75%乙醇洗 涤沉淀2次；用无RNA酶的去离子水溶解沉淀。抽提的RNA质量鉴定紫外分光光度 计测定260/280比值(比值均在1. 7 2. 0);并在MOPS甲醛变性胶中观察有无降解。
4. cDNA的合成
取总RNA2Pg， 01igodT16 l叱，70。C保温3min，立即冰上变性5min。加入5 Xbuffer: DTT和50mg/L的dNTP各2叱及lPL的逆转录酶，充分混匀后，42。C2h。模板使用终 浓度通常为1 " g/100叱。
5. RT-PCR扩增
E2F8 (F):上游引物为5' — CCAACCCTGCTGTGAATA-3， (SEQ ID N0:1); E2F8 (R):下游引物为5， - TTTCTGGCTCATTACCCT -3， (SEQ ID N0:2);
actin(F): 5， - CATCCTGCGTCTGGACCT -3， (SEQ ID NO:4);
actin(R): 5， - GTACTTGCGCTCAGGAGGAG -3，(SEQ ID NO:5)。
以e-actin作内对照，反应混合物中各成分为:e-actin(F)、 e-actin(R) 、 E2F8 (F)、 E2F8 (R)、 10XBuffer、 MgC12、 dNTP、 TaqDNA聚合酶、cDNA模板分别为0. 2、 0.2、 0.4、 0.4、 1.0、 1.0、 0.2、 0. 1和5叱，最后补充ddH20使反应体系为10叱。 PCR的反应条件如下94。C,5分钟预变性；94°C， 30秒变性；55°C， 30秒退火；72°C， 30秒延伸；35个循环，电泳检测PCR扩增产物。
6. 实验结果显示，E2F8基因在肝癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织中E2F8 基因的表达水平(见图1)，差异率达89.2%， E2F8特异扩增片断大小为419bp，内参 e-actin的产物片断大小为490bp，在图1中，"N"指癌旁组织，"C"指肝癌组织。
7. 根据上述实验结果，可通过RT-PCR诊断肝癌设计E2F8基因的PCR引物， 检测肿瘤组织中E2F8基因RNA的含量，RNA含量高则说明患肝癌的可能性高，反之则 低。
实施例3实时定量PCR实验
采用相对定量法检测E2F8基因在肝癌样本中的表达差异(Thermal Cycler DiceTM Real Time System TP800, Takara; SYBR Premix Ex TaqTM , Takara)。基因E2F8 的上游引物为ATCAAACACTGGCCCAAATG(SEQ ID NO: 3)，下游引物TTTCTGGCTCATTACCCT (SEQ ID NO: 2)，产物片断大小为121bp。管家基因e-actin作为内参，其上游 引物为TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC(SEQIDNO: 6)，下游引物ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG (SEQ ID NO: 7)，产物片断大小为101bp。实时定量PCR检测表明，E2F8基因在 肝癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织中的表达水平，经t检验，P<0.00002 (见 图2)。该实验结果表明，可通过实时定量PCR诊断肝癌设计E2F8基因的PCR引物， 检测肿瘤组织中E2F8基因RNA的含量，RNA含量高则说明患肝癌的可能性高，反之则 低。
实施例4原位杂交
用E2F8基因探针，与肿瘤切片进行原位杂交，阳性杂交信号越强，患肝癌的可 能性越高。实验步骤为将肝脏肿瘤组织取材后OCT包埋、液氮速冻，恒冷箱冰冻切 片，该冰冻切片进一步用于原位杂交。
实施例5免疫检测
1. 抗原蛋白获得
(1) 利用基因工程表达可从Genbank数据库中获得人E2F8基因的d)NA序列， 通过PCR扩增获得编码框，插入原核生物或真核生物表达载体中，表达E2F8蛋白， 并按基因工程表达产物的纯化体系纯化蛋白质。
(2) 通过培养高表达E2F8基因的人体来源细胞或组织，再分离纯化E2F8蛋白。
2. 抗体制备
可采用以下几种方法制备抗体
(1) 细胞融合法用上述制备的E2F8蛋白免疫动物(包括兔子、山羊等)，获得 脾脏细胞，再与骨髓瘤细胞融合，并按常规单克隆抗体制备技术制备单克隆抗体。
(2) 利用噬菌体表面展示库，克隆免疫动物的脾脏IgG可变区并表达成基因工程 单克隆抗体。
(3) 利用纯化的蛋白质免疫动物，制备多抗血清。
3. 检测
(1) 用制备的抗体(多抗或单抗)，用组织化学方法进行肝癌的病理检测，阳性 信号为肝癌。
(2) 取患者血清，用ELISA方法检测，阳性反应为肝癌可疑病人。
(3) 将E2F8抗体作为蛋白质芯片的探针之一，用于多种肿瘤诊断。 实施例6 SiRNA实验构建反义表达体系，导入治疗细胞，抑制E2F8基因的表达。针对E2F8基因mRNA 设计并合成两对siRNA序列，分别是E2F8-siRNA-l和E2F8-siRNA-2。用2ml含10% 胎牛血清的DMEM(Gibco公司产品)培养液在35腦细胞培养皿中于5%二氧化碳100% 湿度培养箱中培养肝癌QGY-7703细胞，覆盖率达到80%-90%时，按照Lipofect AMINETM2000脂质体操作方案转染100nM siRNA于细胞中，分别在6， 12， 24， 36， 48小时后，将细胞用预冷的lxPBS(本实施例中各种试剂和常规操作方法按照《分子 克隆实验指南》第二版中相关说明部分配制)洗两遍，加入新鲜配制的细胞裂 解液(50mMTris-HC1， pH7. 5; 1%NP-40; 150mMNaCl; lmMPMSF， lraMEGTA， 0. lmg/ml aprotinin; lmS / ml leup印tin; lmM Na3V04; lmM NaF)，立即用细胞刮刀刮下细胞 使其与裂解液充分混合，冰浴30分钟至1小时。4°C、 13， OOOg离心15分钟，收集上 清至新的EP管中，用标准Bradford法测定蛋白含量。取各样品等量总蛋白(20-5(￥g) 分别加入等体积的2倍上样缓冲液，沸水煮沸变性5分钟后于12%的SDS-PAGE凝胶 电泳分离各蛋白，并转印蛋白到杂交的P PVDA膜上，该膜用20%的甲醇Tris-glycine 缓冲器中处理过。转完的膜浸于含5。/Uw/v)BSA的PBS溶液中封闭，之后，为了免 疫分析，以稀释比例为1:500的抗E2F8抗体在室温下对膜孵育1小时。接着，用羊 抗兔二抗室温孵育1小时。最后，利用ECL PLUS系统(Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway， New Jersey)检测E2F8基因的表达情况。
结果表明E2F8-siRNA-1和E2F8-siRNA-2能抑制QGY-7703细胞中相应E2F8基因 的表达。
将分别包含E2F8-siRNA-1、E2F8-siRNA-2的pSUPER或荧光素酶，通过Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，经过24小时，转染到位于25毫米的器皿中的HuH-7， H印3B， H印G2 和Bel-7721细胞中。然后，在100毫米的组织培养器皿中洗膜培养，接着，采用O. 6 1.0 mg/mlGeneticin (真核表达筛选用抗生素，Invitrogen公司)经过21天选择。
读取450nm吸光度值，计算平均值和标准误，连续测量5-7天，画细胞生长曲线。 结果显示，SiRNA实验抑制本发明的人E2F8基因表达后，使HuH-7肝癌细胞的存 活率明显低于对照组的细胞，说明人E2F8基因的表达下调能在一定程度上抑制肝癌 细胞生长。
实施例7 E2F8的过表达促进肝癌细胞的生长 1.构建Pcdna3. 1B-E2F8质粒PCR扩增相应片段，酶切后连接到空质粒Pcdna3. 1B上，测序。
2. 细胞培养及同步化
将肝癌细胞株PLC (ATCC Number: CRL-8024 )培养于含10%小牛血清和抗生素 的DMEM(GIBCO)培养液中，在37'C , 5% C02的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养，3 4 天传代一次。当细胞长到一定密度时，转染Pcdna3. 1B-E2F8质粒，同时设Pcdna3. 1B空 质粒转染的细胞为对照。
细胞转染后12小时，换含2 mM胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidine, Sigma)的DMEM培养液， 培养17-18小时后，1 X PBS漂洗三次后正常培养液培养9小时，再次加入胸腺嘧啶脱氧 核苷培养细胞，使细胞周期停滞在G1/S临界处。经过18小时后培养后，不同时间点收集 细胞。
3. 流式细胞仪检测
细胞经同步化后，掺入0. 033 raM 5-溴，2-脱氧尿嘧啶核苷 (5-bromo-2-deoxyuridine， BrdU， Sigma)孵育30分钟，PBS漂洗细胞后，将细胞用 胰酶消化收集，75%预冷乙醇固定细胞；2 M HC1室温处理20分钟变性，再用0. 1 M sodium borate (Na2B407， pH 8. 5)中和。将Brdu的单克隆抗体(BD Bioscience,已 标记异硫氰酸荧光黄[FITC])加入已处理好的细胞中，室温放置2小时。随后，加入 RNase和PI (Pr叩idium Iodide，碘化丙啶)，37°C 1小时，流式细胞仪分析。流 式细胞检测结果如图3所示，表明E2F8基因过表达的细胞在S期DNA合成明显增加， 肝癌细胞生长速度显著加快，说明E2F8基因过表达促进肝癌细胞生长。 实施例8 以E2F8基因表达产物为耙分子设计的基因治疗 以E2F8基因表达产物为靶分子，设计一种携带某基因的表达载体，导入该载体， 其产物对E2F8基因的表达有抑制作用，或对E2F8蛋白活性有抑制作用。序列表
〈110〉上海人类基因组研究中心
〈120〉 E2F8基因的应用
〈130〉 NP-07-12065
〈160〉 7
〈170〉 Patentln version 3. 3
〈210〉 1
〈211〉 18
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉 misc—feature
〈222〉 (1)..(18)
〈223〉 引物
〈400〉 1
ccaaccctgc tgtgaata 18
〈210〉 2
〈211〉 18
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
<220〉
<221> misc—feature
〈222〉 (1)..(18)
〈223〉 引物
〈400> 2
tttctggctc attaccct 18
〈210〉 3
〈211〉 20
〈212〉 DNA 〈213>人工序列
〈220〉
〈221〉 misc—feature
〈222〉 (1)..(20)
〈223〉 引物
〈400> 3atcaaacact ggcccaaatg 20
<210〉 4
〈211〉 18
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉 misc—feature
〈222〉 (1)..(18)
〈223〉 引物
〈400〉 4
catcctgcgt ctggacct. 18
〈210〉 5
〈211〉 20
<212> DNA <213>人工序列
〈220〉
<221> misc—feature
〈222〉 (1)..(20)
〈223〉 引物
〈400〉 5
gtacttgcgc tcagg鄉ag 20
〈210〉 6
<211〉 22
<212〉 腿 <213〉人工序列
〈220〉
〈221〉 misc一feature
〈222〉 (l)..咖
〈223〉 引物
〈400〉 6
ttgttacagg aagtcccttg cc 22
〈210〉 7
<211〉 22
〈212〉 DNA〈213〉人工序列 〈220〉
<221> misc一feature
〈222〉 (1)..(22)
〈223〉 引物
<400〉 7
atgctatcac ctcccctgtg tg 2权利要求
1. 一种E2F8基因的应用，其特征在于，所述E2F8基因在制备诊断肝癌的产品中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断肝癌的产品包括:用RT-PCR、 实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或基因芯片诊断肝癌的产品。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断肝癌的产品至少 包括一对特异扩增E2F8基因的引物。
4. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断肝癌的产 品至少包括一对特异扩增E2F8基因的引物。
5. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用免疫检测诊断肝癌的产品包 括与E2F8蛋白特异性结合的抗体。
6. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用原位杂交诊断肝癌的产品包 括与E2F8基因的核酸序列杂交的探针。
7. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用基因芯片诊断肝癌的产品包 括与E2F8基因的核酸序列杂交的探针。
8. —种E2F8基因的应用，其特征在于，所述E2F8基因在制备治疗肝癌的药物 中的应用。
9. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述治疗肝癌的药物包括通过RNA 干扰抑制E2F8基因表达的双链核糖核酸，或用于抑制E2F8蛋白活性的蛋白质。
全文摘要
本发明公开了一种E2F8基因的应用，用于制备诊断肝癌的产品和制备治疗肝癌的药物。本发明的E2F8基因，可作为诊断肝癌的特异标志基因，使肝癌诊断更加准确、快速，且为防治肝癌提供了新的治疗靶点和有效新药。
文档编号C12Q1/68GK101457252SQ20071009445
公开日2009年6月17日 申请日期2007年12月13日 优先权日2007年12月13日
发明者宗伟英, 庆 邓, 韩泽广, 健 黄 申请人:上海人类基因组研究中心