专利名称：：一种检测念珠菌的基因芯片的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物领域，尤其涉及基因芯片。
背景技术：
：真菌感染为临床危重患者的严重并发症，真菌感染及其治疗越来越受到关注。真菌感染中念珠菌占首位，其中以白色念珠菌居多(60%_70%)，其次为热带念珠菌(10%)。分离真菌的标本以呼吸道痰液标本、口腔唾液样本最为常见，其次为血液、尿液、产道或伤口分泌物等。传统的念珠菌菌种鉴定方法主要以形态学为依据，通过培养后观察菌落和镜下特征。由于真菌感染诊断存在困难，方法相对落后，往往滞后于临床治疗，导致很多患者得不到正确和及时的诊断而丧失了治疗机会。因此，发展新技术、提高念珠菌病诊断方法的敏感性、对病原真菌鉴定到种的水平、增加治疗手段已刻不容缓。同时也具有临床治疗和流行病学研究的双重意义。目前飞速发展的分子生物学技术为病原真菌的生物学特性研究提供了可能，各种检测手段不断被应用于真菌病的诊断及菌种鉴定中，可以使真菌感染的菌种的确立与快速诊断一步完成。基因芯片(GeneChip)是将大量的寡核苷酸分子固定于固相载体上形成DNA微点阵，借助核苷酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效解读和分析。利用基因芯片技术对念珠菌基因分型及同源性分析国内外均未见报道。
发明内容本发明目的为提供一种检测念珠菌的基因芯片。实现上述目的的技术方案如下一种检测念珠菌的基因芯片，其特征在于该芯片包括(1)多种不同类型念珠菌的检测寡核苷酸探针和质量控制寡核苷酸探针；(2)寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列。所述的多种不同类型的念珠菌是指白念珠菌(Candidaalbicans)、热带念珠菌(Candidatropicalis)、平滑念珠菌(Candidaglabrata)、近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)、克柔念珠菌(Candidakrusei)、假热带念珠菌(Candidakefyr)、星状念珠菌(Candidastellatoidea)和都柏林念珠菌(C.dubliniensis)8种念珠菌。本发明的检测样本为呼吸道痰液标本、口腔唾液样本、产道分泌物、伤口分泌物以及血液、尿液、大便。本发明可用于念珠菌感染性疾病的诊断，尤其可用于早期诊断。基因芯片的制备是利用核酸分子间碱基配对作用，然后通过酶催化预结合在核酸上的底物，从而显现出核酸结合信号的基本原理。基因芯片的制作较为复杂，为保证芯片的质量应注意以下事项(O样品核酸的提取提取的核酸必须有较高的纯度(OD260/0D280比值应大于1.50)和一定的量(10ng-100ng)，以保证标记的质量和特异性扩增，如果纯度不够，可能导致后面的杂交出现非特异点。(2)样品核酸的标记掺入的生物素必须达到一定的浓度(每个反应掺入的标记物为0.1-lug)，以保证杂交点的灵敏度，若浓度不够，杂交结果常会出现假阴性。(3)同源核酸杂交应掌握杂交温度控制在42'C左右，温度过低，会出现非特异杂交点，使特异性降低，温度过高，则往往出现假阴性。本发明具有以下有益效果1、本发明一种检测念珠菌的基因芯片能够快速、准确地对各种念珠菌引起的感染性疾病进行快速侦检并对念珠菌分型和同源性分析。2、本发明一种检测念珠菌的基因芯片能对各种类型念珠菌具有高度的敏感性，且具有很高的特异性。3、将基因芯片技术应用于念珠菌感染性疾病的早期诊断，对于念珠菌感染性疾病的早期诊断及个性化治疗具有重要的临床意义。图l为本发明一种检测念珠菌的基因芯片上探针的分布情况具体实施例方式实施例11、材料和方法1.1材料1.1.1试剂TaqDNA聚合酶购自北京百泰克，PCR产物纯化试剂盒购自v—gene生物科技有限公司，dNTP购自Promega公司，RNAsin购自大连宝生物工程有限公司，鲑鱼歸DNA,购自Sigama公司。1.1.2毒株白念珠菌(Candidaalbicans)、热带念珠菌(Candidatropicalis)、平滑念珠菌(Candidaglabrata)、近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)、克柔念珠菌(Candidakrusei)、假热带念珠菌(Candidakefyr)、星状念珠菌(Candidastellatoidea)和都柏林念珠菌(C.dubliniensis)均为临床分离菌，经科玛嘉显色培养基和PCR产物序列测定双重鉴定。1.1.3仪器和设备仪器和设备PCR仪(杭州朗基MG96+);点样器；杂交仪；扫描仪。2.引物设计通过genebank分别查找到白念珠菌(Candidaalbicans)、热带念珠菌(Candidatropicalis)、平滑念珠菌(Candidaglabrata)、近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)、克柔念珠菌(Candidakrusei)、假热带念珠菌(Candidakefyr)、星状念珠菌(Candidastellatoidea)和都柏林念珠菌(C.dubliniensis)各数条序列，然后使用DNAStar分析，设计出针对念珠菌DNA的通用引物。念珠菌DNA的通用引物5，GTGAATCATCGAATCTTTGAAC3'和5，TCCTCCGCTTATTGATATGC3'1.3基因芯片的制作1.3.1种念珠菌DNA的提取各取以上不同基因型念珠菌培养液400ul于1500ul离心管中，加裂解液600ul,稍振荡，煮沸5分钟，加入氯仿450ul,振荡均匀后-20。C静置10min。12000r/min离心lOmin,取上清于新的离心管中，加异丙醇800ul，-20。C静置lh。12000r/minl离心10min,去上清，沉淀用冷乙醇洗涤，置超净工作台吹干。可直接进行PCR。1.3.2核酸探针的扩增以1.3.1所获得的核酸为模板，使用L2所设计的引物，分别扩增出白念珠菌(Candidaalbic謹)、热带念珠菌(Candidatropicalis)、平滑念珠菌(Candidaglabrata)、近平滑念珠菌(Candidapar邻silosis)、克柔念珠菌(Candidakrusei)、假热带念珠菌(Candidakefyr)、星状念珠菌(Candidastellatoidea)和都柏林念珠菌(C.dubliniensis)的目的片断，以作为探针。PCR的反应条件如下反应体系水17ul5Xbuffer4ulMgcl(25mM)4uld,(各2.5mM)2.5ulTaq(4U)0.5ulP1+P2(50Pmol/ul)0.5+0.5ul模板2ul注离心(4000r/min)30秒循环参数94.5°C(预变性)94.5°C(变性)55°C(退火)72°C(延伸)72°C(终延伸)2min30s40s90s9minL3.3点膜通过微量点样器将所获得的探针点在预处理的尼龙膜上。具体矩阵分布见图1。1.4样品的处理1.4.1核酸的提取各取不同临床待检样本(呼吸道痰液标本、口腔唾液样本、产道分泌物、伤口分泌物以及血液、尿液、大便)400ul于1500ul离心管中，加裂解液600ul,振荡30秒，煮沸5分钟，振荡均匀后-2(TC静置10min。12000r/min离心10min,取上清于新的离心管中。1.4.2核酸的扩增方法，引物为生物素标记引物(Pa:biotin-GTGAATCATCGAATCTTTGAAC和Pb:biotin-TCCTCCGCTTATTGATATGC)，循环参数同1.3.2，只是体系不同。其反应体系如下。反应体系H2o15ulBuffer2.5ulMgcl2(25mM)luldNTP(10.0mM)0.5ulTaq(5U/ul)0.5ulPa+Pb(50pmol/ul)lul模板5ul1.5杂交加500ul预杂交液于基因芯片上，42。C处理40min。取20ul1.4.2的产物于1.5ml的离心管内，IO(TC变性lOmin.-20。C冷却5min，加杂交液450ul，混匀，于基因芯片上，42。C杂交lh。分别用2XSSC，0.1XSDS和0.1XSSC,0.1XSDS各洗三次，加400u酒SA'42。C封闭30min，450ul缓冲液中加1.6ulAV-AP,42'C酶联20min，先用洗涤液洗膜三次，后加入显色液(450ul底物液+1.6ulBCIP+L6ulNBT)，常温或42'C显色3~5min。用蒸馏水或自来水冲洗，终止显色。1.6杂交结果的分析将杂交完毕晾干的DNA阵列用自制的芯片扫描仪进行扫描分析，根据大量样品的分析，设置读数0.05以下为阴性，0.2以上为阳性，两者之间为可疑。打印诊断报告。样品同时与科玛嘉显色培养基分离、PCR检测结果进行比较。阳性和阴性对照:分别为人GAPDH，ACTIN基因片段,加入反应系统，以监视标记和杂交、显色系统是否有效。2、结果2.1准确率检测的结果我们针对性的对白念珠菌(Candidaalbicans)、热带念珠菌(Candidatropicalis)、平滑念珠菌(Candidaglabrata)、近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)、克柔念珠菌(Candidakrusei)、假热带念珠菌(Candidakefyr)、星状念珠菌(Candidastellatoidea)和都柏林念珠菌(C.dubliniensis)株分别进行了检测，杂交结果八张芯片分别出现出白念珠菌(Candidaalbicans)、热带念珠菌(Candidatropicalis)、平滑念珠菌(Candidaglabrata)、近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)、克柔念珠菌(Candidakrusei)、假热带念珠菌(Candidakefyr)、星状念珠菌(Candidastellatoidea)和都柏林念珠菌(C.dubliniensis)特异性杂交点,检测结果皆为阳性，没有非特异性杂交点的出现。同时阳性对照明显，读数大于0.3，阴性对照则小于o.05。2.2重复性检测结果同时各取10管阳性念珠菌株进行重复性检测，结果如表1。_表1基因芯片重复性检测结果__12345678910阳性率白念珠菌++++++++++ioo%热带念珠菌++++++++++i00q%平滑念珠菌++—+++++++90%<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求1、一种检测念珠菌的基因芯片，其特征在于该芯片包括(1)多种不同类型念珠菌的检测寡核苷酸探针和质量控制寡核苷酸探针；(2)寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列。2、根据权利要求l所述的一种检测念珠菌的基因芯片，其特征在于多种不同类型念珠菌为白念珠菌、热带念珠菌、平滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、假热带念珠菌、星状念珠菌和都柏林念珠菌。3、根据权利要求l所述的一种检测念珠菌的基因芯片，其特征在于检测样本为呼吸道痰液标本、口腔唾液样本、产道分泌物、伤口分泌物以及血液、尿液、大便。4、根据权利要求l所述的一种检测念珠菌的基因芯片，其特征在于可用于念珠菌感染性疾病的诊断。5、根据权利要求4所述的一种检测念珠菌的基因芯片，其特征在于可用于念珠菌感染性疾病的早期诊断。全文摘要本发明提供一种检测念珠菌的基因芯片，涉及生物领域。由于真菌感染诊断存在困难，方法相对落后，往往滞后与临床治疗，导致很多患者得不到正确和及时的诊断而丧失了治疗机会。本发明一种检测念珠菌的基因芯片，其特征在于该芯片包括(1)多种不同类型念珠菌的检测寡核苷酸探针和质量控制寡核苷酸探针；(2)寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列。具有快速、准确侦检念珠菌感染性疾病，且灵敏性高、特异性高的有益效果。文档编号C12Q1/68GK101348829SQ20071030698公开日2009年1月21日申请日期2007年12月29日优先权日2007年12月29日发明者何祥一,徐进章,车团结申请人:兰州百源基因技术有限公司