专利名称：从生物学样品富集靶细胞的方法及除去白细胞的方法
技术领域：
本发明涉及从生物学样品富集靶细胞的方法及除去白细胞的方法。
背景技术：
包括干细胞、胎儿细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、免疫细胞等在内的 细胞在疾病的预防、检测、诊断和治疗方面有很大应用。
干细胞是指一类具有自我复制能力的多潜能细胞，包括胚胎干细胞、 骨髓干细胞、成体干细胞、脐血干细胞、皮肤干细胞等。在一定条件下， 干细胞可以分化成多种功能细胞，因此干细胞具有治疗许多疑难病症、提 供器官移植，以及康复、保健，减轻老化、恢复青春活力等等广泛应用。
己经证明早在妊娠五周母血循环中就可监测出胎儿细胞。目前，获取 胎儿细胞进行产前诊断的方法主要有羊膜腔穿刺、绒毛活检和脐血管穿刺。 这些手段对胎儿有一定的风险，有可能造成流产。从母血中分离出胎儿细 胞预示着只需通过简单的静脉穿刺途径即可获得胎儿细胞。胎儿细胞的临 床应用将包括早期诊断胎儿染色体或基因异常。
大量报道提示甚至可在以成像分析方式检测到原发肿瘤之前，可在患 者中发现循环肿瘤细胞(CTC)。除了在早期诊断和预测中的潜在作用外， CTC还可在表征随肿瘤进程的遗传和免疫表型变化中发挥主要作用，从而 有助于指导个体化治疗。
由于免疫系统或其他系统的疾病，或由于免疫接种或某些临床治疗措 施及某些外界环境因素的影响，免疫细胞(例如T淋巴细胞、B淋巴细胞， K淋巴细胞或NK淋巴细胞)的数量或功能均可发生变化。因此，进行细 胞免疫检测，对于某些疾病的诊断和发病机理研究、免疫治疗或预防接种 的效果评估及环境因素对机体免疫功能的影响，都具有重要的意义。
但是所述干细胞、胎儿细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、免疫细胞在生尽管已将各种技术用于富集、分离和表征靶细胞，但是其中许多具有 相似的原理，即基于抗体的正选择。由于细胞表面标记的异质性表达，这 些用于耙细胞检测的策略显然受到以下因素的限制抗不同靶细胞上的生
物标记的抗体的可获得性、敏感性和特异性。其它策略包括红细胞(RBC)、 白细胞(WBC)的负除去。目前主要基于大小过滤除去较小的RBC和WBC， 但因为某些靶细胞例如CTC可如WBC —样小，所述基于大小过滤的方法 有丢失耙细胞的危险。
对于除去白细胞的方法，现有技术中虽存在使用抗CD45包被的30nm 磁珠(Miltenyi产品，Germany)除去白细胞的方法，但该方法不仅昂贵(RMB 600-700/试验)，费时(超过4小时/试验)，而且WBC去除效率不高(WBC 去除率为约2-3 logs)。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明创造性地将基于摩尔渗透压浓度 (osmolality)的方式与免疫亲和层析法联合起来用于分别去除RBC和 WBC，从而达到富集靶细胞，尤其是稀有细胞的目的。该方法不仅成本低， 而且高效地使耙细胞得以富集，并易于后续检测。所述靶细胞包括干细胞、 胎儿细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、免疫细胞等。
本发明还提供了一种除去白细胞的方法，该方法不仅成本低，省时， 而且效率高。
具体实施例方式
在本发明的一个具体实施方式
中，本发明提供一种从生物学样品富集
耙细胞的方法，该方法包括
用基于摩尔渗透压浓度的方式除去红细胞和用免疫亲和层析法除去白 细胞。
本发明创造性地联合应用基于摩尔渗透压浓度的方式除去红细胞和免疫亲和层析法除去白细胞来富集靶细胞。利用摩尔渗透压浓度的方式除去 红细胞和利用免疫亲和层析法除去白细胞这两个过程没有特别的顺序要 求。例如可以先利用亲和层析法除去白细胞然后再利用基于摩尔渗透压浓 度的方式除去红细胞；或者用基于摩尔渗透压浓度的方式除去红细胞然后 再利用亲和层析法除去白细胞。为了更快地、更有效地使白细胞通过亲和 层析柱，在本发明的一个优选实施方式中，用基于摩尔渗透压浓度的方式 除去红细胞然后再利用亲和层析法除去白细胞。
在本发明的一个具体实施方式
中，所述的生物学样品是体液；优选所 述的体液是血液、骨髓、脊髓或手术液(surgical fluid)。在本发明的一个 实施方式中，以血液为例验证了本发明方法的有效性。同时由于血液、骨 髓、脊髓或手术液的密度类似且靶细胞在其中的存在状态类似，所以本发 明的方法可用于骨髓、脊髓或手术液中靶细胞的富集。
为了收集血液，将人或任何其它动物的血样收集在抗凝血收集管中或 含有任何抗凝剂的管中，所述抗凝剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、枸橼酸 葡萄糖(ACD)等。为了收集骨髓，可在供者的髂骨部位穿刺采集骨髓； 也可以动员骨髓和其他部位的造血干细胞大量释放到外周血中去，然后从 供者的手臂静脉中采集。脊髓可通过例如脊髓穿刺获得。手术液可以为利 用手术方式获得的体液，例如腹腔或胸腔积液，其中包括本发明所述的一 些耙细胞和蛋白。
在本发明的一个优选实施方式中，所用的血液是取血当天，优选取血 起20小时之内，更优选取血起10小时之内，进一步优选取血起5小时之 内或取血起3小时之内或取血起1小时之内，最优选取血起立即获得的新 鲜血液。上述新鲜血液中的红细胞对RBC裂解缓冲液敏感，而耙细胞对 RBC裂解缓冲液不敏感。
在本发明的一个具体实施方式
中，其中所述免疫亲和层析法中所使用 的免疫颗粒的尺寸为1 pm 20 pm，更优选为2 pm 15 pm，进一步优选为 5pm 10^im。在本发明的一个具体实施方式
中，进一步优选所述的免疫颗 粒具有可再生性。可利用Tris-Glycine等缓冲液对免疫颗粒进行洗涤和重新 使用，从而节约成本。在本发明的一个具体实施方式
中，用基于摩尔渗透压浓度的方式除去 红细胞。在本发明的一个优选实施方式中，所述基于摩尔渗透压浓度的方
式中包括沉淀和裂解红细胞。所述沉淀优选以500 3000 rpm，更优选100 2000rpm离心1 6分钟，优选2 4分钟以沉淀RBC，优选同时除去血浆。 在室温将所收集的RBC于RBC裂解缓冲液中轻柔旋转振荡5 20分钟。 然后将所获得的溶液以500 3000 rpm，更优选100 2000 rpm，离心l IO分钟，更优选3 6分钟以沉淀未裂解的细胞，所述未裂解的细胞包括白 细胞和稀有细胞。
在本发明的一个具体实施方式
中，所述用于除去白细胞的免疫颗粒位 于亲和层析柱中并结合有靶向白细胞的特异性结合物。优选所述的特异性 结合物为识别在白细胞上表达的抗原的抗体。由于CD45 (又称"白细胞表 面共同抗原")是最认可和接受的白细胞表面抗原，所以更优选所述的抗 体为抗CD45抗体。最优选将抗CD45 mAb(CD45单抗)偶联到Affi-Gel 10 基质上。可采用本领域技术人员已知的亲和层析柱进行层析。在本发明的 一个优选实施方式中，为了除去白细胞，将含有白细胞的溶液以约0.5 8.5 ml/min的流速，优选以约0.75 3.5 ml/min的流速，进一步优选以约1 2.5 ml/min的流速流过亲和层析柱。
利用本发明的方法所获得的靶细胞适于后续分析、操作或应用，当然 也可在获得了本发明的靶细胞后，对靶细胞内的蛋白和/或基因进行后续分 析、操作或应用。在本发明的一个具体实施方式
中，所述后续分析、操作 或应用为以下之一流式细胞术、聚合酶链式反应(PCR)、免疫荧光、免 疫细胞化学、图像分析、酶学测定、炎症研究、基因表达谱分析、治疗效 力测验、细胞培养和细胞治疗、质谱和其它与细胞和/或蛋白相关的研究等。
在本发明的一个具体实施方式
中，用本发明的方法富集的靶细胞包括 干细胞、胎儿细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、免疫细胞中的至少一种。在 利用本发明的方法富集了上述靶细胞的基础上，可以利用进一步的分离纯 化方法获得循环肿瘤细胞、干细胞(包括胚胎干细胞、骨髓干细胞、成体 干细胞、脐血干细胞、皮肤干细胞等)、胎儿细胞、免疫细胞(包括T淋 巴细胞、B淋巴细胞，K淋巴细胞和NK淋巴细胞)等，并可进一步利用这些纯化的循环肿瘤细胞、干细胞、胎儿细胞、免疫细胞进行预测、检测、 诊断和治疗。
在本发明的一个具体实施方式
中，本发明的方法还包括除去血浆蛋白。 为了更有利于节省时间和减少操作步骤，除去血浆蛋白的步骤可与沉淀红
细胞的步骤同时进行。例如在本发明的一个实施方式中，将全血以1500离 心3分钟，以沉淀红细胞和去除包括血桨蛋白在内的血浆。
在本发明的一个具体实施方式
中，优选回收本发明的方法所除去的白 细胞和/或所除去的血浆蛋白，并将其进一步用于后续分析、操作或应用， 例如，流式细胞术、聚合酶链式反应(PCR)、免疫荧光、免疫细胞化学、 图像分析、酶学测定、炎症研究、基因表达谱分析、治疗效力测验、细胞 培养、细胞治疗、质谱和其它与细胞和/或蛋白相关的研究等。例如可利用 进一步的分离纯化方法获得白细胞或血浆蛋白等，并可进一步利用这些纯 化的白细胞或血浆蛋白进行预测、检测、诊断和治疗。
在本发明中，术语"富集"以其最广泛的含义使用，是使一物质比其 原存在环境条件下更加浓縮，其包括"积累"、"浓縮"、"提取"、"分 离"等含义在内。
本发明还提供了一种除去白细胞的方法，该方法包括采用抗CD45抗 体偶联的Affi-Gd IO除去白细胞。可采用本领域技术人员已知的亲和层析 柱进行层析。在本发明的一个优选实施方式中，为了除去白细胞，将含有 白细胞的溶液以约0.5 8.5 ml/min的流速，优选以约0.75 3.5 ml/min的流 速，进一步优选以约1 2.5 ml/min的流速流过亲和层析柱。可利用 Tris-Glycine等缓冲液对免疫颗粒进行洗涤和重新使用，从而节约成本。该 方法不仅成本低，省时，而且效率高。
以下以实施例的方式进一步说明本发明，所述实施例并不用于限定本 发明的范围。
实施例
实施例l、从生物学样品除去白细胞的方法
将人血稀释在含有5 mM EDTA的PBS中，加入3倍体积的RBC裂解缓冲液(具体成分见下)，于室温轻柔旋转振荡12分钟。将样品于1500 rpm 旋转离心5分钟以收集细胞沉淀。弃去上清液中的裂解RBC，并将细胞沉 淀重悬浮在含有5 mM EDTA的3 ml 5 ml的PBS中，并使其通过抗CD45 抗体偶联的Affi-Gel 10 (Pierce, IL， US)亲和层析柱以除去WBC，其中将 细胞以2ml/min的流速于PBS中流过所述亲和层析柱，并收集流过液。与 现有技术中利用Miltenyi，s试剂盒去除白细胞相比，本发明除去白细胞的 方法显著降低了成本(本发明分离方法的成本为RMB 80-150/试验；而 Multiny，s试剂盒的成本为RMB 600-700/试验)、縮短了时间(本发明分离 方法每个试验需不到40分钟即可完成去除白细胞；而Multiny's试剂盒去 除白细胞需超过4小时/试验)、而且效率高(本发明方法的WBC去除率 可达约3-4 logs;而Multiny，s试剂盒的WBC去除率仅为约2-3 logs)。
抗CD45抗体偶联的Affi-Gel 10的制备由于购自Pierce (IL， US)的 Affi-Gel IO含有可供激活的化学基团，所以将抗CD45抗体与Affi-Gel 10 混合约15分钟，即可完成抗CD45抗体与Affi-Gel 10的偶联。
RBC裂解缓冲液(pH7.2):
NH4C1 82.9 g
KHC03 10 g
EDTA 二钠 0.37 g
H20 1 L
实施例2、从生物学样品富集靶细胞的方法
将5ml 10ml的人血收集在含有EDTA的试管中，以1500 rpm旋 转离心3分钟以沉淀RBC和除去包括血浆蛋白在内的血浆。在室温将所收 集的RBC于10 ml基于NH4C1的RBC裂解缓冲液(具体成分如上)轻柔 旋转振荡15分钟。然后将所获得的溶液以1500 rpm旋转离心5分钟以沉 淀未裂解的细胞，所述未裂解的细胞包括WBC和稀有细胞。将所得未裂 解细胞沉淀重悬浮在5 ml PBS中，并使其通过0.5 ml抗CD45抗体偶联 的Affi-Gel 10 (Pierce, IL, US)亲和层析柱以除去WBC，其中将细胞以 2ml/min的流速于PBS中流过所述亲和层析柱，并收集流过液。将所收集的含有稀有细胞的流过液在900 g离心5分钟以上。将细胞沉淀重悬浮，以 进行后续分析。富集后，可以用10mlTris-Glycine (pH2.5)洗涤亲和柱 以除去所有的结合分子，然后用PBS (pH7.4)进行中和以备重新使用。
实施例3、利用掺加研究验证本发明的富集方法的收率 用4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)预先标记靶细胞(例如可从ATCC 获得的HeLa细胞或MCF-7细胞)然后掺入人血中，使用实施例1所述的 方法富集掺加的细胞。平均回收率为约70% 80%。与现有技术中利用 Miltenyi's试剂盒去除白细胞的富集方法相比，本发明的富集方法显著降低 了成本(本发明富集方法的成本为RMB 100-200/试验；而利用Multiny's试 剂盒的仅去除白细胞的成本就为RMB 600-700/试验)、縮短了时间(本发 明的富集方法每个试验需不到1小时即可完成去除红细胞和白细胞；而 Multiny's试剂盒仅去除白细胞就需超过4小时/试验)、而且效率高(本发 明方法的WBC去除率可达约3-4 logs;而Multiny's试剂盒的WBC去除 率仅为约2-3 logs)。
权利要求
1、一种从生物学样品富集靶细胞的方法，该方法包括用基于摩尔渗透压浓度的方式除去红细胞和用免疫亲和层析法除去白细胞。
2、 如权利要求1所述的方法，其中所述的生物学样品是体液；优选所 述的体液是血液、骨髓、脊髓或手术液。
3、 如权利要求2所述的方法，其中所述的血液是取血当天的新鲜血液。
4、 如权利要求l所述的方法，其中所述免疫亲和层析法中所使用的免 疫颗粒的尺寸为1 pm 20 pm，进一步优选为5 pm 10 更进一步优选 所述的免疫颗粒具有可再生性。
5、 如权利要求1所述的方法，其中所述基于摩尔渗透压浓度的方式包 括沉淀和裂解红细胞。
6、 如权利要求l所述的方法，其中所述免疫亲和层析法中所使用的抗 体为识别在白细胞上表达的抗原的抗体；优选所述抗体为抗CD45抗体；更 优选所述抗CD45抗体偶联到Affi-Gd 10基质上；进一步优选所述CD45 抗体为抗CD45单抗。
7、 如权利要求1所述的方法，该方法所获得的靶细胞适于后续分析、 操作或应用，所述后续分析、操作或应用为以下之一流式细胞术、聚合 酶链式反应、免疫荧光、免疫细胞化学、图像分析、酶学测定、炎症研究、 基因表达谱分析、治疗效力测验、细胞培养和细胞治疗。
8、 如权利要求1所述的方法，其中所述的靶细胞包括干细胞、胎儿细 胞、循环肿瘤细胞、免疫细胞中的至少一种。
9、 如权利要求l所述的方法，该方法还包括除去血浆蛋白；优选回收 所除去的白细胞和/或所除去的血浆蛋白。
10、 一种从生物学样品除去白细胞的方法，该方法包括采用抗CD45 抗体偶联的Affi-Gd 10除去白细胞。
全文摘要
本发明涉及从生物学样品富集靶细胞的方法及除去白细胞的方法。具体地说，本发明提供一种从生物学样品富集靶细胞的方法，该方法包括用基于摩尔渗透压浓度的方式除去红细胞和用免疫亲和层析法除去白细胞。该方法不仅成本低，而且高效地去除白细胞和红细胞，从而使靶细胞得以富集，并易于后续检测。本发明还提供一种从生物学样品除去白细胞的方法，该方法包括采用抗CD45抗体偶联的Affi-Gel 10除去白细胞。
文档编号C12M1/12GK101469310SQ20071030741
公开日2009年7月1日 申请日期2007年12月28日 优先权日2007年12月28日
发明者赵海峰 申请人:北京百奥科生物技术有限公司