专利名称：用于四种细菌pcr检测的多重扩增内标的制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种食品安全技术领域的方法，具体地说，是一种用于四种 细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方法。
技术背景金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella)、单 核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)与副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是四种重要的食源性致病菌是公知公开的菌种，它广泛分布 于自然界，它们主要是通过食品(特别是动物性食品)传播、感染人体，直接造 成人体健康损害。PCR (聚合酶链式反应)技术具有操作简便、快速、灵敏度高、 特异性强等特点，现在已广泛应用于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生 李斯特菌和副溶血弧菌的检测。但PCR方法在不同的实验室或检测部门所检测的 目的基因和操作流程有一定的差异，没有形成标准，得到的检测结果也不尽相同。 近年来的实践应用表明，食品和培养基中存在的抑制剂可影响PCR反应，使检测 结果呈假阴性。尽管PCR方法在不断的改进和完善，却不能有效地阻止假阴性结 果的发生。为了解决常规PCR方法中普遍存在的假阴性问题，近几年在PCR扩增 体系中引入了扩增内标(IAC)。大多数学者认为在PCR体系中加入扩增内标能 有效避免假阴性现象的出现，是PCR检测标准化的措施之一。制备IAC的方法有 很多，根据不同的实验目的和要求采用不同的制备方法。初期的扩增内标是利用 克隆技术将目标序列的PCR产物通过插入、删除或者替换等手段处理后制备的， 制备方法较烦琐，且制备的扩增内标仅能用于单一微生物的检测。经对现有技术的文献检索发现，Younes Maaroufi等在《FEMS Immunol Med Microbiol》(免疫医学微生物学)2006年第48期183-191页上发表的 "Development of a multiple internal control for clinical diagnostic real—time amplification assays"(—禾中运用于临床诊断突光定量PCR体系的 多重扩增内标)，该文中提出一种多重扩增内标(mIAC)的合成方法，方法为通过重叠PCR技术将5种病毒的检测引物序列合成到一条核苷酸序列中构建多重 扩增内标，通过一条多重扩增内标可用于5种病毒的检测。但无法用于金黄色葡 萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和副溶血弧菌普通PCR检测。 发明内容本发明的目的在于填补国内在多重扩增内标研究上的空白，提供一种用于四 种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方法。本发明利用生物信息学的方法，根 据金黄色葡萄球菌vicK基因、沙门氏菌irwA基因、单核细胞增生李斯特菌hlyA 基因和副溶血弧菌toxR基因设计特异性检测引物，根据这四对引物序列运用重 叠PCR技术人工合成了一种多重扩增内标，可分别用于金黄色葡萄球菌、沙门氏 菌、单核细胞增生李斯特菌和副溶血弧菌的普通PCR检测，在确保检测准确性与 高效性的同时大大降低检测成本，填补了国内在多重检测内标研究上的空白。本发明通过以下技术方案实现的，包括以下步骤第一步，利用生物信息学的方法，根据金黄色葡萄球菌vicK基因、沙门氏 菌irwA基因、单核细胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因设计特 异性检测引物；第二步，采用重叠PCR技术将金黄色葡萄球菌vicK基因、沙门氏菌irwA 基因、单核细胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因的特异性检测引 物序列拼接成一条核苷酸片段，构建多重扩增内标；第三步，采用分子生物学技术将该人工序列克隆到质粒载体pMD-18T，构建 含多重扩增内标序列的质粒pMD-mIAC;第四步，多重扩增内标分别在金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李 斯特氏菌和副溶血弧菌检测中的验证。所述的特异性检测引物，是指四对分别用于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、 单核细胞增生李斯特菌、副溶血弧菌PCR检测的检测引物(vicKF/vicKR、 invAF/invAR、 toxRF/toxRR、 hlyAF/hlyAR)，进行PCR检测时，上述引物能扩增 到金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血弧菌菌株特有的 检测基因，或者是PCR体系中添加的扩增内标。所述的重叠PCR技术，是指采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了 重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。所述的多重扩增内标，是指人工合成DNA片段，该片段是通过重叠PCR技术人工合成的，其中包含金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌 和副溶血弧菌的特异检测引物序列，在确保扩增效率的同时减少了非目标菌(大肠杆菌、奇异变形杆菌、空肠弯曲杆菌、肠球菌等)的DNA对PCR检测的干扰。 其用途是显示假阴性的发生，增加PCR检测的准确率，可分别用于金黄色葡萄球 菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血弧菌普通PCR检测。所述的分子生物学技术，具体如下采用转基因方法转移上述带有扩增内标 的载体到大肠杆菌(E. coli TG-1)中，然后涂布于90ram选择性平板上，其中 含有100mg/ml氨苄青霉素10 P 1 ， 20%的IPTG溶液7 u 1 ， 2%的X-gal溶液40 y 1 ， 经37'C培养12h。用灭菌的牙签从选择性平板上挑取白色菌落，接菌到装有5ml LB培养液的PA瓶中，再在37'C下以150r/min摇床培养8h，提取质粒pMD-mlAC， 经PCR扩增后，确定获得转化子。所述的载体，其转化的宿主细胞，在实例中它是大肠杆菌，其中包含有扩增 内标的DNA片段。所述的多重扩增内标的验证，是指通过将含多重扩增内标的质粒pMD-mIAC 添加到普通PCR反应体系中，可以用相应检测引物与目的基因同时进行扩增，多 重扩增内标与目的基因可扩增出大小不同的DNA片段。当样品中含有的目的基因 时，电泳结果中含有目的基因和多重扩增内标的扩增片段，检测结果呈阳性；当 样品中不含目的基因时，电泳结果中只有扩增内标的扩增片段，检测结果为阴性； 当电泳结果中不含有任何扩增片段时，检测结果即为假阴性。所述的目的基因，是指金黄色葡萄球菌vicK基因、沙门氏菌invA基因、 单核细胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因。所述的假阴性，是指PCR反应受到了食品或培养基等物质中存在的抑制剂的 影响而没有发生反应，或者是由于操作人员的操作失误导致结果呈现阴性。本发明构建了可分别用于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特 菌和副溶血弧菌普通PCR检测的多重扩增内标。本发明利用生物信息学的方法， 根据金黄色葡萄球菌vicK基因、沙门氏菌irwA基因、单核细胞增生李斯特菌 hlyA基因、副溶血弧菌toxR基因设计特异性检测引物，根据这四对引物序列运用重叠PCR技术人工合成了 一种多重扩增内标，在确保目标序列扩增效率的同时 与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血弧菌及其它细菌 的基因组非同源。本发明将所构建的扩增内标片段添加到PCR反应体系中，有助 于检测时显示假阴性的发生，从而提高PCR检测的准确率，为满足检疫执法过程 中所急需的对食源性致病菌调查和检测提供有效可靠的技术手段。在本发明中，可选用本领域己知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘 粒等。将用于作为扩增内标的基因序列可操作地连于表达调控序列，从而带有扩 增内标的载体。
图l多重扩增内标的序列特征图中左侧从外至内依次为金黄色葡萄球菌引物vicKF、单核细胞增生李斯 特菌引物hlyAF、沙门氏菌引物invAR和副溶血弧菌引物toxRR;右侧从外至内 依次为金黄色葡萄球菌引物vicKR、单核细胞增生李斯特菌引物hlyAR、副溶血 弧菌引物toxRF和沙门氏菌引物invAF。图2重叠PCR方法合成多重扩增内标示意中引物0P1与0P2、 0P3与0P4互为模板分别经过第一轮PCR扩增，将 两组扩增产物混合后进行第二论PCR扩增，取第二轮扩增产物为模板，以引物 0P5与0P6进行第三轮PCR扩增，其产物即为所需的多重扩增内标序列。图3大肠杆菌阳性克隆进行PCR检测结果示意中电泳泳道l:以金黄色葡萄球菌引物vicKF/vicKR扩增结果(221bp)。 M: 100bp DNA分子量标准。图4添加多重扩增内标的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯 特菌和副溶血弧菌PCR检测验证结果示意中电泳泳道l:以单核细胞增生李斯特菌DNA为模板；电泳泳道2:以 沙门氏菌DNA为模板；电泳泳道3:以副溶血弧菌DNA为模板；电泳泳道4:以金黄色葡萄球菌DNA为模板；5-8:阴性对照；M: 100bp DNA分子量标准。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案 为前提下进行实施，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。以下 是实力给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但保护范围不限于下述的实施 例。实施例一、特异性检测引物的设计利用生物信息学分别对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特 菌和副溶血弧菌的已知特异基因进行分析，从中选出用于检测的目的基因vicK、 invA、 hlyA、 toxR。通过Genbank中公用的BLAST软件(为现有技术，共用免费)， 将vicK、 invA、 hlyA、 toxR基因的序列分别与其他微生物进行比对，选出特异 性较高的序列区段。然后用软件Primer 5. 0 (为现有技术，市售，Premier公司， 加拿大)在这段特异序列中设计一对内标引物。引物序列如下-1. 金黄色葡萄球菌检测引物(vicKF/vicKR) vicKF: 5， _ CGCAGGCTAATACTGAAAG -3，vicKR: 5， -TTCTGTTTCTTCACGGGTA _3，(a) 检测目的基因的序列特征*长度512碱基对 *类型核酸*链型双链 *拓扑结构线形(b) 分子类型DNA(C) 最初来源金黄色葡萄球菌2. 沙门氏菌检测引物(invAF/invAR)invAF: 5， -GTCACCGTGGTCCAGTTTA -3，invAR: 5， -CGACAAGACCATCACCAAT -3， (a)检测目的基因的序列特征-*长度361碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线形 (b) 分子类型DNA (C) 最初来源沙门氏菌3. 单核细胞增生李斯特菌(hlyAF / hlyAR) hlyAF: 5' _ TATCCAGGTGCTCTCGT _3，hlyAR: 5， - ACTGTAAGCCATTTCGTC -3'(a) 检测目的基因的序列特征*长度264碱基对*类型核酸 *链型双链 *拓扑结构线形(b) 分子类型DNA(C) 最初来源单核细胞增生李斯特菌4. 副溶血弧菌(toxRF / toxRR) toxRF: 5， -CAAATAGTAATTCGCTCGCAG-3，toxRR: 5， -ATTCACAGCAGAAGCCACAG-3 ，(a) 检测目的基因的序列特征*长度473碱基对 *类型核酸*链型双链 *拓扑结构线形(b) 分子类型DNA(C) 最初来源副溶血弧菌二、多重扩增内标的序列的设计多重扩增内标的序列特征(如图l):*长度221碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线形(b)分子类型DNA(C)最初来源人工合成(d) 序列描述SEQ ID NO. 1:TACCCGTGAAGAAACAGAA三、采用重叠PCR技术合成多重扩增内标1. 根据内标序列设计重叠PCR引物将人工设计的扩增内标DNA序列按重叠PCR的要求分成六段，每段均作为 引物用于扩增内标的合成，具体引物序列如下0P1:TATCCAGGTGCTCTCGTCGACGACAAGACCATCACCAATTCACAGCAGAAGCCACAGCA OP 2:GATGATGTGGGCGGCGAGTGCTCCTATAGATGCTGGTGGTGCCATGCTGTGGCTTCTGC OP 3:GAGCACTCGCCGCCCACATCATCGAAAAGMACACGCGGATGTAAACTGGACCACGGTG OP 4:CTGTAAGCCATTTCGTCGAATTCAAATAGTAATTCGCTCGCAGTCACCGTGGTCCAGTT OP 5: CGCAGGCTAATACTGAAAGTATCCAGGTGCT OP 6: TTCTGTTTCTTCACGGGTACTGTAAGCCATT2. 采用重叠PCR方法合成多重扩增内标，具体过程如图2: 第一轮PCR扩增确定的反应体系如下第一组 第二组 10 X buffer (含Mg") 5.0 y 1 5.0uld證(2. 5 mM) 2. On 1 2. On 1引物(各lOyM) 0P1: lul + 0P2: lul 0P3: lul+0P4: 1 y 1Taq DNA聚合酶(2. 50.5yl 0.5ylU/u 1)补无菌水至 50 ul 50 ulPCR循环参数为在94。C预变性3min，接着作15个循环，每个循环的程序 包括94'C变性30s，退火温度45°C-60°C (每个循环升高1°C )，退火时间为60s， 然后在72'C延伸30s，循环结束后降温至4'C，结束所有操作程序。 第二轮PCR扩增将上述两组PCR产物混合，取50 y 1进行第二轮PCR反应。 PCR循环参数为在94。C预变性3min，接着作15个循环，每个循环的程序 包括94。C变性30s，退火温度45°C-60°C (每个循环升高1°C)，退火时间为60s， 然后在72'C延伸30s，循环结束后在72'C延伸5min,最后降温至4'C，结束所 有操作程序。第三轮PCR扩增取第二轮PCR产物0.2y l作为模板，反应体系如下 10 X buffer 5.0p1MgCl2溶液(25 mM) dNTP (2. 5 mM) 上下游引物(各10uM) Taq DNA聚合酶(2. 5U/ii 1) 模板3.0p 1 2. Oy 1 0P5: lyl+0P6: lul 0. 5u 1 0. 2ii 1补无菌水至50 ulPCR循环参数为在94。C预变性3min，接着作30个循环，每个循环的程序 包括94。C变性30s，退火温度55。C，退火时间为30s，然后在72。C延伸30s，循 环结束后在72X:延伸10min，最后降温至4'C，结束所有操作程序。3. 连接按PCR回收试剂盒说明书回收第三轮PCR扩增产物片段。回收的扩增产物 片段与pMD-18T载体在连接缓冲液作用下16。C过夜。4. 转化大肠杆菌用氯化钙法转移上述带有扩增内标的载体到大肠杆菌E. coli TG-1中，然 后涂布于90mm选择性平板上，其中含有100mg/ml氨苄青霉素10u 1，20%的IPTG 溶液7ul和2。/。的X-gal溶液40u 1，经过37'C培养12h，用灭菌的牙签从选择 性平板上挑取白色菌落用于阳性克隆的检测。5.检测将上述白色菌落接种到装有5ml LB培养液的PA瓶中，在37。C下150r/min摇床培养8h，提取质粒pMD-mIAC，利用特异引物(vicKF和vicKR)对提取的质粒进行PCR检测，具体结果如图3。 四、多重扩增内标的验证1. 多重扩增内标在金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和 副溶血弧菌PCR检测中的扩增大小分别为221bp、 121bp、 184 bp、 124bp。2. 分别提取多重扩增内标和金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李 斯特菌和副溶血弧菌的DNA稀释备用。3. 将多重扩增内标分别加入到金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生 李斯特菌和副溶血弧菌各自的PCR反应体系中。确定的反应体系如下10X buffer2. 5p 1MgCl2溶液(25 mM)1. 1dNTP (2. 5 mM)1. Oy 1上下游引物(各10yM)0. 1 + 0. 1多重扩增内标lu 1Taq DNA聚合酶(1 U/n 1)lu 1模板5. On 1补无菌水至25 ulPCR循环参数为在95'C预变性3min，接着作35个循环，每个循环的程序 包括95。C变性30s，退火温度56。C，退火时间为30s，然后在72。C延伸30s，循 环结束后在72'C延伸10min，最后降温至4'C，结束所有操作程序。扩增结果如图4所示，以金黄色葡萄球菌DNA为模板能扩增出512bp的目标序列特异产物和221bp的扩增内标产物；以沙门氏菌DNA为模板能扩增出 361bp的目标序列特异产物和121bp的扩增内标产物；以单核细胞增生李斯特菌 DNA为模板能扩增出264bp的目标序列特异产物和184bp的扩增内标产物；以副 溶血弧菌基因组DNA为模板皆能扩增出473bp的目标序列特异产物和124bp的扩 增内标产物。因此，本发明成功的构建了一段可分别用于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、 单核细胞增生李斯特菌和副溶血弧菌普通PCR检测的多重扩增内标，填补了国内 在多重检测内标研究上的空白，有助于检测时显示假阴性的发生，在确保检测准 确性与高效性的同时大大降低检测成本，为满足检疫执法过程中所急需的对食源 性致病菌调査和检测提供有效可靠的技术手段。本发明涉及的序列及记号分列如下 〈110〉上海交通大学<120〉用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方法<160> 15<170> Patentln version 3.4〈210〉 1<211〉 221〈212〉 DNA <213〉人工序列〈220〉<223〉采用重叠PCR技术合成的用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标序列 〈400〉 1cgcaggctaa tactgaaagt atccaggtgc tctcgtcgac gacaagacca tcaccaattc 60 acagcagaag ccacagcatg gcaccaccag catctatagg agcactcgcc gcccacatca 120 tcgaaaagaa acacgcggat gtaaactgga ccacggtgac tgcgagcgaa ttactatttg 180 aattcgacga aatggcttac agtacccgtg aagaaacaga a 221<210〉 2〈211〉 59〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈220〉〈223〉用于多重扩增内标合成的重叠PCR引物0P1〈400〉 2tatccaggtg ctctcgtcga cgacaagacc atcaccaatt cacagcagaa gccacagca 59〈210〉 3〈211〉 59<212〉 DNA <213>人工序列〈220〉〈223〉用于多重扩增内标合成的重叠PCR引物0P2<400〉 3gatgatgtgg gcggcgagtg ctcctataga tgctggtggt gccatgctgt ggcttctgc 59<210〉 4<211> 59〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈220〉<223>用于多重扩增内标合成的重叠PCR引物0P3〈400〉 4gagcactcgc cgcccacatc atcgaaaaga aacacgcgga tgtaaactgg accacggtg 59〈210〉 5<211〉 59<212〉 DNA <213〉人工序列〈220〉<223〉用于多重扩增内标合成的重叠PCR引物0P4〈400〉 5ctgtaagcca tttxgtcgaa ttcaaatagt aattcgctcg cagtcaccgt ggtccagtt 59〈210〉 6<211〉 31〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈220〉〈223〉用于多重扩增内标合成的重叠PCR引物OP5<> 6cgcaggctaa tactgaaagt atccaggtgc t 31〈210〉 7〈211〉 31〈212〉 DNA 〈213>人工序列<220〉<223>用于多重扩增内标合成的重叠PCR引物0P6 〈400〉 7ttctgtttct tcacgggtac tgtaagccat t 31<210> 8〈211〉 19〈212〉 DNA<213〉 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) <220>〈223〉金黄色葡萄球菌上游检测引物<400> 8cgcaggctaa tactgaaag 19〈210〉 9〈211〉 19<212〉 DNA〈213〉 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 〈220〉〈223〉金黄色葡萄球菌下游检测引物〈400〉 9ttctgtttct tcacgggta 19<210〉 10〈211〉 19〈212〉 ■〈213〉 沙门氏菌(Salmonella) <220>〈223〉沙门氏菌上游检测引物〈400〉 10gtcaccgtgg tccagttta 19〈210〉 11〈211〉 19〈212〉 DNA〈213〉 沙门氏菌(Salmonella)<220〉<223〉沙门氏菌下游检测引物<400〉 11cgacaagacc atcaccaat 19<210〉 12<211〉 17〈212〉 DNA<213> 单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes) 〈220〉<223>单核细胞增生李斯特菌上游检测引物〈400〉 12tatccaggtg ctctcgt 17<210〉 13<211〉 18<212〉 DNA〈213〉 单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes) 〈220〉〈223〉单核细胞增生李斯特菌下游检测引物〈400> 13actgtaagcc atttcgtc 18<210> 14<211〉 21<212> 薩〈213〉 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) 〈220〉〈223>副溶血弧菌上游检测引物<400〉 14caaatagtaa ttcgctcgca g 21<210> 15<211> 20<212〉 腿〈213> 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) 〈220><223>副溶血弧菌下游检测引物<400〉 15attcacagca gaagccacag 20
权利要求
1、一种用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方法，其特征在于，包括以下步骤第一步，利用生物信息学的方法，根据金黄色葡萄球菌vicK基因、沙门氏菌invA基因、单核细胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因设计特异性检测引物；第二步，采用重叠PCR技术将金黄色葡萄球菌vicK基因、沙门氏菌invA基因、单核细胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因的特异性检测引物序列拼接成一条核苷酸片段，构建多重扩增内标；第三步，采用分子生物学技术将该人工序列克隆到质粒载体pMD-18T，构建含多重扩增内标序列的质粒pMD-mIAC；第四步，多重扩增内标分别在金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和副溶血弧菌检测中的验证。
2、 根据权利要求1所述的用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方 法，其特征是，所述的特异性检测引物，是指四对分别用于金黄色葡萄球菌、 沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血弧菌PCR检测的检测引物 vicKF/vicKR、 invAF/invAR、 toxRF/toxRR、 hlyAF/hlyAR，进行PCR检测时，上 述引物能扩增到金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血弧 菌菌株特有的检测基因，或者是PCR体系中添加的扩增内标。
3、 根据权利要求1所述的用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方 法，其特征是，所述的重叠PCR技术，是指采用具有互补末端的引物，使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的 扩增片段重叠拼接起来。
4、 根据权利要求1所述的用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方 法，其特征是，所述的多重扩增内标，是指人工合成DNA片段，该片段是通过 重叠PCR技术人工合成的，其中包含金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生 李斯特菌和副溶血弧菌的特异检测引物序列，在确保扩增效率的同时减少了非目标菌的DNA对PCR检测的干扰。
5、 根据权利要求1所述的用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方法，其特征是，所述的分子生物学技术，具体如下采用转基因方法转移上述带有扩增内标的载体到大肠杆菌E. coli TG-1中，然后涂布于选择性平板上，经 37t:培养12h，用灭菌的牙签从选择性平板上挑取白色菌落，接菌到装有5mlLB 培养液的PA瓶中，再在37。C下以150r/min摇床培养8h，提取质粒pMD-mIAC， 经PCR扩增后，确定获得转化子。
6、 根据权利要求5所述的用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方 法，其特征是，所述的选择性平板，是指90mm选择性平板，其中含有100mg/ml 氨苄青霉素10ul， 20%的IPTG溶液7u 1， 2M的X-gal溶液40ul。
7、 根据权利要求1所述的用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方 法，其特征是，所述的载体，其转化的宿主细胞，是大肠杆菌，其中包含有扩增 内标的DNA片段。
8、 根据权利要求1所述的用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方 法，其特征是，所述的多重扩增内标的验证，是指通过将含多重扩增内标的质 粒pMD-mIAC添加到普通PCR反应体系中，用相应检测引物与目的基因同时进行 扩增，多重扩增内标与目的基因可扩增出大小不同的DNA片段，当样品中含有的 目的基因时，电泳结果中含有目的基因和多重扩增内标的扩增片段，检测结果呈 阳性；当样品中不含目的基因时，电泳结果中只有扩增内标的扩增片段，检测结 果为阴性；当电泳结果中不含有任何扩增片段时，检测结果即为假阴性。
9、 根据权利要求8所述的用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方 法，其特征是，所述的假阴性，是指PCR反应受到了食品或培养基等物质中存在 的抑制剂的影响而没有发生反应，或者是由于操作人员的操作失误导致结果呈现 阴性。
10、 根据权利要求8所述的用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方 法，其特征是，所述的目的基因，是指金黄色葡萄球菌vicK基因、沙门氏菌 invA基因、单核细胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因。
全文摘要
本发明涉及一种食品安全技术领域的用于四种细菌PCR检测的多重扩增内标的制备方法，步骤为根据金黄色葡萄球菌vicK基因、沙门氏菌invA基因、单核细胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因设计特异性检测引物；采用重叠PCR技术将金黄色葡萄球菌vicK基因、沙门氏菌invA基因、单核细胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因的特异性检测引物序列拼接成一条核苷酸片段，构建多重扩增内标；将该人工序列克隆到质粒载体pMD-18T，构建含多重扩增内标序列的质粒pMD-mIAC；多重扩增内标分别在金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和副溶血弧菌检测中的验证。本发明在确保检测准确性与高效性的同时大大降低检测成本。
文档编号C12Q1/68GK101220393SQ200810032998
公开日2008年7月16日 申请日期2008年1月24日 优先权日2008年1月24日
发明者史贤明, 张忠明, 施春雷, 马瑜丹, 飞 龙 申请人:上海交通大学