非洲爪蟾xpapc基因启动子及其组织特异性增强子的制作方法

专利名称：非洲爪蟾xpapc基因启动子及其组织特异性增强子的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，更具体地，本发明涉及非洲爪蟾非洲爪蟾轴 旁原钙粘连蛋白基因(Je/ o/ iA5尸araWa7尸rotoca必eri/j (J7M/^)启动子及其用途。
背景技术：
细胞生物的早期发育中，原肠运动是最基本的形态发生事件之一。通过原 肠运动中精细调控的大规模细胞迁移和重排，胚胎的体轴得以建立，即将形成 的三个胚层的边界也得以确定。非洲爪蟾le"o/ "s 作为两栖动物的代 表被广泛地使用来研究原肠运动中细胞的运动和分子机制。通过使用各种显微 成像技术，非洲爪蟾胚胎原肠运动中的细胞迁移已经被详细地观察和描述。然 而，关于这些运动的动力来源和调控这些运动的分子机制还所知不多。
在非洲爪蟾胚胎中，包括原钙粘连蛋白(尸r"oca必e/v'/7)、整联蛋白 (integrins)和纤连蛋白(f ibronectin)在内的结构分子都参与原肠运动中的 细胞迁移。非洲爪蟾的Je/ o/3fAS尸ara;o'a7尸r"oca必arj'/ (J尸力/"基因是一个 原钙粘连蛋白基因，它在进行原肠运动的胚胎中首先表达在Spemann组织者 (Spemann organizer),随后表达在轴旁中胚层。先前的研究表明i7M尸C在原 肠运动中能促进汇聚伸展运动(convergent extension, CE)，此外，也 参与中胚层和内胚层之间的组织分离(tissue s印aration)、体节形成 (somitogenesis)以及器官发生(organogenesis)。与其它的粘附分子类似， J/^4尸C作为细胞结构分子的同时也作为信号通路的成员参与生物学事件。最近 的研究工作揭示J/M,C通过与非经典Wnt信号通路相互作用以及下调细胞内 C-cadherin分子的粘附能力来调控细胞的粘附能力和迁移。此外，Chung等人 最近发现J7M尸C与FGF信号通路的下游基因^W5在原肠运动中存在具有生物 学意义的相互作用。然而除了 r/7tfe和Zi历7被研究证实能激活i7M/^的表达 之外，关于7/M/^的表达调控机制仍然是一个有待研究的问题。

发明内容
本发明的目的在于提供非洲爪蟾近轴原钙粘连蛋白基因(XPAPC)的启动子 及其用途。
本发明的另一目的在于提供含有所述启动子的表达载体和宿主细胞。 在本发明的第一方面，提供一种分离的核酸(启动子)序列，所述核酸序列
选自下组
(1) 具有SEQ ID NO: 1中所示的核酸序列；
(2) 具有SEQ ID NO: 1中第(50±49)- (4724±49)位所示序列的核酸序列 (较佳是由SEQIDNO: 1第(50±49)-(4724±49)位所示序列组成的核酸序列); 或
(3) 与(1)或(2)限定的核酸序列有95%以上(优选99%以上)相同性且具有 指导目的基因表达功能的核酸序列。
在另一优选例中，(2)项中，具有SEQ ID NO: l中第(20± 19)-(4754± 19) 位所示序列的核酸序列。更优选的，是由SEQ ID NO: 1中第(20± 19)-(4754± 19)位所示序列组成的核酸序列。
在另一优选例中，(2)项中，具有SEQ ID NO: 1中第(10±9)-(4764±9) 位所示序列的核酸序列。较佳是由SEQ ID NO: 1中第(10±9)-(4764±9)位所 示序列组成的核酸序列。
在本发明的第二方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的核酸序列， 作为启动子元件。
在另一优选例中，所述的载体还含有与所述的核酸序列可操作地连接的目 的基因序列。
在另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。
在另一优选例中，所述的目的基因序列位于所述核酸序列的下游，且是与 所述的核酸序列直接邻近的编码基因的序列。
在另一优选例中，所述的核酸序列与目的基因序列的间隔是0-100bp(优选 的，为0-50bp;更优选的，为0-20bp)。
在另一优选例中，所述的目的基因包括(但不限于)轴旁原钙粘连蛋白基 因(尸araxia7尸r"oca必ari/ (Z^尸0)、荧光素酶基因、荧光蛋白基因。在另一优选例中，所述的轴旁原钙粘连蛋白基因(化raA^37尸rotoca必er^7 (尸/l尸6))是非洲爪蟾近轴原钙粘连蛋白基因(Je/7o/ws /^」ra义/a7 ,r"oca必or//7 (X/W56))。
在本发明的第三方面，提供一种细胞(优选遗传工程化的细胞)，所述的细 胞含有所述的载体。
在本发明的第四方面，提供所述的核酸序列的用途，所述的核酸序列用于 作为启动子元件，指导目的基因的表达。
在另一优选例中，所述的核酸用于指导目的基因按照轴旁原钙粘连蛋白基 因体内表达方式表达。
在另一优选例中，所述的目的基因包括(但不限于)轴旁原钙粘连蛋白基 因(尸arax/a7尸r"oc3必eh/7 ("尸0)、荧光素酶基因、荧光蛋白基因。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。


图1显示了 XPAPC上游DNA序列的分子克隆和转录活性分析。
(A) 不同XPAPC启动子缺失构建体的荧光素酶活性。
(B) 检测XPAPC基因组序列是否存在内含子。
图2显示了转基因胚胎中启动子驱动的GFP mRNA的表达在空间和时间特 异性上重演内源性XPAPC的表达。
(A-E)内源性XPAPC mRNA在各期(St)的表达。 (F-J)pFL GFP在同时期转基因胚胎中的表达。 其中，(A-B和F-G)背面朝上，从植物极看； 其中，(C和H)神经轴胚前面朝上，背面观； 其中，(D和I)神经轴胚前面在左侧，侧面观； 其中，(E和J)蝌钭的侧面观，前面在左侧。
具体实施例方式
本发明人通过广泛而深入的研究，首次从爪蟾基因组中分离到一种核酸， 该核酸位于非洲爪蟾近轴原钙粘连蛋白基因(XPAPC基因)的上游，将其作为启
动子元件，可指导目的基因(如报告基因)的表达。所述的核酸包含了指导XPAPC 在从原肠早期到尾芽期特异表达所需的调控元件，从而可用于研究在胚胎发育
期间特定基因(如XPAPC)的表达调控情况以及其它因素对特定基因的表达。在
此基础上完成了本发明。
如本文所用，所述的"启动子"或"启动子区(域)"是指一种核酸序列， 其通常存在于目的基因编码序列的上游(5，端)，能够引导核酸序列转录为 mRNA。 一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的 其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体， 其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然 的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸 和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在 的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，所述的"可操作地连接"是指两个或多个核酸区域或核酸序 列的功能性的空间排列。例如启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特 定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被 "可操作地连接"到该核酸序列上。
启动子及其指导的基因表达
本发明人在研究过程中，首次从XPAPC基因的上游克隆到一段可良好地指 导外源基因表达的核酸(启动子)，利用该启动子来指导报告基因的表达，可良 好地模拟XPAPC的内源表达情况。在本发明的实施例中，本发明人证明了利用 所述启动子指导的GFP的表达能够完全模拟内源XPAPC的表达，说明该片段包 含了指导XPAPC在从原肠早期到尾芽期特异表达所需的所有调控元件，从而改 变了目前现有技术中具体体内对XPAPC基因有调控作用的核酸序列未知的现
6状。
因此，本发明提供一种分离的核酸(启动子)，所述的核酸具有SEQIDN0: 1所示的序列，或具有SEQ ID NO: 1中第(50±49)-(4724±49)位所示的核苷 酸序列，所述的核酸可作为指导目的基因表达的启动子元件。
此外，本发明还包括上述核酸的一些具有相同功能的变异体。包括序列 与SEQ ID N0: 1或SEQ ID NO: 1中第(50±49) -(4724±49)位所示的序列有 95%以上(优选99%)同源性且具有指导目的基因表达功能的核酸。
本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启 动子而言可以是外源(异源)的。所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(如 一种结构性核酸序列)；所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，例如 某些具有重要特性或功能的蛋白；或者所述目的基因是在转录或表达后可以发 挥指示作用的基因，如报告基因。
例如，所述的目的基因包括但不限于非洲爪蟾轴旁原钙粘连蛋白基因、 荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因。
本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目 的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种 期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加必需氨基酸的含量，提高氨基 酸序列的翻译，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外， 改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号等。
此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动 子连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技 术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。
本发明的启动子还可用于指导外源基因的表达，研究中胚层发育以及内耳 发育过程中重要分子的功能、发育缺陷动物模型的建立以及发育缺陷的基因治 疗等。
本发明的启动子和目的基因序列可被包含在重组载体中。 所述的重组载体一般包括(从5'到3'方向)引导目的基因转录的启动子， 和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3'转录终止子，3'多聚核 苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。
用于制备重组载体的方法是本领域技术人员所熟知的。术语"表达载体" 指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。 总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。 优选的，所述的表达载体是真核表达载体。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或 目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、
体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择 转化的宿主细胞的表型性状，所述的标记基因如二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、 潮霉素抗性等。
重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。
所述的其它启动子例如是组织特异性的、组成型的或诱导型的。
作为本发明的一种实例，所述的载体是pGL3-Basic，其本身含有编码荧光 素酶基因的序列。通过改造，即利用pGL3-Basic上的多克隆位点，可将本发 明的启动子区域构建到荧光素酶编码基因的前面，转化宿主细胞，启动子将激 活荧光素酶编码基因的表达，所述启动受到启动子区各顺式作用元件的调控， 模拟了基因在体内被激活转录的状况。
包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细 胞，或转化入受精卵或胚胎内，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞； 或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有大肠杆菌，酵母，动物的组 织细胞等。受精卵或胚胎可以是两栖类动物的受精卵或胚胎，例如是非洲爪蟾 的受精卵或胚胎。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序 列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300 个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子或宿主 细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿 主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获， 用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如 果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA 转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装 等。
重组DNA转化受精卵或胚胎的方法也是本领域已知的，通常可采用显微注 射技术。例如可按照Kroll KL等(1996). Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation. Development 122:3173-3183所描述的方法进行转基因操作。 用作转基因的质粒可预先进行线形化。
在本发明的实例中，在所述的启动子的指导下，可以使荧光素酶 (Luciferase)基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因良好地表达。因此可见，本发
明的启动子在基因表达调控的研究中具有重要的应用价值。
在本发明的实例中，将全长的XPAPC启动子荧光素酶分析质粒中荧光素酶 的编码序列用绿色荧光蛋白的编码序列替换后，得到了用于制备转基因爪蟾胚 胎的报告质粒。本发明人制备了不同时期的转基因爪蟾胚胎并用反应GFP表达 的探针进行了原位杂交实验。结果表明，在不同时期的转基因爪蟾胚胎，XPAPC 启动子可指导的GFP的表达模式与内源的XPAPC表达模式非常相似，这说明本 发明人得到的XPAPC启动子中包含了知道XPAPC在爪蟾胚胎早期表达所需要的 所有重要顺式作用元件。
本发明的主要优点在于
揭示一种可指导目的基因表达的启动子，利用本发明的启动子可以研究在 胚胎发育期间特定基因(如XPAPC)的表达调控情况以及其它因素(如一些信号 通路)对特定基因的表达。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York:
9Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。
实施例1胚胎培养和转基因方法
非洲爪蟾胚胎培养操作受精卵的培养如Fang PF等(2004) ， Multiple signaling pathways control Tbx6 expression during Xenopus myogenesis. Acta Biochim Bi叩hys Sin (Shanghai) 36:390-396中所描述的，分期依照 Niewkoop禾口 Faber (Normal Table of Xenopus Laevis， Garland Publishing, 1994)中所述。
非洲爪蟾转基因胚胎制备按照Kroll KL等(1996). Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation. Development 122:3173-3183所描述的 方法进行转基因操作，获得了转基因的胚胎。用作转基因的质粒用Smal消化 以线形化。每个质粒都进行了 3轮独立的转基因操作。
实施例2 XPAPC 5'上游调控序列的克隆
由于非洲爪蟾的基因组序列还未被测序完毕，本发明人通过独特设计克隆
了 i7M尸C的上游调控序列，具体如下
基因组DNA分离:取2g成年雄性爪蟾新鲜肝脏组织，放入研钵加入液氮 研磨充分，用酚/氯仿法抽提两遍，取上清用乙醇沉淀，75%乙醇洗一遍，干燥， 溶解在去离子水中，分光光度计定量。
连接:取1 基因组DNA用10 U的EcoR I消化过夜，取消化后1 基 因组DNA与50 mMPCR接头用T4 DNA连接酶16。C连接过夜，后用乙醇沉淀回 收，溶解在20 W去离子水中。
PCR采用的引物如下
APl(SEQ ID NO: 2): 5， -GTAATACGACTCACTATAGGC-3，；
AP2(SEQ ID NO: 3): 5' -ACAATAGGGCACGCGTGGT-3，；
GSPl(SEQ ID NO: 4) : 5' -CAACACTGCAATTACAGTGCCAGGGGGTTCTTCTTC-3';
GSP2(SEQ ID NO: 5) : 5' -GAGAAGCAGCATCTTGAAGAATCAAAGTTGCACC-3'。
API和AP2的引物基于基因组步行(Genome Walker)接头系统。两轮接头PCR (Adaptor PCR)分离扩增i7M/T 5，上游序列: 第一轮，采用50 W体系，用量如下
IOX缓冲液 5W;
dNTP 250W;
GSP1 10pM;
API 10pM;
连接了接头的消化后基因组DNA 100ng;
LA Taq聚合酶 2. 5U;
去离子水补足至 50W。
PCR程序
变性 94°C 3分钟；
第一步10个循环变性 94" 30秒；
退火 7CTC 30秒；
延伸 72°C 5分钟；
第二步30个循环变性 94°C 30秒
退火 60°C 1分钟
延伸 72 °C 5分钟
最后延伸 72°C IO分钟。 第二轮PCR :将第一轮PCR产物稀释100倍按以下比例加样，用量如下
用第
IOX缓冲液(加Mg" dNTP GSP2 AP2
第一轮PCR产物稀释100倍 LA Taq聚合酶 去离子水 一轮相同程序进行PCR。
5Pl; 250W;
10pM; 10pM;
100ng;
2, 5U;
补足至50W。
将第二轮PCR的产物用1%琼脂糖胶分离，鉴定发现4. 3 kb处有单一条带, 割胶回收，装入T-easy载体(Promega),测序。结果，长度为4914bp的DNA片段被克隆，如SEQ ID NO: 4所示。将其与 已公开的Xenopus PAPC基因的5'区域(参见Kim SH等(1998)， The role of paraxial protocadherin in selective adhesion and cell movements of the mesoderm during Xenopus gastrulation. Development 125:4681-4690)有 143bp的重叠。
实施例3含启动子及报告基因的载体的构建
前述获得的PCR扩增片段常规方法纯化后，通过常规PCR方法获得SEQ ID NO: 1中第1-4773位序列且两端携带Xhol/Hindlll酶切位点的片段，插入到 Xhol/Hindlll消化的PGL3-Basic(Promega，自带荧光素酶编码基因)中，得到 p-4773Luc构建体。
本发明人还利用Xbal/Hindlll酶切消化p-4773Luc，将其中的荧光素酶基 因去除，回收经加工的质粒；同时将绿色荧光蛋白(GFP)的编码序列(GFP编码 序列是从pCS2-GFP质粒(获自Ralph R叩p实验室)上用Xbal和HindIII切下) 装入到经前述经加工的载体中，得到转基因所用质粒p-4773GFP。
本发明人还构建了由SEQ ID NO: 1中第卜2920位序列构成的片段，采用 前述相同方法将该序列分别装入PGL3-Basic和绿色荧光蛋白(GFP)报告质粒中 的，从而获得测试质粒p-2920Luc和p-2920GFP。
上述构建的荧光素酶报告质粒将被用于确定报告基因的活性，而绿色荧 光蛋白报告质粒将被用于进行爪蟾转基因胚胎实验。
实施例4启动子的转录调控分析
为进行荧光素酶分析，将含有25pg不同荧光素酶测试质粒和25pg内标报 告基因pRL-SV40(购自Promega)的2nl溶液(溶剂为DEPC水)注射进四细胞期 胚胎的动物极。
为了分析所得到的1/M尸C5'上游序列是否具有转录活性，将前述构建的 p-4773Luc、 p-2920Luc载体、PGL3-Basic空载体(各25pg， 2nl)和内参对照 pRL-SV40(25pg， 2nl)分别注射到四细胞期的爪蟾胚胎动物极中，在第8. 5期 左右分离动物极帽，然后培养至12.5期，检测报告基因的荧光素酶活性。荧 光素酶分析用Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) 进行。
结果见图1A，显示i7M尸C5'上游序列片段有转录活性。在真核生物中，内含子(intron)，特别是第一个内含子，也有可能参与 基因表达的调控。为了检测X/M尸C的基因组序列中是否存在内含子，本发明人 进行了基因组PCR。
结果如图1B所示，在加入了特异结合于i7M尸0f放阅读框(open reading frame)起始位置和终止位置的引物(上游TTG TTT TAA ATG ACT GCA GGT CTG GAA GGA (SEQ ID NO: 6);下游CAG TTC CCA TTT TCT GGA CCCTTGTTGA(SEQ ID NO: 7))的PCR反应中，仅有一条长度为3. 6kb的片 段可以被扩增。通过将这个片段进行DNA测序表明J/M尸C基因组序列与其他的 一些原钙粘蛋白一样不包含内含子。
为了检测所得到的WM/r 5'上游调控序列是否能指导报告基因GFP在非 洲爪蟾胚胎中的表达，本发明人利用Sinai将包含上游调控序列的质粒 p-4773GFP (pFL-GFP)线性化，转入到爪蟾胚胎中，然后通过原位杂交检测报 告基因GFP在胚胎发育过程中的表达情况，并检测未转化胚胎的内源性XPAPC 的表达情况。XPAPC和GFP的转录用整体原位杂交的方法分别用XPAPC或GFP 探针检测。
mRNA模板的准备依照文献Fang PF等(2004) ， Multiple signaling pathways control Tbx6 expression during Xenopus myogenesis. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) 36:390-396中所描述的。胚胎的原位杂交 利用地高辛(DIG)-标记的XPAPC或GFP探针(XPAPC探针参照Kim SH等，The role of paraxial protocadherin in selective adhesion and cell movements of the mesoderm during Xenopus gastrulation. Development 125:4681-4690. 中所描述的；GFP探针系将pCS2-GFP线性化后，用T7 RNA聚合酶体外转录得 至U )， 依照 Harland RM. 1991. In situ hybridization: an improved whole—mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol 36:685—695 中所记载的进行。杂交胚胎用漂白液(含1%过氧化氢的0. 5 X SSC和5%甲酰胺) 荧光灯下处理。
结果发现，在非洲爪蟾胚胎中，i7M尸C最早从原肠运动开始前一个半小时 的囊胚晚期开始表达(9.5期(St9.5))。在这个时期，应用整体胚胎原位杂交可 以在背方边缘带检测到X,力/^的表达(图2A)。在原肠胚的早期(10期)，i7M/r的表达扩展到整个边缘带并且呈现出背方多而腹方少的模式(图2B)。随着原肠 运动的进行，i7^/^在背方中线的表达随着轴中胚层(脊索，notochord)开始发 育而下调。当中胚层皮层在13期被完全内巻后，i7M/T mRNA在前方的表达有 一条清晰的边界将头部和躯干中胚层分开(图2C)。 一旦体节形成 (somitogenesis)开始，i7^/^的表达将在成熟的体节中下调而条带状的表达会 向胚胎后方移动(图2D)，这样的循环直到体节形成结束才停止，此后i7M尸C的 表达维持在尾部的尖端上(24期)(图2E)。除了在中胚层的表达以外，从17 期开始，i^/尸C也在头部两侧即将形成耳蜗的位置表达(图2D),其后随着耳蜗 的发育和内巻，^7M/^的表达也更加局限在耳蜗的区域，当耳杯形成以后，i7M,C 会表达在杯状结构的内部(图2E)。
在进行了转基因操作而将线性化的PFL-GFP报告质粒整合到基因组中的爪 蟾胚胎中，GFP的表达模式不管是在原肠运动中的中胚层还是在发育的耳蜗之 中，都与内源的i7M/)C表达非常相似(图2F到J )。说明具有SEQ ID NO: 1 中第1-4773位序列的启动子包含了指导J/M/^在从原肠早期到尾芽期特异表 达所需的调控元件。
此外，本发明人通过类似的方法，利用p-2920GFP质粒，验证发现SEQID N0: 1中第1-2920位序列的启动子可以指导GFP表达，但表达与内源的i7M/T 表达不同，这是由于该序列中缺乏某些调控元件造成的。
此外，本发明人通过类似的方法，验证了由SEQ ID N0: l中第3-4769位 序列构成的核酸也具有类似于第卜4773位序列的活性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领序列表
<110〉中国科学院上海生命科学研究院
〈120〉非洲爪蟾XPAPC基因启动子及其组织特异性增强子
<130> 080302
<160〉 7
<170> Patentln version 3.3
<210〉 1
<211〉 4914
〈212> 腿
<213> 非洲爪蟾(Xenopus laevis)
<400〉 1
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权利要求
1.一种分离的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列选自下组(1)具有SEQ ID NO1中所示的核酸序列；(2)具有SEQ ID NO1中第(50±49)-(4724±49)位所示序列的核酸序列；或(3)与(1)或(2)限定的核酸序列有95％以上相同性且具有指导目的基因表达功能的核酸序列。
2. 如权利要求l所述的核酸序列，其特征在于，(2)项中，具有SEQIDNO: 1中第(20± 19) — (4754± 19)位所示序列的核酸序列。
3. —种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求l所述的核酸序列， 作为启动子元件。
4. 如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述的载体还含有与所述的 核酸序列可操作地连接的目的基因序列。
5. 如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述的核酸序列与目的基因序 列的间隔是0-100bp。
6. 如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述的目的基因包括轴旁 原钙粘连蛋白基因、荧光素酶基因、或荧光蛋白基因。
7. —种细胞，其特征在于，所述的细胞含有权利要求3所述的载体。
8. 权利要求1所述的核酸序列的用途，其特征在于，所述的核酸序列用 于作为启动子元件，指导目的基因的表达。
9. 如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的核酸序列用于指导目的 基因按照轴旁原钙粘连蛋白基因体内表达方式表达。
10. 如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的目的基因包括轴旁原 钙粘连蛋白基因、荧光素酶基因、或荧光蛋白基因。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，公开了非洲爪蟾XPAPC基因启动子，其具有SEQ ID NO1中所示的核酸序列或序列片段。本发明还公开了含有所述启动子的表达载体。本发明还公开了利用所述的启动子表达目的基因的方法。本发明的启动子包含了指导XPAPC在从原肠早期到尾芽期特异表达所需的调控元件，从而可用于研究在胚胎发育期间特定基因(如XPAPC)的表达调控情况以及其它因素对特定基因的表达。
文档编号C12N15/12GK101492673SQ20081003308
公开日2009年7月29日 申请日期2008年1月25日 优先权日2008年1月25日
发明者丁小燕, 鑫 娄, 王金虎 申请人:中国科学院上海生命科学研究院