专利名称:一种从纤细席藻中提取多糖的方法
技术领域:
本发明涉及一种从纤细席藻中提取多糖的方法,属于生物技术领域。
技术背景纤细席藻属于蓝藻门、蓝藻纲、段殖体目、颤藻科、席藻属。在干旱、半干 旱地区的自然藻结皮中常有纤细席藻分布。目前,对纤细席藻的利用一般只停留 在形成人工藻结皮来改良土壤和治理荒漠化,对纤细席藻的其他应用开发几乎还 是一片空白。纤细席藻用于形成人工藻结皮进行荒漠治理的一个重要原因是由于 其富含多糖,多糖含量一般都在其干重的36%以上。藻类多糖可以改变溶液流动 学特征,增加溶液的粘度,形成稳定凝胶,可以作为絮凝剂;多糖大分子的亲水 性和疏水性,可以作为乳化剂或生物凝聚剂;其结合电荷的能力,可用于去除废 水中的重金属离子。因此,它们可以用于食品工业、制药工业、化妆品工业、纺 织品工业和石油工业等。目前利用的多糖大多是从大型海藻中提取得到,它们的 多糖含量大多比纤细席藻的要低,另外,培养大型海藻的成本远比培养纤细席藻 的成本要高,从而提高了多糖的价格。 发明内容本发明的目的在于提供一种从纤细席藻中提取多糖的方法,该方法易行、操 作方便、安全可靠,成本低,产品质量好,且所用设备简单适宜于工业化生产。 从纤细席藻中提取多糖的方法包括如下步骤-(1 )培养液的配制按每升水加入硝酸钠0. 8 2. 5g、磷酸氢二钾0. 02 0. 05g、 硫酸镁0. 06 0. 09g、氯化钙0. 02 0. 05g、柠檬酸0. 004 0. 008g、柠檬酸铁 铵0. 004 0. 008g、乙二胺四乙酸二钠盐0. OO卜O. 003g、碳酸钠0. 01 0. 04g, 微量元素溶液0. 5 2ml,其中微量元素溶液按每lOOnil蒸馏水中加入硼酸270 300mg、四水氯化锰170 200mg、七水硫酸锌18 25mg、 二水钼酸钠15 30mg、 五水硫酸铜6 10mg,完全溶解后搅匀制得培养液;(2)纤细席藻的培养首先是一级培养,将纤细席藻种置于培养液中静止培养 或通气培养,调节气流在1.5 3.5L.min—',光强控制在65 85 y E. m—2. s—',温 度控制在22 35'C,当培养5 10天后,转入到二级培养;其次是二级培养,将一级培养所得的培养物接入到新的培养液中,通气培养,调节气流在2.5 5L.min—',无菌处理,光强控制在75 95 u E. m—2. s—',温度控制在22 35°C ,当 培养5 10天后,转入到三级培养;第三是三级培养,将二级培养所得的培养物 接入到新的培养液中,通气培养,调节气流在3 6L.min—',无菌处理,光强控 制在70 100u E.m—2.s—',温度控制在22 35t:,培养5 10天后,所得藻种为 继续培养的接种种源;继续培养首先是小循环培养池培养,采用三级培养后所得 的藻种,接入小循环培养池,按每升培养液0.2 0.5g湿重的比例接入,控制温 度在22 35。C,利用自然光进行光照,控制光照强度在120 180y E.nf2. s-', 搅动培养基;其次是大循环培养池培养,将小循环培养池中培养4 7天的纤细 席藻转接到大循环培养池中,小循环培养池与大循环培养池中培养液的体积比为 1:20 25,将大循环培养池中控制温度在22 35°C,利用自然光进行光照,控 制光照强度在120 180u E.m—2.5_'培养10 20天后的纤细席藻筛选收得纤细 席藻藻浆;上述纤细席藻接种时,按每升培养液O. 1 0.5g湿重的比例接入。(3) 纤细席藻粉的制备将纤细席藻藻浆离心获得纤细席藻藻泥,然后将纤 细席藻藻浆经浓縮、脱水、干燥、粉碎后得到纤细席藻粉;(4) 纤细席藻多糖的抽提向纤细席藻粉中加入7 10倍重量的蒸馏水,搅 匀,然后在70 90。C下,搅拌抽提3 5小时,在3000 6000rpm条件下离心10 15min,收集上清液,向上清液中加入等体积的氯仿 正丁醇4 7: 1 v/v溶液, 振荡20 30min, 3000 6000rpm离心10 15min,收集上层溶液,加入3 5倍 体积的预先冷冻到0 4。C的无水乙醇,摇匀,静置10 20min,析出的白色絮状 沉淀物即为纤细席藻多糖,3000 6000rpm离心5 10min收集多糖;(5) 纯化、收获与干燥首先是纯化,将上述所得多糖溶于4 6倍蒸馏水中, 用10 15倍0 4'C冷的无水乙醇洗涤;其次是收获,将上述溶液在离心机中 8000 10000rpm离心5 10min,收集多糖沉淀物;第三是干燥,将收集到的多 糖沉淀物在一6(h^ — ll(TC下冷冻干燥,得多糖产品。本发明具有以下优点和卓著的效果方法易行、经济快捷、操作方便、安全可靠、产量高、产品质量好,且设备简单适用于工业化规模生产。
具体实施方式
本发明通过以下步骤从纤细席藻中提取多糖A、 培养液的配制按每升水加入硝酸钠1.5g、磷酸氢二钾0.04g、硫酸镁0.075g、氯化钙 0.036g、柠檬酸0.006g、柠檬酸铁铵0.006g、乙二胺四乙酸二钠盐0. OOlg、碳 酸钠0.02g,微量元素溶液lml,其中微量元素溶液按每100ml蒸馏水中加入硼 酸286mg、四水氯化锰181mg、七水硫酸锌22. 2mg、 二水钼酸钠25. 2mg、五水 硫酸铜7.9mg,完全溶解后搅匀。B、 纤细席藻的培养(1) 一级培养将纤细席藻种接入装有培养液的三角瓶(150 200ml)中, 静止培养或通气培养,通气培养时,调节气流大小在2.5L.min—、气流经过棉花 球进行无菌处理,光强控制在70u E.m-2.s-',温度控制在3(TC。当培养7 10 天后,转入到二级培养。(2) 二级培养:将一级培养所得的培养物接入到装有培养液的培养瓶(500 1000ml)中,通气培养,调节气流大小在3L.min—',无菌处理,光强控制在 80p E.m—2.s—',温度控制在3(TC。当培养7 10天后,转入到三级培养。(3) 三级培养将二级培养所得的培养物接入到装有培养液的培养瓶 (5000 20000ml)中,通气培养,调节气流大小在5L.min—1,无菌处理,光强控制在90u E.m—2.s—',温度控制在3(TC。当培养7 10天后,便可作为继续培 养的接种种源。(4) 继续培养① 小循环培养池(1 2m3)培养采用三级培养后所得的藻种,接入小循环 培养池。采用玻璃温棚控制温度在30°C,利用自然光进行光照,采用遮荫网控 制光照强度在120 180u E.m—2.s—',叶轮或潜水泵搅动培养基。② 大循环培养池(40 60m3)培养将小循环培养池中培养4 7天的纤细 席藻转接到大循环培养池中,小循环培养池与大循环培养池中培养液的体积比为 1:20 25。其他培养条件与小循环培养池的培养条件相同。上述纤细席藻接种时,按每升培养液0.1 0.5g湿重的比例接入。C、 纤细席藻粉的制备将大循环培养池中培养15 20天后的纤细席藻用泵抽到过滤装置——振动 斜面筛上,经过振动斜面筛后,收得纤细席藻藻浆,然后将藻浆经过离心机离心 获得纤细席藻藻泥。将纤细席藻藻泥经浓縮、脱水、干燥、粉碎后得到纤细席 藻粉。D、 纤细席藻多糖的抽提向纤细席藻粉中加入7~10倍重量的蒸馏水,充分搅匀。然后在8(TC下, 利用搅拌器不停地搅拌抽提3 5小时。在离心机中,3000 6000rpm离心10 15min,收集上清液。向上清液中加入等体积的氯仿 正丁醇(5:1, v/v)溶液, 振荡20 30min, 3000 6000rpm离心10 15min。下层为氯仿、正丁醇溶液, 中层为主要包含蛋白质的悬浮液,上层即为主要包含多糖的粗多糖溶液。收集粗 多糖溶液,加入3 5倍体积的预先冷冻到0 4t:的无水乙醇,摇匀,静置10 20min,析出的白色絮状沉淀物即为纤细席藻多糖。3000 6000rpm离心5 10min收集多糖。E、 纯化、收获与干燥纯化将上述所得多糖溶于4 6倍蒸馏水(w/v)中,用10 15倍(w/v) O'C冷的无水乙醇洗涤;收获将上述溶液在离心机中8000 10000rpm离心5 10min,收集沉淀物; 干燥将收集到的多糖沉淀物在-IOO'C下冷冻干燥,得多糖产品。
权利要求
1、一种从纤细席藻中提取多糖的方法,其特征在于包括如下步骤(1)培养液的配制按每升水加入硝酸钠0.8~2.5g、磷酸氢二钾0.02~0.05g、硫酸镁0.06~0.09g、氯化钙0.02~0.05g、柠檬酸0.004~0.008g、柠檬酸铁铵0.004~0.008g、乙二胺四乙酸二钠盐0.001~0.003g、碳酸钠0.01~0.04g,微量元素溶液0.5~2ml配制成培养液,其中微量元素溶液为按每100ml蒸馏水中加入硼酸270~300mg、四水氯化锰170~200mg、七水硫酸锌18~25mg、二水钼酸钠15~30mg、五水硫酸铜6~10mg,完全溶解后搅匀即制得培养液;(2)纤细席藻的培养首先是一级培养,将纤细席藻种置于培养液中静止培养或通气培养,调节气流在1.5~3.5L.min-1,光强控制在65~85μE.m-2.s-1,温度控制在22~35℃,培养5~10天后转入到二级培养;其次是二级培养,将一级培养所得的培养物接入到新的培养液中通气培养,调节气流在2.5~5L.min-1,无菌处理,光强控制在75~95μE.m-2.s-1,温度控制在22~35℃,培养5~10天后,转入到三级培养;第三是三级培养,将二级培养所得的培养物接入到新的培养液中,通气培养,调节气流在3~6L.min-1,无菌处理,光强控制在70~100μE.m-2.s-1,温度控制在22~35℃,培养5~10天后,所得藻种为继续培养的接种种源;继续培养首先是小循环培养池培养,采用三级培养后所得的藻种,接入小循环培养池,控制温度在22~35℃,利用自然光进行光照,控制光照强度在120~180μE.m-2.s-1,搅动培养基;其次是大循环培养池培养,将小循环培养池中培养4~7天的纤细席藻转接到大循环培养池中培养,将大循环培养池中控制温度在22~35℃,利用自然光进行光照,控制光照强度在120~180μE.m-2.s-1培养10~20天后的纤细席藻筛选收得纤细席藻藻浆;(3)纤细席藻粉的制备将纤细席藻藻浆离心获得纤细席藻藻泥,然后纤细席藻藻泥经浓缩、脱水、干燥、粉碎后得到纤细席藻粉;(4)纤细席藻多糖的抽提向纤细席藻粉中加入7~10倍重量的蒸馏水,搅匀,然后在70~90℃下,搅拌抽提3~5小时,在3000~6000rpm条件下离心10~15min,收集上清液,向上清液中加入等体积的氯仿正丁醇溶液,振荡20~30min,3000~6000rpm离心10~15min,收集上层溶液,加入3~5倍体积的预先冷冻到0~4℃的无水乙醇,摇匀,静置10~20min,析出的白色絮状沉淀物即为纤细席藻多糖,3000~6000rpm离心5~10min收集多糖;(5)纯化、收获与干燥首先是纯化,将上述所得多糖溶于4~6倍蒸馏水中,用10~15倍0~4℃冷的无水乙醇洗涤;其次是收获,将纯化后的溶液以8000~10000rpm离心5~10min,收集多糖沉淀物;第三是干燥,将收集到的多糖沉淀物在-60~-110℃下冷冻干燥,得多糖产品。
2. 根据权利要求1所述的从纤细席藻中提取多糖的方法,其特征在于小循环培 养池与大循环培养池中培养液的体积比为1:20 25。
3. 根据权利要求1所述的从纤细席藻中提取多糖的方法,其特征在于所用氯仿 正丁醇溶液中氯仿与正丁醇体积比为4 7: 1。
全文摘要
本发明公开了一种从纤细席藻中提取多糖的方法,首先将硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、柠檬酸、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸二钠盐、碳酸钠,微量元素溶液按比例配制成培养液;然后将纤细席藻置于培养液中培养并制取纤细席藻粉,最后从纤细席藻多糖粉中提取多糖并将所得多糖纯化、收获与干燥。本发明方法易行、操作方便、安全可靠、产量高、产品质量好、且所用设备简单适用于工业化规模生产。
文档编号C12N1/12GK101235096SQ200810046770
公开日2008年8月6日 申请日期2008年1月25日 优先权日2008年1月25日
发明者刘永定, 沈银武, 王焰新, 胡春香, 谢作明, 黄泽波 申请人:中国地质大学(武汉)