专利名称：一种从爪哇伪枝藻中提取多糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种从爪哇伪枝藻中提取多糖的方法，属于生物技术领域。
技术背景爪哇伪枝藻是一种广泛分布于荒漠生境的丝状蓝藻，它属于蓝藻门、蓝藻纲、 段殖体目、伪枝藻科、伪枝藻属。目前，对爪哇伪枝藻的利用一般只停留在进行 人工藻结皮上，对爪哇伪枝藻的其他应用开发几乎还是一片空白。爪哇伪枝藻之 所以用于形成人工藻结皮进行荒漠治理，主要的是由于其富含多糖，多糖含量一 般都在其干重的16.6%以上。藻类多糖可以改变溶液流动学特征，增加溶液的粘 度，形成稳定凝胶，可以作为絮凝剂；多糖大分子的亲水性和疏水性，可以作为 乳化剂或生物凝聚剂；其结合电荷的能力，可用于去除废水中的重金属离子；藻 类多糖还具有潜在的抗肿瘤、抗病毒、降低胆固醇含量等活性可用作抗癌活性药 物。因此，它们可以用于食品工业、制药工业、化妆品工业、纺织品工业和石油 工业等。由于多糖大多是从大型海藻中提取得到，这些藻的生产成本较高或很高， 从而抬高了多糖的价格。 发明内容本发明的目的在于提供一种利用爪哇伪枝藻提取多糖的方法，此方法易行、 操作方便、安全可靠，成本低，产品质量好，且所用设备简单适宜于工业化生产。 从爪哇伪枝藻提取多糖的方法包括如下步骤A、培养液的配制按每升水加入磷酸氢二钾0. 02 0. 05g、硫酸镁0.06 0. 09g、氯化钙0. 02 0. 05g、柠檬酸0. 004~0. 008g、柠檬酸铁铵0. 004 0. 008g、 乙二胺四乙酸二钠盐0. 001 0. 003g、碳酸钠0. 01 0. 04g，微量元素溶液0. 5 2ml，其中微量元素溶液按每100ml蒸馏水中加入硼酸270 300mg、四水氯化猛 170 200mg、七水硫酸锌18 25mg、 二水钼酸钠15 30mg、五水硫酸铜6 10mg， 完全溶解后搅匀即制得培养液；B、爪哇伪枝藻的培养首先是一级培养，将爪哇伪枝藻种置于培养液中通气 培养，调节气流在1.5 3.5L.min—'，光强控制在65 85y E.m—2.s-',温度控 制在22 35°C，培养5 10天后转入到二级培养；其次是二级培养，将一级培养所得的培养物接入到新的培养液中，通气培养，调节气流在2. 5 5L. rnirT1， 无菌处理，光强控制在75 95P E.nT2. s-、温度控制在22 35°C，培养5 10 天后转入到三级培养；第三是三级培养，将二级培养所得的培养物接入到新的培 养液中通气培养，调节气流在3 6L.mirT'，无菌处理，光强控制在70 100ix E.m—Is、温度控制在22 35'C，培养5 10天后作为继续培养的接种种源； 第四是继续培养，首先是小循环培养池培养，将三级培养后所得的藻种接入小循 环培养池，控制温度在22 35'C，利用自然光进行光照，控制光照强度在120 180u E.m—2.s—',搅动培养基；其次是大循环培养池培养，将小循环培养池中培 养4 7天的爪哇伪枝藻转接到大循环培养池中培养，小循环培养池与大循环培 养池中培养液的体积比为1:20 25，将大循环培养池中控制温度在22 35。C， 用自然光进行光照，控制光照强度在120 180p E.m-夂s—,培养10 20天后 的爪哇伪枝藻过滤收得爪哇伪枝藻藻浆；上述爪哇伪枝藻接种时，按每升培养液O. 1 0. 5g湿重的比例接入。C、 爪哇伪枝藻粉的制备将爪哇伪枝藻藻浆离心获得爪哇伪枝藻藻泥，然 后将爪哇伪枝藻藻泥经浓縮、脱水、干燥、粉碎后得到爪哇伪枝藻粉；D、 爪哇伪枝藻多糖的抽提向爪哇伪枝藻粉中加入7 10倍重量的蒸馏水， 搅匀，然后在70 90。C下，利用搅拌器不停地搅拌抽提3 5小时，在离心机中， 3000 6000rpm离心10 15min，收集上清液，向上清液中加入等体积的氯仿正 丁醇溶液，所用正丁醇溶液中氯仿与正丁醇体积比为4 7: 1。振荡20 30min， 3000 6000rpm离心10 15min，收集上层溶液，加入3 5倍体积的预先冷冻到 0 4'C的无水乙醇，摇匀，静置10 20min，析出的白色絮状沉淀物即为爪哇伪 枝藻多糖，3000 6000rpm离心5 10min收集多糖；E、 纯化、收获与干燥首先是纯化，将上述所得多糖溶于4 6倍蒸馏水中， 用10 15倍0 4。C冷的无水乙醇洗涤；其次是收获，将所得的纯化溶液在离心 机中8000 10000卬m离心5 10min，收集多糖沉淀物；第三是干燥，将收集到 的多糖沉淀物在一60 一11(TC下冷冻干燥，得多糖产品。本发明具有以下优点和卓著的效果方法易行、经济快捷、操作方便、设备 简单、产量高、产品质量好、安全可靠，适用于工业化规模生产。
具体实施方式
提取爪哇伪枝藻多糖的具体实施步骤如下A、 培养液的配制按每升水加入磷酸氢二钾0. 04g、硫酸镁0. 075g、氯化钙0. 036g、柠檬酸 0.006g、柠檬酸铁铵0.006g、乙二胺四乙酸二钠盐O.OOlg、碳酸钠0.02g，微 量元素溶液lml，其中微量元素溶液按每100ml蒸馏水中加入硼酸286mg、四水 氯化锰181mg、七水硫酸锌22. 2mg、 二水钼酸钠25. 2mg、五水硫酸铜7. 9mg， 完全溶解后搅匀。B、 爪哇伪枝藻的培养(1) 一级培养将爪哇伪枝藻种接入装有培养液的三角瓶(150 200ml)中， 静止培养或通气培养，通气培养时，调节气流大小在2.51^』化—'，气流经过棉花 球进行无菌处理，光强控制在70y E.m_2.s—'，温度控制在3(TC。当培养7 10 天后，转入到二级培养。(2) 二级培养将一级培养所得的培养物接入装有培养液的到培养瓶(500 1000ml)中，通气培养，调节气流大小在3L.min—',无菌处理，光强控制在 80y E.m—2.s—'，温度控制在30。C。当培养7 10天后，转入到三级培养。(3) 三级培养将二级培养所得的培养物接入到装有培养液的培养瓶(5000 20000ml)中，通气培养，调节气流大小在5L.mirT'，无菌处理，光强控制在 90u E.m—2.s—、温度控制在3(TC。当培养7 10天后，便可作为继续培养的接 种种源。(4) 继续培养① 小循环培养池(1 2m3)培养采用三级培养后所得的藻种，接入小循环 培养池。采用玻璃温棚控制温度在30°C，利用自然光进行光照，采用遮荫网控 制光照强度在120 180n E.m-2.s-'，叶轮或潜水泵搅动培养基。② 大循环培养池(40 60m3)培养将小循环培养池中培养4 7天的爪哇 伪枝藻转接到大循环培养池中，按小循环培养池与大循环培养池中培养液的体积 比为l:20 25进行扩大。其他培养条件与小循环培养池的培养条件相同。上述爪哇伪枝藻接种时，按每升培养液O. 1 0.5g湿重的比例接入。C、 爪哇伪枝藻粉的制备将大循环培养池培养15 20天后的爪哇伪枝藻用泵抽到过滤装置——振动 斜面筛上，经过振动斜面筛后，收得爪哇伪枝藻藻浆，然后将藻浆经过离心机离 心获得爪哇伪枝藻藻泥，将爪哇伪枝藻藻泥经浓縮、脱水、干燥、粉碎后得到 爪哇伪枝藻粉。D、 爪哇伪枝藻多糖的抽提向爪哇伪枝藻粉中加入7 10倍重量的蒸馏水，充分搅匀。然后在8(TC下， 利用搅拌器不停地搅拌抽提3 5小时。在离心机中，3000 6000rpm离心10 15min，收集上清液。向上清液中加入等体积的氯仿一正丁醇(5:1, v/v)溶液， 振荡20 30min， 3000 6000rpm离心10 15min。下层为氯仿、正丁醇溶液， 中层为主要包含蛋白质的悬浮液，上层即为主要包含多糖的粗多糖溶液。收集这 些粗多糖溶液，加入3 5倍体积的预先冷冻到0 4'C的无水乙醇，摇匀，静置 10 20min，析出的白色絮状沉淀物即为爪哇伪枝藻多糖。3000 6000rpm离心 5 10min收集多糖。E、 纯化、收获与干燥纯化将上述所得多糖溶于4 6倍蒸馏水(w/v)中，用10 15倍(w/v) (TC冷的无水乙醇洗涤；收获将所得纯化溶液在离心机中8000 10000rpm离心5 10min，收集多 糖沉淀物；干燥将收集到的多糖沉淀物在-10(TC下冷冻干燥，得多糖产品。
权利要求
1、一种从爪哇伪枝藻提取多糖的方法，其特征在于包括如下步骤A、培养液的配制按每升水加入磷酸氢二钾0.02～0.05g、硫酸镁0.06～0.09g、氯化钙0.02～0.05g、柠檬酸0.004～0.008g、柠檬酸铁铵0.004～0.008g、乙二胺四乙酸二钠盐0.001～0.003g、碳酸钠0.01～0.04g，微量元素溶液0.5～2ml，其中微量元素溶液按每100ml蒸馏水中加入硼酸270～300mg、四水氯化锰170～200mg、七水硫酸锌18～25mg、二水钼酸钠15～30mg、五水硫酸铜6～10mg，完全溶解后搅匀即制得培养液；B、爪哇伪枝藻的培养首先是一级培养，将爪哇伪枝藻种置于培养液中静止培养或通气培养，调节气流在1.5～3.5L.min-1，光强控制在65～85μE.m-2.s-1，温度控制在22～35℃，培养5～10天后转入到二级培养；其次是二级培养，将一级培养所得的培养物接入到新的培养液中，通气培养，调节气流在2.5～5L.min-1，无菌处理，光强控制在75～95μE.m-2.s-1，温度控制在22～35℃，培养5～10天后转入到三级培养；第三是三级培养，将二级培养所得的培养物接入到新的培养液中，通气培养，调节气流在3～6L.min-1，无菌处理，光强控制在70～100μE.m-2.s-1，温度控制在22～35℃，培养5～10天后作为继续培养的接种种源；第四是继续培养，首先是小循环培养池培养，将三级培养后所得的藻种接入小循环培养池，控制温度在22～35℃，利用自然光进行光照，控制光照强度在120～180μE.m-2.s-1，搅动培养基；其次是大循环培养池培养，将小循环培养池中培养4～7天的爪哇伪枝藻转接到大循环培养池中培养，将大循环培养池中控制温度在22～35℃，用自然光进行光照，控制光照强度在120～180μE.m-2.s-1，培养10～20天后的爪哇伪枝藻过滤收得爪哇伪枝藻藻浆；C、爪哇伪枝藻粉的制备将爪哇伪枝藻藻浆离心获得爪哇伪枝藻藻泥，然后将爪哇伪枝藻藻泥经浓缩、脱水、干燥、粉碎后得到爪哇伪枝藻粉；D、爪哇伪枝藻多糖的抽提向爪哇伪枝藻粉中加入7～10倍重量的蒸馏水，搅匀，然后在70～90℃下，利用搅拌器不停地搅拌抽提3～5小时，在离心机中，3000～6000rpm离心10～15min，收集上清液，向上清液中加入等体积的氯仿正丁醇溶液，振荡20～30min，3000～6000rpm离心10～15min，收集上层溶液，加入3～5倍体积的预先冷冻到0～4℃的无水乙醇，摇匀，静置10～20min，析出的白色絮状沉淀物即为爪哇伪枝藻多糖，3000～6000rpm离心5～10min收集多糖；E、纯化、收获与干燥首先是纯化，将上述所得多糖溶于4～6倍蒸馏水中，用10～15倍0～4℃冷的无水乙醇洗涤；其次是收获，将所得的纯化溶液在离心机中8000～10000rpm离心5～10min，收集多糖沉淀物；第三是干燥，将收集到的多糖沉淀物在-60～-110℃下冷冻干燥，得多糖产品。
2. 根据权利要求1所述的从纤细席藻中提取多糖的方法，其特征在于小循环培 养池与大循环培养池中培养液的体积比为1:20 25。
3. 根据权利要求1所述的从纤细席藻中提取多糖的方法，其特征在于所用氯仿 正丁醇溶液中氯仿与正丁醇体积比为4 7: 1。
全文摘要
本发明公开了一种从爪哇伪枝藻中提取多糖的方法，首先将磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、柠檬酸、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸二钠盐、碳酸钠，微量元素溶液按比例配制成爪哇伪枝藻培养液；然后将爪哇伪枝藻置于培养液中培养并制取爪哇伪枝藻粉，最后从爪哇伪枝藻粉中提取多糖并所得多糖纯化、收获与干燥。本发明方法易行、操作方便、安全可靠、产量高、产品质量好、且所用设备简单适用于工业化规模生产。
文档编号C12P19/00GK101220386SQ20081004677
公开日2008年7月16日 申请日期2008年1月25日 优先权日2008年1月25日
发明者刘永定, 沈银武, 王焰新, 胡春香, 谢作明, 黄泽波 申请人:中国地质大学(武汉)