专利名称：用廉价底物培养微生物细胞催化油脂原料生产生物柴油的方法
技术领域：
本发明属于生物油脂合成领域，特别是提出了一种用廉价底物培养微生物细胞催 化油脂原料生产生物柴油的方法。利用廉价底物作为培养基氮源培养产胞内脂肪酶的 微生物全细胞，用于催化油脂生产生物柴油。廉价底物包括豆粉、豆粕、玉米浆等。
背景技术：
油脂工业的前景之一-生物柴油是由生物油脂原料通过转酯反应生成的长链脂肪 酸酯类物质，是一种新型无污染的可再生能源。生物柴油的燃烧性能可以与传统的石 油系柴油媲美。同时，其与传统的石油系柴油相比具有原料可再生，环境友好，闪点 高，十六烷值高等优点。因而生物柴油的研究和应用已经受到了广泛的关注。
目前生物柴油的生产方法主要有化学法、生物酶法及超临界流体法，其中由于生 物酶法合成生物柴油具有反应条件温和、无污染物排放、油脂原料中的游离脂肪酸和 少量水不影响酶促反应等优点，符合绿色化学的发展方向，因而日益受到人们的重视。
阻碍生物酶法制备生物柴油产业化的主要因素是催化剂酶的成本与化学法所使 用的酸或碱相比较高。釆用产胞内脂肪酶的微生物全细胞代替传统的商品化固定化脂 肪酶催化油脂转酯反应制备生物柴油，省去了传统的固定化脂肪酶生产过程中的分 离、纯化以及固定化等步骤，可以有效地降低酶法制备生物柴油的生产成本。降低微生物细胞的培养成本，是进一步降低微生物细胞催化生产生物柴油生产 成本的关键。微生物培养过程中，培养基的主要成分包括氮源、碳源以及少量无机盐。 对于以生产酶蛋白为主要目的的培养过程，氮源的选用尤其重要。在微生物细胞催化 油脂原料生产生物柴油的研究中，所用微生物细胞培养基氮源通常为蛋白胨。日本学 者报道了利用蛋白胨为培养基培养i .ow加e IFO 4697全细胞催化剂，然后再将培养得 到的全细胞催化剂用于生物柴油的制备(Kaieda M， Samukawa T, Matsumoto T， Ban K, Kondo A， Shimada Y, Noda H， Nomoto F， Ohtsuka K, Izumoto E, Fukuda H(1999) Biodiesel fuel production from plant oil catalyzed by i 始o戸51 07zfle lipase in a water-containing system without an organic solvent. Journal of Bioscience and Bioengineering 88:627-631)。蛋白胨价格昂贵，且用量较大，以蛋白胨为氮源制约了 微生物全细胞作为催化剂在生物柴油中的实际应用。本发明提出采用廉价豆粉等作为 底物氮源培养微生物细胞，可以大大降低微生物细胞的培养成本，从而有效降低利用 微生物细胞作为催化剂生产生物柴油的生物催化剂成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用廉价底物培养微生物细胞催化油脂原料生产生物 柴油的方法，降低用于生物柴油制备的微生物细胞的培养成本。在微生物细胞的培养 过程中，利用相对廉价的豆粉、豆粕、玉米浆等底物作为培养基氮源，可以有效降低 全细胞催化剂的培养成本。
本发明的具体工艺为利用5g/L 300g/L廉价的豆粉、豆粕、玉米浆等底物作为培养基氮源，与其它碳源及无机盐组合，培养微生物细胞，然后利用培养出来的全 细胞催化剂在如下条件下转化可再生油脂制备生物柴油加入短链醇与油脂摩尔比为 3: 1 6: l的反应底物，当短链醇与油脂的摩尔比为3: 1-4: 1时，短链醇按总量的 平均数分两步加入；当短链醇与油脂的摩尔比为5: 1-6: 1时，短链醇按总量的平均 数分三步加入，加入基于油脂(或游离脂肪酸)质量2 30%的微生物细胞，装入生化 反应器中混合均匀，加热至30'C 6(TC，反应10—48小时后，生物柴油的得率超过 90%。
所述廉价氮源为包括豆粉、玉米浆、豆粕、玉米蛋白、黄豆面等中的一种，或2 种、或全部的混合物。
所述微生物全细胞包括产胞内脂肪酶的细菌、酵母以及霉菌的游离及固定化细 胞。特别是及力o^^ IFO 4697游离细胞和固定化在聚氨酯泡沫载体上的固定化细胞， 以及经交联剂(如戊二醛等)交联的固定化细胞。
所述可再生油脂包括各种植物油脂、动物油脂、微生物油脂、废食用油、炼油脚 料以及游离脂肪酸等。
所述植物油脂为蓖麻油、麻风树油、文冠果油、菜籽油、大豆油、花生油、玉米 油、棉子油、米糠油、桐油、乌桕油。
所述动物油脂为鱼油、猪油、牛油、羊油。
所述微生物油脂包括酵母油脂、细菌油脂、藻类油脂。
本发明所述短链醇为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或戊醇。
本发明的优点在于与利用蛋白胨作为培养基氮源相比，利用廉价氮源作为底物， 大大降低了微生物全细胞的培养成本，从而使利用微生物细胞催化油脂原料生产生物 柴油的方法在经济上更有竞争力，可以有效推动微生物全细胞在生物柴油制备中的应 用。
具体实施例方式
实施例1
以含20 g/L豆粉，30 g/L大豆油，1. 2g/L磷酸二氢钾，1. 2g/L硝酸钠，0. 244 g/L无水硫酸镁为培养基培养尺w7加e IFO 4697游离细胞,所得细胞总酶活与以70g/L 蛋白胨为氮源的相当。将培养出来的全细胞催化剂在如下条件下进行催化大豆油制备 生物柴油，加入短链醇与油脂摩尔比为4: 1的反应底物，短链醇按总量的平均数分 两步加入，即反应初始加入2摩尔，反应5小时后再加入2摩尔；加入基于油脂质量 5%的微生物细胞，装入生化反应器中混合均匀，加热至4(TC，总共反应12小时后， 以豆粉为氮源培养出的全细胞催化剂催化大豆油转化的生物柴油得率为90%。
实施例2
以含200 g/L玉米浆(玉米浆含氮量约4. 5%)， 30 g/L大豆油，1. 2g/L磷酸二 氢钾，1.2g/L硝酸钠，0.244g/L无水硫酸镁为培养基。在培养过程中加入50-200 粒边长4-12mm的聚氨酯泡沫颗粒作为载体，对细胞进行固定化培养。在培养过程中，IFO 4697细胞直接长入载体内部，培养得到固定化兄oo^ae IFO 4697细胞。 将培养出来的全细胞催化剂在如下条件下进行催化棕榈油制备生物柴油，加入短链醇 与油脂摩尔比为5: l的反应底物，短链醇按总量的平均数分别在O小时，3小时和6 小时分三步加入，加入基于油脂质量12%的微生物细胞，装入生化反应器中混合均匀， 加热至4(TC，总共反应10小时后，以豆粉为氮源培养出的全细胞催化剂催化大豆油 转化的生物柴油得率为951 实施例3
以含15g/L豆粉，30g/L大豆油，2g/L磷酸氢二铵，1.2g/L磷酸二氢钾， 0. 35g/L无水硫酸镁为培养基，在培养过程中加入50-200粒边长4-12mm的聚氨酯泡 沫颗粒作为载体，对细胞进行固定化培养。在培养过程中，义W7加elF0 4697细胞直 接长入载体内部。培养得到固定化及力o^flelF0 4697细胞。将培养出来的全细胞催化 剂在如下条件下进行催化大豆油制备生物柴油，加入短链醇与油脂摩尔比为5: 1的 反应底物，短链醇按总量的平均数分别在0小时，3小时和6小时分三步加入，加入 基于油脂质量8%的微生物细胞，装入生化反应器中混合均匀，加热至40°C，总共反 应9小时后，以豆粉为氮源培养出的全细胞催化剂催化大豆油转化的生物柴油得率为 92%。
实施例4
以含30 g/L豆粕，30 g/L橄榄油，1. 2g/L磷酸二氢钾，1. 2g/L硝酸钠，0. 244 g/L无水硫酸镁为培养基，在培养过程中加入50-200粒边长4-12m的聚氨酯泡沫颗 粒作为载体，对细胞进行固定化培养。在培养过程中，i .o^加"F0 4697细胞直接长 入载体内部，培养得到固定化及.00^/" 0 4697细胞。然后将培养所得固定化细胞在 含0.1%的戊二醛溶液中交联30min。将交联后的固定化全细胞催化剂在如下条件下进 行催化麻风树油制备生物柴油，加入短链醇与油脂摩尔比为6: 1的反应底物，短链 醇按总量的平均数分别在0小时，8小时和15小时分三步加入，加入基于油脂质量 25%的微生物细胞，装入生化反应器中混合均勾，加热至45'C，总共反应20小时后， 以豆粉为氮源培养出的全细胞催化剂催化大豆油转化的生物柴油得率为94%。
实施例5
以含30g/L豆粉，30g/L油酸，1.2g/L磷酸二氢钾，1. 2g/L硝酸钠，0.244 g/L无水硫酸镁为培养基，在培养过程中加入50-200粒边长4-12mm的聚氨酯泡沫颗 粒作为载体，对细胞进行固定化培养。在培养过程中，i .07加elF0 4697细胞直接长 入载体内部。培养得到固定化i ,oo^aelF0 4697细胞，然后将培养所得固定化细胞在 含0.1%的戊二醛溶液中交联30min。将交联后的固定化全细胞催化剂在如下条件下进 行催化棉籽油制备生物柴油，加入短链醇与油脂摩尔比为5: 1的反应底物，短链醇 按总量的平均数分别在0小时，3小时和6小时分三步加入，加入基于油脂质量20% 的微生物细胞，装入生化反应器中混合均匀，加热至40'C,总共反应10小时后，以 豆粉为氮源培养出的全细胞催化剂催化大豆油转化的生物柴油得率为90%。实施例6
以含30 g/L玉米蛋白，30 g/L油酸甲酯，1.2g/L磷酸二氢钾，L2g/L硝酸 钠，0.244 g/L无水硫酸镁为培养基，在培养过程中加入50-200粒边长4-12咖的聚 氨酯泡沫颗粒作为载体，对细胞进行固定化培养。在培养过程中，i .ow加e IFO 4697 细胞直接长入载体内部。培养所得固定化i .oo^"elF0 4697细胞。将培养所得固定化 细胞在含0.1%的戊二醛溶液中交联30min。将交联后的固定化全细胞催化剂在如下条 件下进行催化大豆油制备生物柴油，加入短链醇与油脂摩尔比为5: 1的反应底物， 短链醇按总量的平均数分别在O小时，5小时和10小时分三步加入，加入基于油脂质 量20%的微生物细胞，装入生化反应器中混合均匀，加热至35'C，总共反应14小时 后，以豆粉为氮源培养出的全细胞催化剂催化大豆油转化的生物柴油得率为92%。
根据上述实施例，以豆粉、豆粕、玉米浆等廉价有机氮源可以有效培养产胞内脂 肪酶的微生物全细胞，然后将培养得到的全细胞催化剂用于生物柴油的制备。该方法 可以大大降低微生物细胞的培养成本，以及生物柴油制备中的生物催化剂的成本。
权利要求
1、一种用廉价底物培养微生物细胞催化油脂原料生产生物柴油的方法，其特征在于工艺为用5g/L～300g/L豆粉、豆粕、玉米浆或黄豆面底物作为培养基氮源，与其它碳源及无机盐组合，培养微生物细胞，然后利用培养出来的全细胞催化剂在如下条件下转化可再生油脂制备生物柴油；所述的如下条件是加入短链醇与油脂摩尔比为3∶1～6∶1的反应底物，当短链醇与油脂的摩尔比为3∶1-4∶1时，短链醇按总量的平均数分两步加入；当短链醇与油脂的摩尔比为5∶1-6∶1时，短链醇按总量的平均数分三步加入，加入基于油脂或游离脂肪酸质量2～30％的微生物细胞，装入生化反应器中混合均匀，加热至30℃～60℃，反应10-48小时后，生物柴油的得率超过90％。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其特征在于所述的培养基氮源 为豆粉、豆粕、玉米浆或黄豆面中的2种或全部的混合物。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述微生物全细胞包括产胞内脂肪酶的细菌、酵母或霉菌的游离及固定化细胞；所述的霉菌的游离及固定化细胞包括 i .oo;加e IFO 4697游离细胞和固定化在聚氨酯泡沫载体上的固定化细胞，以及经交联 剂交联的游离细胞和固定化细胞。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于交联剂为戊二醛。
5、 根据权利要求1所述方法，其特征在于所述短链醇为甲醇、乙醇、丙醇、 丁醇或戊醇。
6、 根据权利要求1所述方法，其特征在于所述可再生油脂包括各种植物油脂、动物油脂、微生物油脂、废食用油、炼油脚料或游离脂肪酸。
7、 根据权利要求6所述方法，其特征在于所述植物油脂为蓖麻油、麻风树油、文冠果油、菜籽油、大豆油、花生油、玉米油、棉子油、米糠油、桐油或乌桕油。
8、 根据权利要求6所述方法，其特征在于所述动物油脂为鱼油、猪油、牛油或羊油。
9、 根据权利要求6所述方法，其特征在于所述微生物油脂包括酵母油脂、细菌油脂或藻类油脂。
全文摘要
一种用廉价底物培养微生物细胞催化油脂原料生产生物柴油的方法，属于生物油脂合成领域。工艺为用5g/L～300g/L豆粉、豆粕、玉米浆或黄豆面底物作为培养基氮源，与其它碳源及无机盐组合，培养微生物细胞，然后利用培养出来的全细胞催化剂在如下条件下转化可再生油脂制备生物柴油加入短链醇与油脂，加入基于油脂或游离脂肪酸质量2～30％的微生物细胞，装入生化反应器中混合均匀，加热至30℃～60℃，反应10-48小时后，生物柴油的得率超过90％。优点在于，有效降低全细胞催化剂的培养成本。
文档编号C12P7/64GK101307342SQ20081011537
公开日2008年11月19日 申请日期2008年6月23日 优先权日2008年6月23日
发明者刘德华, 伟 杜, 伟 里 申请人:清华大学