专利名称：普陀鹅耳枥种胚培养基及组培快繁方法
普陀鵝耳枥种胚培养基及组培快繁方法技术领域：
本发明涉及一种生物组织的培养基和组培快繁方法。背景技术：
普陀鹅耳枥("/^/""s /7"foe/7s/y )，隶属于鹅耳枥属 Cai^'加^:，桦木科"e"7aceae。普陀鵝耳枥是我国特有的珍稀 树种，其分布范围极为狭窄，仅见于浙江舟山群岛，是我国io种 几近灭绝树种之一。由于该树萌芽性差、花粉寿命短，花粉活力 于七日内递降败育和种子发芽率低，，受生态和人为破坏等因素 而导致濒临灭绝。才艮据调查资料，野生状态下的普陀鹅耳枥现在 仅在普陀山残存1抹。鉴于此，普陀鹅耳枥的物种保护引起植物 学研究机构的重视。目前经过多年的育苗、造林试验，采用播种、 扦插、嫁接等方法培育苗木379抹，速度过慢，满足不了快速恢 复这一稀有物种的迫切需求，探索与尝试用组培快繁方法扩大该 树的栽种量，有其积极的现实意义，然而，经检索和调查，至今 尚无人涉足，未见对该树种通过生物技术组培快繁方法育苗的有 关资料报道和实物问世。
发明内容本发明要解决的技术问题是用普陀鹅耳枥种胚为外植体，配 制一种有效的组织培养基，提供整套普陀鹅耳枥组培快繁方法。 解决上述问题的技术方案是提供的普陀鹅耳枥组织培养基，WPM盐类、MT维生素、0. 001-0. lmg/L的BA即节^J^腺噪呤、50-150mg/L的肌醇、占 培养基总重量0. 2%-0. 4%的水晶洋菜和1. 5%-4. 5%的蔗糖，培养 基的pH值5. 0_6. 0。用上述培养基，对本普陀鵝耳枥进行组培快繁的方法包括如 下步骤l)外植体的采集与选择要求种子的长度5-6毫米，种胚 的长度O. 8-1. 2mm，发育成熟的种子；(2)种子的洗净、灭菌与取种胚将成熟种子冲水四个小 时并用蒸馏水清洗干净后，放入1%次氯酸钠的溶液中真空抽滤 灭菌10min，然后无菌水冲洗5次，在无菌操作台上，利用解剖显微镜用剪刀及小镊子剥去种壳并用刀尖挑取种胚；(3 )接种与培养将切得的普陀鹅耳枥种胚接种到WPM盐 类、MT维生素、0. 001-0. lmg/L的BA即节氛基腺嘌呤、50-150mg/L 的肌醇、占培养基总重量0. 2%-0. 4%的水晶洋菜和1. 5%-4. 5%的 蔗糖种胚培养基中，暗培养2d后再置于光照周期16h/d、光照 强度2500Lux的冷光灯下、环境温度25 ± 21C中继续培养26d， 共28d，便出现新绿色的生有根的试管苗；(4) 继代与诱导生根将该生根的试管苗去根进行继代培 养，每4周继代一次，经1-2次继代，即可诱导植林生根；(5) 驯化移栽将生根良好的幼苗移至驯化室、光照强度 20000Lux、驯化l-2周，将苗从试管取出，用温水冲洗苗根部培 养基，再用冷水冲洗，移栽至体积比为蛭石珍珠岩泥炭=1: 1: 1混合而成的盆装人工基质中，每盆苗套上透明塑料袋，每 隔3天将袋子剪一小口 ， 9-12d去袋移至温室即成。本发明的有益效果是首创了普陀鹅耳枥用种胚作外植体组培快繁的整套方法，提供了普陀鵝耳枥种胚育苗的优良培养基， 为进一步探索普陀鹅耳枥的基因工程、拓宽外植体材料等奠定了 基础。另一方面，弥补了该树萌芽性差、花粉寿命短和发芽率低， 有效授粉期不足的繁殖生理缺陷，拯救了几乎灭绝的普陀鹅耳枥 物种资源。
具体实施方式本发明下面结合实施例予以阐明WPM盐类、MT维生素均 可市售获得，按商品说明书所示常规方法配用，为行业所通用。 BA的合适加入量为0. 001-0.1 mg/L,最佳量0. 01 mg/L;肌醇 的加入合适量50-150 mg/L，最佳量100mg/L;水晶洋菜的加入 合适量占培养基总重量0. 2%-0. 4%，最佳量0. 25%,蔗糖的加入 合适量占培养基总重量的1.5%-4. 5%，最佳量3%;培养基的pH 值5. 0—6. 0,最佳值5.7。下面将实施例1-7列表表示于下原料1234567WPM盐类常规方法配成MT维生素常规方法配成BA 0. 001-0. 1 (mg/L)0. 010. 0010.10. 050. 0050.10. 001肌醇50-150 (mg/L)100501501207050150水晶洋菜0.2-0.4 (%)0.250. 20.40. 30.230.40. 2蔗糖1.5-4. 5 (%)31.54. 52. 51. 81. 54.5PH 5.0-6.05. 75. 06. 05. 35. 66. 05. 0下面用最佳方案的实施例1 (对照表中实施例l对应的原料及配比值)，分步骤说明本发明l)外植体的采集与选择要求种子的长度5-6毫米，种胚的长度0.8-1. 2mm，发育成熟的种子；(2)种子的洗净、灭菌与取种胚将成熟种子冲水四个小 时并用蒸馏水清洗干净后，放入1%次氯酸钠的溶液中真空抽滤 灭菌10min，然后无菌水沖洗5次，在无菌操作台上，利用解剖 显微镜用剪刀及小镊子剥去种壳并用刀尖挑取种胚；(3 )接种与培养将切得的普陀鹅耳枥种胚接种到WPM盐 类、MT维生素、0. 01mg/L的BA即节M腺嘌呤、100mg/L的肌 醇、占培养基总重量0.25%的水晶洋菜和3%的蔗糖种胚培养基 中，培养基的pH值5. 7，暗培养2d后再置于光照周期16h/d、光 照强度2500Lux的冷光灯下、环境温度25 ± 2*C中继续培养26d， 共28d，便出现新绿色的生有根的试管苗；(4) 继代与诱导生根将该生根的试管苗去根进行继代培 养，每4周继代一次，经1-2次继代，即可诱导植林生根；(5) 驯化移栽将生根良好的幼苗移至驯化室、光照强度 20000Lux、驯化l-2周，将苗从试管取出，用温水冲洗苗根部培 养基，再用冷水冲洗，移栽至体积比为蛭石珍珠岩泥炭-l: 1: 1混合而成的盆^A工基质中，每盆苗套上透明塑料袋，每 隔3天将袋子剪一小口 ， 9-12d去袋移至温室即成。其余实施例2-7，均对照表中相应原料及配比值，用实施例 l相同步骤也能解决本发明的技术问题，只是分化率、生根率、 壮弱程度上的差异，总的说，数值越接近最佳值越理想。如有需 要，本申请人将随时提供各阶段实物苗照片，以供审核。
权利要求
1、一种普陀鹅耳枥种胚培养基，其特征是由下列原料配比而成WPM盐类、MT维生素、0.001-0.1mg/L的BA即苄氨基腺嘌呤、50-150mg/L的肌醇、占培养基总重量0.2％-0.4％的水晶洋菜和1.5％-4.5％的蔗糖，培养基的pH值5.0-6.0。
2、 一种用如权利要求1所述的普陀鹅耳枥种胚培养基进行组 培快繁方法，包括如下操作步骤1)外植体的采集与选择要求种子的长度5-6毫米，种胚的长度O. 8-1.2mm,发育成熟的种子；(2)种子的洗净、灭菌与取种胚将成熟种子冲水四个小时 并用蒸馏水清洗干净后，放入1%次氯酸钠的溶液中真空抽滤灭菌 10min，然后无菌水冲洗5次，在无菌操作台上，利用解剖显微镜用剪刀及小镊子剥去种壳并用刀尖挑取种胚；(3 )接种与培养将切得的普陀鹅耳枥种胚接种到WPM盐类、 MT维生素、0. 001-0. lmg/L的BA即节Jt^腺嘌呤、50-l50mg/L 的肌醇、占培养基总重量0. 2%-0. 4%的水晶洋菜和1. 5%-4. 5%的蔗 糖种胚培养基中，暗培养2d后再置于光照周期16h/d、光照强度 2500Lux的冷光灯下、环境温度25土2X:中继续培养26d,共28d,便出现新绿色的生有才艮的试管苗；(4 )继代与诱导生根将该生根的试管苗去根进行继代培养， 每4周继代一次，经l-2次继代，即可诱导植林生根；(5)驯化移栽将生根良好的幼苗移至驯化室、光照强度20000Lux、驯化1-2周，将苗从试管取出，用温水冲洗苗根部培 养基，再用冷水冲洗，移栽至体积比为蛭石珍珠岩泥炭=1: 1: 1混合而成的盆^A工基质中，每盆苗套上透明塑料袋，每隔3 天将袋子剪一小口， 9-12d去袋移至温室即成。
全文摘要
一种普陀鹅耳枥种胚培养基，由下列原料配比而成WPM盐类、MT维生素、0.001-0.1mg/l的BA即苄氨基腺嘌呤、50-150mg/l的肌醇、占培养基总重量0.2％-0.4％的水晶洋菜和1.5％-4.5％的蔗糖，培养基的pH值5.0-6.0。用本培养基组培快繁包括下列操作步骤外植体的采集与选择、种子的洗净灭菌与取种胚、接种与培养、继代与诱导生根、移栽培养。本发明通过组培快繁方法，能大批量获得普陀鹅耳枥再生苗，拯救了这一作为地球独一的种质资源。并向社会公开了一种优良培养基与种苗快繁方法，为普陀鹅耳枥的进一步研究、探索新的生物工程打下基础。
文档编号C12N5/04GK101402937SQ20081012161
公开日2009年4月8日 申请日期2008年10月14日 优先权日2008年10月14日 公开号200810121615.发明者俞慈英, 张翠萍, 李修鹏, 林新春, 黄丽春 申请人:浙江林学院