专利名称：一种利用荧光假单胞菌制备紫菌红素乙的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用荧光假单胞菌制备紫菌红素乙的方法，制备的紫菌红 素乙在食品行业具有良好的应用前景，属于食品生物技术领域。
背景技术：
类胡萝卜素(carotenoids)是一类呈黄色、橙黄色或红色的多烯类化合物， 所有的光合生物以及许多非光合细菌、古菌和真菌均可在体内合成类胡萝卜素。 类胡萝卜素具有着色、抗氧化、抑癌、防动脉硬化、增强免疫、有利视觉保护 等多种功能，在食品、饲料、化妆品、医药等方面具有广泛的应用前景。目前， 类胡萝卜素已被FA0和WHO等国际组织认定为A级营养色素，并在50多个国家 和地区作为营养、着色双重功能的食品添加剂而被广泛应用于保健食品及医药 和化妆品工业。类胡萝卜素通常可通过化学合成、植物提取和微生物发酵三种 方法生产，但由于微生物发酵法生产类胡萝卜素具有不受环境条件限制、便于 工业化生产、工艺简单、质量稳定、成本低等优点，因此近年来引起国内外的 普遍重视。
类胡萝卜素种类很多，如番茄红素、a-胡萝卜素、胡萝卜素、叶黄素、 玉米黄素、紫菌红素等。紫菌红素乙(又名玫红品，Rhod叩in)，是紫菌红素的 一种，是无环四萜类化合物的天然类胡萝卜素。纯品为紫色结晶，熔点182 183°C (苯/石油醚)，分子式是C4。H580，结构式为
郝常明等(1999)通过柱层析和薄层色谱分析了光合细菌中的类胡萝卜素， 结果表明，光合细菌中存在番茄红素、紫菌红素乙和紫菌红素丁三种类胡萝卜 素。吕晓玲等(2003)用薄层层析法、分光光度法以及HPLC法对红酵母中的色 素成分进行分离和初步鉴定，共分离出四种组分，其中组分4可能是P-胡萝卜 素，2和3可能是类胡萝卜素中的紫菌红素和丫-胡萝卜素，组分1属于非类胡 萝卜素。平山修(1978)发现在培养Rp.capsulatus达到后期时，在5000 Lux 下培养的菌体含有相当多的螺菌黄素和羟基螺菌黄素，而在100 Lux下培养的 菌体中番茄红素和紫菌红素积累较多。
紫菌红素乙主要来源于微生物，已报道的来源微生物主要有红假单胞菌、 光合细菌、红酵母等，目前尚无关于从荧光假单胞菌提取紫菌红素乙天然色素 的报道。本制备方法的发明人之一赵博光在其发明专利(ZL 200410065471.7)
中公开了一种无菌松材线虫的培养方法，其中饲喂松材线虫的食物之一是灭活
的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluoresceins)GcM5-lA ( CCTCCNo: M 204065)。 我们在培养这种细菌时发现，在合适的培养基及培养条件下，该菌能积累一种 紫红色的成分，该成分的吸收光谱与类胡萝卜素的吸收光谱相似，我们进一步 优化了适合该菌累积这种色素的培养基、培养条件以及色素提取方法。本发明 首次公开了一种利用荧光假单胞菌(/^et^o/z70/7as /7woresce/7S GcM5-lA)制备 紫菌红素乙的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用微生物制备紫菌红素乙的新方法，该方法 提供了一种可用于制备紫菌红素乙的新的微生物，即荧光假单胞菌GcM5-lA
(尸sei/a^077as /7"oresce/is GcM5-lA)。依据该方法制备的紫菌红素乙可广泛 用作食品或化妆品添加剂。
为实现上述目的，本发明首先培养荧光假单胞菌GcM5-lA，所用的培养基为 改良LB液体培养基(1.0% NaCl，1.0%蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%葡萄糖， 0.01% MgS04 ，pH7.5)，培养温度是25-32"C，振荡培养时，摇床转速为100 200r/min，大量培养时间为12 24h,再转接到大量的改良LB培养基中，相同 条件下继续培养12 64h，得湿菌体。
培养液中的菌体经离心收集，用蒸馏水悬浮后，超声波细胞破碎后，用1 6倍于蒸馏水体积并添加了终浓度为0. 01% 0. 1%维生素C的丙酮于25-50。C浸 提，为加快提取速度，可在超声条件下浸提。离心，取上清液，反复浸提三次， 合并浸提液，减压浓縮，得到紫菌红素乙粗品。
紫菌红素乙粗品经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂，收集最先 洗脱出来的色素带，减压浓縮后，于-18'C结晶，得紫色的晶体，过滤、冷冻干 燥后，即得到紫菌红素乙纯品，所用的洗脱剂石油醚与乙酸乙酯的体积比为2: 1-1: 2，优选体积比为1: 1。
本发明方法优化了适合荧光假单胞菌GcM5-lA累积紫菌红素乙的培养基、 培养条件以及色素提取方法，提供了一种制备紫菌红素乙的新方法，工艺简单， 操作方便。本发明得到的紫菌红素乙纯品经薄层层析分析和EIMS鉴定，结构与 紫菌红素乙标准品的结构一致。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。 实施例1:
第一步，细菌培养与色素提取
挑取荧光假单胞菌(Psewc/o/z o77as/7woresce/7sGcM5-lA)单菌落于20mL改 良LB液体培养基(1.0% NaCl，1.0%蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%葡萄糖， 0.01%MgS04 ，pH7.5)中，28。C，165r/min振荡培养24h;后转接到2L改良LB 培养基中，相同条件下继续培养48h。 8000g离心15min收集菌体，得湿菌体 15. 9g。
菌体悬浮在50ml蒸馏水中，0。C条件下进行超声波细胞破碎(160w，工作10s， 间隔15s，反复15次)后，加入300ml添加了终浓度为0.05%维生素(作为抗 氧化剂的丙酮，封口后，于45。C下超声波振荡浸提4h， 4'C，10000g离心10min， 取上清液。反复浸提3次，合并浸提液，减压浓縮，得紫菌红素乙粗品浸膏1. lg。 第二步，紫菌红素乙的纯化
将紫菌红素乙粗品上硅胶柱(2. 6X20 cm)，以石油醚-乙酸乙酯(v/v=l:l) 作为洗脱剂，共得到三个明显的洗脱带，收集最先洗脱出来的色素带，减压浓 縮后，于-18。C结晶，得紫色的晶体，过滤、冷冻干燥后，得紫菌红素乙纯品 48. 6mg。
紫菌红素乙的结构鉴定
采用Agilent5973型质谱仪(EI离子源)对样品给出产品质谱，数据处理 后的谱图与标准谱库中的紫菌红素乙的谱图匹配，匹配度达90%;纯品与紫菌 红素乙标准品的丙酮溶液同时进行TLC(GF254)分析，分别以石油醚-乙酸乙酯(2: 1)，石油醚-丙酮(2: 1)，石油醚-乙酸乙酯(3: 1)做展开剂，两者的RF值 均一致，确定所得到的产品为紫菌红素乙。
实施例2:
第一步，细菌培养与色素提取
挑取荧光假单胞菌(/^e"t/o/Ho/7as/7i/aresce77sGcM5-lA)单菌落于20mL改 良LB液体培养基(1.0% NaCl，1.0%蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%葡萄糖， 0. 01% MgS04 ， pH7. 5)中，25°C， 200r/min振荡培养12h;后转接到2L改良LB 培养基中，相同条件下继续培养64h。 8000 g离心15min收集菌体，得湿菌体 16.7g。
菌体悬浮在50ml蒸馏水中，0。C条件下进行超声波细胞破碎(160w，工作10s， 间隔15s，反复15次)后，加入50ml添加了终浓度为0.0W维生素C作为抗氧 化剂的丙酮，封口后，于25。C下超声波振荡浸提5h， 4。C，10000g离心10min， 取上清液。反复浸提3次，合并浸提液，减压浓縮，得紫菌红素乙粗品浸膏0. 99g。 第二步，紫菌红素乙的纯化
将紫菌红素乙粗品上硅胶柱(2. 6X20 cm)，以石油醚-乙酸乙酯(v/v=2:l) 作为洗脱剂，共得到三个明显的洗脱带，收集最先洗脱出来的色素带，减压浓 縮后，于-18。C结晶，得紫色的晶体，过滤、冷冻干燥后，得紫菌红素乙纯品 41. 3mg。
实施例3:
第一步，细菌培养与色素提取
挑取荧光假单胞菌(/^ewc/o/z o/7as/7woresce/7sGcM5-lA)单菌落于20mL改 良LB液体培养基(1.0% NaCl，1.0%蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%葡萄糖， 0.01%MgS04 ，pH7.5)中，32°C， 100r/min振荡培养12h;后转接到2L改良LB 培养基中，相同条件下继续培养12h。 8000g离心15min收集菌体，得湿菌体 11.8g。
菌体悬浮在50ml蒸馏水中，(TC条件下进行超声波细胞破碎(160w，工作10s， 间隔15s，反复15次)后，加入300ml添加了终浓度为0. 1呢维生素C作为抗氧 化剂的丙酮，封口后，于50。C下超声波振荡浸提2h, 4。C,10000g离心10min， 取上清液。反复浸提3次，合并浸提液，减压浓縮,得紫菌红素乙粗品浸膏0. 91g。 第二步，紫菌红素乙的纯化
将紫菌红素乙粗品上硅胶柱(2. 6X20 cm)，以石油醚-乙酸乙酯(v/v=l:2) 作为洗脱剂，共得到三个明显的洗脱带，收集最先洗脱出来的色素带，减压浓 縮后，于-18。C结晶，得紫色的晶体，过滤、冷冻干燥后，得紫菌红素乙纯品 39. 4mg。
权利要求
1.一种利用荧光假单胞菌制备紫菌红素乙的方法，其特征在于按如下步骤操作用改良LB液体培养基培养荧光假单胞菌GcM5-1A；培养液中的菌体经离心收集，用蒸馏水悬浮后，超声波细胞破碎，用1～6倍于蒸馏水体积并添加了终浓度为0.01％～0.1％维生素C的丙酮于25-50℃浸提，离心，取上清液，反复浸提三次，合并浸提液，减压浓缩，得到紫菌红素乙粗品；紫菌红素乙粗品经硅胶柱层析，以体积比为21-12的石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂，收集最先洗脱出来的色素带，减压浓缩后，于-18℃结晶，得紫色的晶体，过滤、冷冻干燥后，即得到紫菌红素乙纯品。
2、 根据权利要求1所述的一种利用荧光假单胞菌制备紫菌红素乙的方法， 其特征在于所用的改良LB液体培养基为1. 0% NaCl， 1. 0%蛋白胨，0. 5%酵母提 取物，1.0%葡萄糖，0.01% MgS04 ，pH7.5，培养温度是25-32°C，振荡培养时， 摇床转速为100 200r/min,大量培养时间为12 24小时，再转接到大量改良 LB培养基中，相同条件下继续培养12 64小时，得湿菌体。
3、 根据权利要求1所述的一种利用荧光假单胞菌制备紫菌红素乙的方法， 其特征在于对菌体进行超声波细胞破碎的条件是(TC，16(k，工作10s，间隔15s， 反复15次。
4、 根据权利要求1所述的一种利用荧光假单胞菌制备紫菌红素乙的方法， 其特征在于为加快紫菌红素乙的提取速度，采用超声振荡浸提2-5小时。
5、 根据权利要求1所述的一种利用荧光假单胞菌制备紫菌红素乙的方法， 其特征在于洗脱剂石油醚与乙酸乙酯的优选体积比为1: 1。
全文摘要
本发明涉及一种利用荧光假单胞菌制备紫菌红素乙的方法。用改良LB液体培养基培养荧光假单胞菌GcM5-1A；培养液中的菌体用蒸馏水悬浮后，超声波细胞破碎，用1～6倍于蒸馏水体积并添加了终浓度为0.01％～0.1％维生素C的丙酮浸提，将浸提液减压浓缩，得紫菌红素乙粗品；粗产品经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂，收集最先洗脱出来的色素带，减压浓缩，低温结晶，紫色晶体经过滤、冷冻干燥后，即得到紫菌红素乙纯品。本方法优化了适合荧光假单胞菌GcM5-1A累积紫菌红素乙的培养基、培养条件以及色素提取方法，工艺简单，操作方便，制备的紫菌红素乙可广泛用作食品或化妆品添加剂。
文档编号C12P7/04GK101368191SQ20081013982
公开日2009年2月18日 申请日期2008年9月11日 优先权日2008年9月11日
发明者李荣贵, 赵博光, 郭群群, 郭道森 申请人:青岛大学;赵博光