专利名称：一种地衣芽孢杆菌201及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物保护领域，尤其涉及一种内生生防菌株，具体 地说涉及一种高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢杆菌201及应用。
背景技术：
香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)侵染引起的一种毁灭性病害，是香蕉生产的毁灭性土 传病害。病原菌从受伤的根茎侵入，通过维管束向假茎及叶部蔓延， 堵塞木质部导管，直至植株枯萎死亡。香蕉枯萎病菌是土壤习居菌， 其厚垣孢子能够在土壤中存活8 10年。香蕉枯萎病在中国珠江三 角洲香蕉产区的多个县市均有分布，病园病株率约为10% 40%， 严重的达90%以上，以致蕉园丢荒。
目前对该病的防治尚无理想药剂和抗病品种， 一些栽培管理措 施只能起到局部的控制作用，寻找一种经济、安全、有效的防治措 施是当务之急，生物防治不失为重要的辅助手段，其中拮抗细菌在 植物病害生物防治中起到非常重要的作用，其主要优势在于1)种 类和数量众多，在植物根际根内、根际大量存在；2)对病原菌的作 用方式多种多样，包括竞争、拮抗、寄生、诱导植物抗性的产生等； 3)繁殖速度快；4)许多细菌在植物的根内或根际定殖力强；5)细 菌大多能够人工培养，易于操作，便于生产应用；6)有些细菌不仅 能够防治病害而且可以增加作物产量。从香蕉植株内分离筛选获得 对香蕉枯萎病菌具有拮抗作用的生防细菌菌株，对香蕉枯萎病的防治具有重要意义，但目前相关技术仍旧很薄弱甚至空白。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的空白，提供一种高效防治香蕉枯
萎病的地衣芽孢杆菌201，地衣芽孢杆菌201是一种从香蕉植株内分 离筛选获得对香蕉枯萎病菌具有拮抗作用的生防细菌菌株，对香蕉 枯萎病的防治具有重要意义。
本发明另一个目的是提供了所述高效防治香蕉枯萎病的地衣芽 孢杆菌201在防止香蕉病灾害方面的多种应用。
本发明的技术方案是提供一种高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢 杆菌201，」fe"'W〃s h'c力ey7j'/br啦's 201，于2007年7月2日在湖 北武汉武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号 CCTCCNO: M207092,在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈灰白色，圆形， 平展，无光泽，边缘整齐，菌落直径一般2 3mm，菌体直杆状，大 小为2.06X0.70Mm，芽孢呈椭圆形。
本发明所述高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢杆菌201可通过平 板对峙、盆栽试验筛选获得。
本发明还提供了所述的高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢杆菌201 的应用，其一是对香蕉枯萎病菌4号小种菌丝的抑菌作用。
其二是在23 25'C的温室条件下对香蕉枯萎病菌4号小种菌丝 的抑制作用。
其三是对香蕉枯萎病菌4号小种菌丝分生孢子萌发的抑制作用。 其四是对香蕉枯萎病菌4号小种菌丝的致畸作用。其五是对西瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、胶胞炭 疽菌、玉米弯孢叶斑病菌、棉花黄萎病菌或小麦赤霉病菌病原真菌具 有拮抗作用。
本发明的有益效果是
(1) 地衣芽孢杆菌201为植物内生菌，对香蕉枯萎病菌抑制作 用强，对多种病原真菌具有拮抗作用，具有拮抗细菌在植物病害生物 防治中所起到的非常重要的作用，例如种类和数量众多，在植物根 际根内、根际大量存在；对病原菌的作用方式多种多样；繁殖速度 快等优点，尤其是对香蕉枯萎病的防治具有重要意义。
(2) 本发明所述菌株培养条件简单、容易保存，易于工业化生 产，具有良好的开发应用前景。
图1 10X40倍显微镜下测定抑菌带的直径观察倍地衣芽孢杆菌
201对FOC4菌丝的抑制作用
图2正常生长的FOC4菌丝(10X40倍)； 图3地衣芽孢杆菌201对FOC4菌丝的致畸作用 图4地衣芽孢杆菌201对FOC4菌丝的致畸作用 图5正常萌发的FOC4分生大孢子(10X40倍) 图6正常萌发的FOC4分生小孢子(10X40倍) 图7经菌株201处理48h后的FOC4分生大孢子 图8经菌株201处理48h后的FOC4分生的大孢子
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步详细的描述。
所述地衣芽孢杆菌201， 5acW7ws h'c/ e/7i/o77^'s201，于2007 年7月2日在湖北武汉武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心 保藏，保藏号CCTCCNO: M207092。
实施例1地衣芽孢杆菌201对香蕉枯萎病菌4号小种菌丝FOC4的 抑制作用
将香蕉枯萎病菌4号小种菌丝FOC4直径为5mm菌丝块接入马 铃薯蔗糖培养基PDA平板中央，将直径为5mm的灭菌滤纸片三片等 距离接种于FOC4菌丝块周围，每片滤纸片上滴加培养24h的菌株 201培养液10PL。三次重复，25 28。C培养，5天后测定抑菌带的直 径。由附图1可见地衣芽孢杆菌201对香蕉枯萎病菌抑菌作用强。 实施例2地衣芽孢杆菌201在温室条件下对香蕉枯萎病的抑制
将株高约为10cm的巴西香蕉幼苗浸入菌株201的培养液中，培 养液OD等于0.5， 30min后取出，种植于花盆中。分别在第2d、第 7d、第15d和第30d,将蕉苗拨起，浸入FOC4的孢子悬浮液中30min， 孢子悬浮液1X105个孢子/mL，再种植于花盆中，每个花盆处理36 株。接种后香蕉苗放置在23 25"C的温室中培养，每日淋水一次。 接种FOC4后20天、30天、40天调査发病率和病情指数。结果表明， 菌株201接种15天、30天后挑战接种FOC4，与对照相比，香蕉幼 苗发病率显著下降，接种香蕉枯萎病菌后40天，香蕉苗发病率分别 为43.5%和29.8%，病情指数分别为82%和57%，而对照株发病率在 95%以上；病情指数在98%以上。实施例3 地衣芽孢杆菌201对FOC4菌丝的致畸作用
将玻璃纸剪成5mmX25mm的长条状，12rC高压灭菌，用镊子 将其铺放于菌株201和病原菌FOC4之间。28"C恒温培养5 7天， 待菌株201和FOC4菌丝之间出现明显抑菌带后，将玻璃纸小心取下， 置于10X40倍的显微镜下观察菌丝的形态变化，以不接菌株201的 病原菌为对照。观察到菌丝前期膨大突出，后期明显变细，分枝多而 短，形态不均匀，可通过10X40倍显微镜下观察菌丝的形态变化了 解地衣芽孢杆菌201对FOC4菌丝的致畸作用实验结果见附图2 4，其中附图1是正常生长的FOC4菌丝(10X40倍)；附图2显示 前期菌丝膨大突出(10X40倍)；附图3显示后期多数菌丝变尖细， 分枝多而短，形态不均匀(10X40倍)。
实施例4地衣芽孢杆菌201对香蕉枯萎病菌4号小种菌丝FOC4分 生孢子萌发的抑制作用
吸取10PL的FOC4孢子悬浮液，滴加到凹玻片上。风干后，滴 加菌株201的培养液，以滴加无菌水为对照。每处理重复5次， 置于28"C培养箱中培养，48h以后镜检孢子萌发情况。观察到分生孢 子大多变得细长，少数孢子的两端出现泡状物，通过10X40倍镜检 孢子萌发情况了解地衣芽孢杆菌201对FOC4分生孢子萌发的抑制 作用，实验结果见附图5 附图8，附图5为48h后观察到的正常萌 发的FOC4分生大孢子(10X40倍)；附图6为正常萌发的FOC4分 生小孢子(10X40倍)；附图7为菌株201处理48h后，多数FOC4 分生大孢子萌发被抑制，孢子变得细长(10X40倍)；附图8为少数FOC4分生的大孢子两端出现泡状物(10X40倍)。 实施例5地衣芽孢杆菌201对多种病原菌的拮抗作用。
将振荡培养40h的菌株201培养液配成浓度约为 1.0X109CFU/mL (OD值约为0.5)的悬浮液，10000g离心10min， 取上清液，在培养皿加入lmL上清液，再倒入10mLPDA培养基， 混匀，待平板冷却凝固后，分别接入不同的病原真菌西瓜枯萎病菌， 番茄枯萎病菌，香蕉炭疽病菌，胶胞炭疽菌，玉米弯孢叶斑病菌，棉 花黄萎病菌和小麦赤霉病菌。以加入lmL肉膏蛋白胨培养基NB为 空白对照，25 28i:培养5 7天，计算相对抑制率。从表l的实验 结果可以得出地衣芽孢杆菌201对多种病原菌均具有较强的抑制作 用。
表1地衣芽孢杆菌201对多种病原菌的抑制作用
病原菌相对抑制率(％)
西瓜枯萎菌58.67士3.875b
番茄枯萎菌76.92士1.693b
香蕉炭疽菌91.39士2.236a
胶胞炭疽菌62.75士0.493a
弯孢叶斑菌60.10士1.163a
棉花黄萎菌82.38士0.953a
小麦赤霉菌65.07士l,222b
注相对抑制率为三次重复的平均值士标准误。DMRT检验法进
8行统计检验，同行具有相同字母的数据间无显著差异(p=0.05)。
权利要求
1、一种地衣芽孢杆菌201，于2007年7月2日在湖北武汉武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC NOM207092。
2、权利要求1所述地衣芽孢杆菌201的制备方法，其特征在于 所述地衣芽孢杆菌201通过平板对峙和盆栽试验筛选获得。
3、 权利要求1所述地衣芽孢杆菌201的应用，其特征在于对香 蕉枯萎病菌4号小种菌丝的抑制作用。
4、 权利要求1所述地衣芽孢杆菌201的应用，其特征在于在23 25'C的温室条件下对香蕉枯萎病菌4号小种菌丝的抑制。
5、 权利要求1所述地衣芽孢杆菌201的应用，其特征在于对香 蕉枯萎病菌4号小种菌丝分生孢子萌发的抑制作用。
6、 权利要求1所述地衣芽孢杆菌201的应用，其特征在于对香 蕉枯萎病菌4号小种菌丝的致畸作用。
7、 权利要求1所述地衣芽孢杆菌201的应用，其特征在于对西 瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、胶胞炭疽菌、玉米弯孢 叶斑病菌、棉花黄萎病菌或小麦赤霉病菌病原真菌具有拮抗作用。
全文摘要
本发明公开了一种地衣芽孢杆菌201，Bacillus licheniformis 201，于2007年7月2日在湖北武汉武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC NOM207092。本发明同时公开了其制备方法和应用，地衣芽孢杆菌201对香蕉枯萎病菌抑制作用强，抑菌谱广，对香蕉枯萎病菌，西瓜枯萎病菌，番茄枯萎病菌，香蕉炭疽病菌，胶胞炭疽菌，玉米弯孢叶斑病菌，棉花黄萎病菌，小麦赤霉病菌等多种病原真菌都具有拮抗作用，防效高，环境安全性好，具有良好的开发应用前景。
文档编号C12N1/20GK101486978SQ20081018307
公开日2009年7月22日 申请日期2008年12月2日 优先权日2007年12月4日
发明者孙正祥, 王振中, 王春华, 纪春艳 申请人:华南农业大学