专利名称：植物叶际高温菌的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种植物叶际高温菌的筛选方法，属于微生物技术领域。
背景技术：
高温菌是一类能在45t:以上生长和繁殖的极端环境微生物，包括部分细菌、古菌
和真菌。其中，最适生长温度在45°C 8(TC之间的高温菌为中度嗜热菌，最适生长温度大
于8(TC的微生物为超温菌(hyperthennophiles)，包括处于系统进化树底部的部分细菌和
古菌。高温菌的理论价值和应用价值越来越受到人们的重视，利用嗜热菌产生的嗜热酶作
为生物催化剂的研究较多。研究结果表明，从这些微生物中分离的酶具有一些优良的生物
学性质，如热稳定性、以及对化学和物理变性剂、有机溶剂、极端PH等不利因素的抗性等。
这些性质不仅可作为设计和改造酶类的依据，而且在工业生产中极具应用价值。 植物的叶际是指植物的地上部分，包括叶、茎、花、果等的表面或内部的小环境，在
强烈的日照下，其表面温度可以达到4(TC 55t:。在植物的叶际范围内生活着多种微生
物，主要有细菌、真菌、放线菌等，这些在叶际生存的微生物称为叶际微生物；它们对固定大
气中的氮、保护叶片减轻冻害、剌激植物生长、防治植物病虫害、降解农药残留等方面都有
重要的作用。 对叶际微生物的研究已有多年历史，主要集中于植物病原微生物的研究，近年来 也有文献报道了叶际微生物群落组成和各种环境因子对叶际微生物群落的影响。关于叶际 高温微生物的研究还没有文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种有效的筛选叶际高温微生物的方法。
本发明所述的筛选叶际高温微生物的方法如下
1、富集培养基配制 (1)淀粉降解菌培养基(w/v):可溶性淀粉O. 5% -3. 5%、蛋白胨0. 5% -2. 0%、酵 母粉O. 5% -2. 0%、氯化钠0. 3% -1. 5%、自然pH。 (2)油脂降解菌培养基(w/v):蛋白胨O. 5% -2. 0%、酵母粉0. 3% -2. 0%、氯化钠 0. 3% -1. 5%、豆油0. 5% -1. 5%、自然pH。 (3)蛋白质降解菌培养基(w/v):酪蛋白0. 5% _3.0%、硝酸钠0. 1% -0. 5%、 磷酸氢二钠O. 05% -0. 2%、氯化钾0. 03% -0. 06%、硫酸镁0. 03 % -0. 06%、硫酸亚铁 0. 001% -0. 003%、自然pH。 2、高温富集培养将选用的植物茎、叶剪碎，按2% -10% (w/v)放入富集培养基 中，培养温度为45°C 80°C ，水浴摇床培养12h 120h后，转入新鲜的富集培养基中，这样 反复2 5次。 3、稀释分离在富集培养基中按1. 5% 2. 0% (w/v)的比例添加琼脂，配制成相 应的固体富集培养基，高压灭菌后，倒平板；将液体富集培养物稀释、涂板，放入45°C -70°C恒温培养箱中培养12h 120h，至平板生长出明显的单菌落。
4、菌种的筛选 (1)淀粉降解菌向培养好的淀粉降解菌固体富集培养基平板中滴加碘液放置 5 20min，平板中菌落周围出现透明圈为淀粉降解菌。 (2)油脂降解菌向培养好的油脂降解菌固体富集培养基平板中添加中性红指示 剂，如果培养基中的脂肪被降解，产生脂肪酸，遇到中性红指示剂会变成红色，所以出现红 色斑点的菌落为油脂降解菌。 (3)蛋白质降解菌由于蛋白质降解菌富集培养基中酪蛋白为唯一碳源，所以涂
平板后能够生长的菌就是蛋白质降解菌。 5、菌种的分离纯化 挑取具有以上特征的单菌落，在固体富集培养基上划线分离、纯化培养，培养温度 与富集培养温度相同，直至出现单菌落，再挑取划线，这样反复2 3次后，即筛选出不同功 能的叶际高温微生物。 本发明技术方案可以从不同植物的叶际筛选出不同功能的高温微生物。以下通过 具体实施例详细说明本发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但 不作为对本发明实施范围的限定。
实施例1 : 第一步，富集培养基配制，如下 (1)淀粉降解菌培养基可溶性淀粉2g、蛋白胨lg、酵母粉0. 5g、氯化钠1. Og，用 100mL自来水溶解，12rC灭菌20min。 (2)油脂降解菌培养基蛋白胨lg、酵母粉0. 5g、氯化钠lg、大豆油lg，用100mL自 来水溶解，121。C灭菌20min。 (3)蛋白质降解菌培养基酪蛋白1.2g、硝酸钠0. lg、磷酸氢二钠0. lg、氯化钾
0. 05g、硫酸镁0. 05g、硫酸亚铁0. OOlg，用100mL自来水溶解，121。C灭菌20min。 第二步，富集培养称取松树茎、叶10g，剪碎至约lcm长，放入盛有150ml液体富
集培养基中，于55t:下，水浴摇床培养48h，然后，按照5 %的接种量，转接入新的富集培养
基中，这样反复3次。 第三步，稀释分离在富集培养基中按1.5% 2.0% (w/v)的比例添加琼脂，配制 成相应的固体培养基，灭菌后，倒平板；将液体富集培养物稀释、涂板，放入55t:恒温培养 箱中培养48h，至平板生长出明显的单菌落。
第四步，菌种的筛选 (1)淀粉降解菌向培养好的淀粉降解菌固体培养基平板中滴加碘液放置15分钟 后，平板中菌落周围出现透明圈为淀粉降解菌。 (2)油脂降解菌向培养好的油脂降解菌固体培养基平板中添加中性红指示剂， 培养基后，出现红色斑点的菌落为油脂降解菌。 (3)蛋白质降解菌在蛋白质降解菌培养基平板上生长良好的菌落就是蛋白质降 解菌。 第五步，菌种的分离纯化挑取以上固体培养基平板上的单菌落，转接在相同固体
培养基上划线分离、55t:培养，直至出现单菌落，再挑取单菌落划线分离、55t:培养，纯化出筛选的叶际高温微生物。 第六步，菌种的鉴定经PCR扩增筛选出来的高温微生物的核糖体小亚基基因 (16S rDNA或18S rDNA)，测序，与GenBank数据库中的序列比对，找出亲缘性最接近的菌 种，再结合形态学特征观察和生理生化实验鉴定出上述筛选的高温菌的归属。
通过上述步骤，分离筛选得到3株高温细菌，包括一株高温蛋白降解菌 (A丽ybacillus sp. Bl)、一株高温淀粉降解菌(Bacillus subtilis Dl)禾口一株高温油 脂降解菌(Sphingobacterium sp. Z2)，它们的16S rDNA序列递交到了 GenBank数据库， 登陆号分别为FJ268956(Anoxybacillus sp. Bl) 、 FJ268958 (Bacillussubtilis Dl)和 FJ268960(Sphingobacterium sp.Z2)。
实施例2 : 第一步，富集培养基配制，如下 (1)淀粉降解菌培养基可溶性淀粉2g、蛋白胨0. 5g、酵母粉1. 0g、氯化钠0. 5g， 用100mL自来水溶解，12TC灭菌15min。 (2)油脂降解菌培养基蛋白胨0.5g、酵母粉1.0g、氯化钠0.5g、大豆油1.5g，用 100mL自来水溶解，12rC灭菌15min。 (3)蛋白质降解菌培养基酪蛋白2. 0g、磷酸氢二钠0. lg、氯化钠0. 5g、氯化钾
0. 03g、硫酸镁0. 03g、硫酸亚铁0. 002g，用100mL自来水溶解，121。C灭菌15min。 第二步，富集培养称取槐树茎、叶15g，剪碎至约lcm长，放入盛有200ml液体富
集培养基中，于55t:下，水浴摇床培养48h，然后，按照5 %的接种量，转接入新的富集培养
基中，这样反复3次。 其他步骤与实施例1相同。 通过上述步骤，分离筛选得到2株高温细菌，包括一株高温淀粉降解菌 (Aneurinibacillus sp. D2)和一株高 益油脂降解菌(Aneurinibacillus sp.Z3)，它们 的16S rDNA序列递交到了 GenBank数据库，登陆号分别为FJ268959 (Aneurinibacillus sp.D2)禾口 FJ268961(Aneurinibacillus sp.Z3)。
权利要求
一种从植物叶际筛选高温菌的方法，其特征在于，该方法包括富集培养基配制、高温富集培养、稀释分离、菌种筛选、菌种纯化五个步骤，得到不同功能的高温菌。
2. 权利要求l所述的从植物叶际筛选高温菌的方法，其特征在于，富集培养基配制包括三种培养基的配方，(1)淀粉降解菌培养基(w/v):可溶性淀粉0.5%-3.5%、蛋白 胨0.5% -2.0%、酵母粉0.5% -2.0%、氯化钠0.3% -1.5%、自然pH ; (2)油脂降解菌 培养基(w/v):蛋白胨O. 5% -2. 0%、酵母粉0. 3% -2. 0%、氯化钠0. 3% _1.5%、豆油 0.5% -1.5%、自然pH;(3)蛋白质降解菌培养基(w/v):酪蛋白0.5% -3.0%、硝酸钠 0. 1 % -0. 5 % 、磷酸氢二钠0. 05 % -0. 2 % 、氯化钾0. 03 % -0. 06 % 、硫酸镁0. 03 % -0. 06 % 、 硫酸亚铁O. 001% -0. 003X、自然pH。
3. 权利要求1所述的从植物叶际筛选高温菌的方法，其特征在于，高温富集培养是将 选用的植物茎、叶剪碎，按2%-10% (w/v)放入富集培养基中，培养温度为45t: 8(rC，水 浴摇床培养12h 120h后，转入新鲜的富集培养基中，这样反复2 5次。
4. 权利要求1所述的从植物叶际筛选高温菌的方法，其特征在于，菌种的筛选包括 (1)淀粉降解菌的筛选，是向培养好的淀粉降解菌固体富集培养基平板中滴加碘液放置 5 20min，平板中菌落周围出现透明圈为淀粉降解菌；(2)油脂降解菌的筛选，是向培养好 的油脂降解菌固体富集培养基平板中添加中性红指示剂，如果培养基中的脂肪被降解，产 生脂肪酸，遇到中性红指示剂会变成红色，所以出现红色斑点的菌落为油脂降解菌；(3)蛋 白质降解菌的筛选，是由于蛋白质降解菌富集培养基中酪蛋白为唯一碳源，所以涂平板后 能够生长的菌就是蛋白质降解菌。
全文摘要
高温菌是一类能在45℃以上生长和繁殖的极端环境微生物，其在工业生产中极具应用价值。植物的叶际在强烈的日照下，其表面温度可以达到40℃～55℃。本发明涉及一种从植物叶际筛选不同功能高温菌的方法，属于微生物技术领域。该方法主要是在高温条件下，采用不同的选择性培养基，从植物茎、叶富集、筛选不同功能的高温菌。筛选步骤包括(1)富集培养基的配制；(2)高温富集培养；(3)稀释分离；(4)菌种筛选；(5)分离纯化。然后将筛选得到的纯菌株进行鉴定并保存。
文档编号C12N1/14GK101724581SQ20081022488
公开日2010年6月9日 申请日期2008年10月24日 优先权日2008年10月24日
发明者庄国强, 张倩, 李林, 杨建州, 白志辉, 齐鸿雁 申请人:中国科学院生态环境研究中心