一株同时降解黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A的菌株的筛选、培养和应用的制作方法

专利名称：一株同时降解黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A的菌株的筛选、培养和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种同时降解AFB1和OTA的地衣芽孢杆菌CBflc/〃zw //c/^w/om/》MZH-ll ， 己经于2008.10.10在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编 号为CGMCC No.2775;本发明还涉及地衣芽孢杆菌(S. //cte"^rm,'力CGMCC No.2775的分 离、培养保存方法及应用。
背景技术：
黄曲霉毒素(aflatoxin， AFT)是ttUiSpe/^〃iwy7av船、A "om/w、爿.p"nxy/"cw,y等多禾屮真-菌 产生的次级代谢产物，其中黄曲霉毒素B1 (AFB1)分布范围最广且化学性质最稳定，具有很 强的致癌性、致突变性和致畸性，是国际认可的A类致癌物。
赭曲霉毒素A (OTA)是赭曲霉毒素中毒性最强，分布范围最广的化合物。1993年IARC 将其确定为2B类致癌物。食品法典委员会(2001)认定赭曲霉毒素对人类威胁最重要的食品 类别依次为谷类>葡萄及其制品〉咖啡豆及其制品>其他。
AFB1和0TA均属于剧毒化学品(LD50《lmg.kg".bw)。而且在谷物里会同时存在，AFB1 和人类的肝癌有正相关；OTA可能是地区性慢性肾病以及尿道肿瘤的原因。针对婴儿食品， 国际黄曲霉毒素Bl的最低限量标准为0.1(H^kg—'，2006年欧盟最新的赭曲霉毒素A的最大限量 为0.50ngkg-'。
地衣芽孢杆菌是普遍认可的一个功能菌株。已经在医学方面有应用，例如调整肠道菌群 等。地衣芽孢杆菌可以抑制真菌，本发明中解除毒素的作用，可以应用到饲料领域；其纯化 的代谢物也可以有条件的应用到食品领域。

发明内容
为了减少AFBl和OTA对人和动物的危害，减少真菌毒素在饲料和食品中的含量，最终保 证食品安全，本文通过选择样本、初筛、复筛、验证效果，获得1株地衣芽孢杆菌(A //cfe^/^vm'力 CGMCC No.2775，该菌株可以同时降解AFB1和0TA，加标玉米中AFB1和0TA的平均降解率 分别达到78%和83%。
地衣芽孢杆菌(5./fc/zew/w7mX)CGMCCNo.2775的形态学特征为杆状，芽孢屮生，革兰 氏染色阳性，菌落光滑，边缘不整齐，与营养琼脂培养与培养基结合较紧密；地衣芽孢杆菌 (5.//ctem/w7w;y)CGMCCNo.2775的形态学特征为接触酶阴性，氧化酶阴性，发酵葡萄糖、 果糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖，不发酵半乳糖、棉籽糖、乳糖，菌株生长耐10%的盐，耐6(TC 温度，淀粉水解酶阳性，明胶水解阴性，pH值5-9牛长；其分子生物学特征，16srDNA序列AGCAAGCTCCCGTCGGTCCGCTCGAC)
本发明中提供了地衣芽孢杆菌(及//c/zera/onm力的筛选、分离方法以及培养、保存方法。
本发明之所以获得可以同时降解AFB1和OTA的地衣芽孢杆菌(B. //c/^ //o /aO，主要是 采用了合适的样本来源(从动物粪便、发霉粮食、腐败饲料、枯枝败叶以及发酵食品等)，初 筛和复筛的二次筛选方法，而且，在初筛中选择了合适的、特定的初筛培养基(A:基本培 养基，磷酸氢二铵0.01-0.1%，磷酸二氢钾0.1-0.2%，磷酸氢二钠0.3-0.4%,硫酸钠 0.05-0.1%,硝酸钠0.1-0.2 g,琼脂1.2-2%， pH7.2-7.4; B:香豆素《0.5%)，培养温度36士1。C， 筛选出的菌株可能能够降解具香豆素结构的化合物(例如，AFB1或者OTA)。
之后选择复筛降解AFB1的培养基(蛋白胨0.5-1%,牛肉膏0.3-1%, AFB1 0.1-5mg/L， pH7.2-7.4)，以及降解OTA的培养基(蔗糖2-3%,硝酸钠0.2-0.3%,磷酸二氢钾0.1-0.2%,硫酸镁0.05-0.1%,氯化钾0.05-0.1%,硫酸亚铁0.001-0.005%， OTA达到0.1-5mg/L，pH6.0-6.5)
分别检测降解毒素的能力，温度36士rC培养，该方法筛选出的阳性菌株就能够降解AFB1和 OTA，选择其中生长最好的一株菌株MZH-ll。
本发明之一还在于在常规培养和保存中，既能保有菌株降解AFB1和OTA的性质，又能 保证其:iF.常生长，采用了特殊的保存培养基(蛋白胨0.1-0.5%,牛肉膏0.1-0.5%,香豆素《 0.05%，pH7.2-7.4)，培养温度同上，常规保存温度在4。C。
本发明还包括应用到加标的粮食样本中(AFB1和OTA分别为0.1-5 mg/L)，对AFB1和 OTA的进行降解。可以初步应用到饲料行业。 有益效果
本发明通过使用地衣芽孢杆菌(5. //c/zem/orw/,力CGMCC No.2775，降解粮食中的AFB1 和OTA，加标玉米的AFB1和OTA浓度分别为0.1-5mg/L时，多次试验的AFB1和OTA平 均降解率分别达到82.2和78.7%。 保藏信息说明
本发明的地衣芽孢杆菌CB. //c^M^onwX)MZH-11菌株，已经于2008.10.10在中国微生物
菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏(中国、北京、朝阳区大屯路甲3号中国
微生物所内)，保藏编号为CGMCC No. 2775。
具体实施例方式
下面结合具体实施范例，进一歩阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。
实施例1
降解AFB1和OTA的芽孢杆菌(5ac///^ spp)菌株的初筛 以动物粪便、发霉粮食、腐败饲料、枯枝败叶以及发酵食品等为材料，采用8(TC水浴15min 后的梯度稀释分离法，37'C好氧营养琼脂培养(蛋白胨5g;牛肉膏3g;水1000mL; pH7.2-7.4)， 获得1500多株芽孢菌菌株。
以香豆素为惟一碳源和能源进行AFB1和OTA降解菌株的初筛。配制浓度为《0.5%香豆 素溶液(初筛培养基B组分)，选取筛选到的芽孢菌，用灭菌竹签接丁装有香豆素溶液的36 孔接种器中，然后接种到初筛培养基A中，保证香豆素成为惟一的碳源和能源，将其置于 37'C培养箱中培养一周，观察菌株的生长情况。将10株生长较好的菌落在保存培养基试管斜 面上划线培养(蛋白胨5g;牛肉膏3g;水1000mL;香豆素《0.05%; pH7.2-7.4)。这些菌株可 能降解具香豆素结构的化合物——AFB1、 OTA。
菌株通过梯度稀释倾注平板法分离单菌落，镜检验证其纯度，试管斜面冷藏使用，并将 菌株备份保存于甘油管中，放置于-2(TC的冰箱保藏。实施例2
降解AFB1芽孢杆菌(5"c///^ spp)菌株的复筛 初筛菌株分别接种于降解AFB1的复筛培养基(不加AFB1)中发酵24小时，取800 菌体发酵液加入200 nL的AFB1 (500昭-kg")置于灭菌的玻璃试管中，以无茼降解AFB1的 复筛培养基作为空白对照，将其置于37。C培养箱培养72小时，做三次重复。结果MZH-ll 的降解AFB1能力最强，降解率达到84.5%; 39-4的降解能力次之，第三是E-2 (表l)。而 且前几个菌株在固体培养基生长的速度比较快，香豆素利用能力较强，复筛结果证实这3株 菌均能降解AFB1 (AFB1降解率》75%)。
表1初筛菌株降解AFB1的检测结果
序号菌株编号AFB1降解率(％)序号菌株编号AFB1降解率(％)
1MZH-ll84.56MZH-160.5
239-4肌67MZH-560.0
3E-275.28MZH-355.5
4BJ-1772.09MZH-746.4
5FSL-270.010MZH-8-
*对照的AFB1值设为100% -表示检测结果不确定
实施例3
同时降解OTA的芽孢杆菌MZH-ll的复筛和鉴定 选择芽孢杆菌MZH-ll、 39-4、 E-2菌株活化培养，分别接种于降解OTA的复筛培养基 (不加OTA)中发酵24小时，取发酵液20mL，加入100吗的OTA (5mg'kg")青于灭菌的 玻璃试管中，以无菌的降解OTA的复筛培养基作为空白对照(CK),将其置于37'C培养箱 避光培养36小时，做三次重复。结果MZH-11的降解OTA能力最强，降解率达到73.6%(表 2)。而且该菌株在固体培养基生长的速度较快，菌落较大，复筛结果证实其不仅降解AFB1， 还能够降解OTA。
选择MZH-11进行培养鉴定，形态学表现为杆状，有芽孢，革兰氏染色阳性，菌落光滑， 边缘不整齐，与营养琼脂培养与培养基结合较紧密；生理生化反应结果为接触酶阴性，氧 化酶阴性，发酵葡萄糖、果搪、庶糖、海藻糖、麦芽糖，不发酵半乳糖、棉籽糖、乳糖，菌 株生长耐10%的盐，耐60'C温度，淀粉水解酶阳性，明胶水解阴性，pH值5-9生长，最适 培养温度37°C;参考《伯杰氏细菌鉴定手册》初歩鉴定MZH-ll属于芽孢杆菌属(^ic///^， sp)，通过其16srDNA序列，鉴定为地衣芽孢杆菌(S"c///^//c/^w/w7m\y)。
表2降解AFB1的菌株降解OTA的检测结果
序号菌株编号OTA初始浓度OTA浓度(mg'kg—1)OTA降解率(％)
1MZH-115mg'kg-11.30±0.1573.6
239-45mg.kg」1.94±0.1761.2
3E陽25mg'kg"2.61±0.2152.2
4CK5mg'kg"4.92±0.12
*对照的OTA值设为100%
实施例4
地衣芽孢杆菌CGMCCNo.2775同时降解粮食中的AFB1和OTA(浓度分别为0.1mg/L) 粮食中含有AFB1或OTA会给人畜造成危害，AFB1表明和人类的肝癌有关系，OTA的 实验动物结果表明其具致癌、致畸、致突变的危害。而且，常常多种真菌毒素存在于一类商 品中。我国用于食用的粮食中规定其含量均低于5吗.lcg—'。本发明中的地衣芽孢杆菌(S. //cfew/orw/;f) CGMCC No.2775可同时降解粮食中的AFB1和OTA(浓度分别为0.1mg/L)，降 解率均高于80% (表3)。
300mL三角瓶中加入100g不含AFB1和OTA的玉米面，灭菌备用。其中加入AFB1和 OTA标准品，分别达到100 ng.kg",接种10、fu/mL浓度的地衣芽孢杆菌100mL， 37。C避光 培养，头'验设不加菌的对照(CK)。 72小时后检测AFB1和OTA，设三个重复。
表3 地衣芽孢杆菌(及//c/ em/onrn'》CGMCC No.2775降解玉米中AFB1和OTA的检测结果
序号AFB1浓度(ng.kg-')AFB1降解率(％)OTA浓度0ig.kg—1)OTA降解率(°/。)
112.8±2.588.618.6±3.084.4
2(CK)103.4±3.6108±4.2
*对照的AFB1和OTA值设为100%
试验表明，地衣芽孢杆菌(A //ctew/onw》CGMCC No.2775能够同时降解加标玉米中 AFB1和OTA，降解率达至lj 88.6%和84.4%。
实施例5
地衣芽孢杆菌CGMCCNo.2775同时降解玉米中的AFB1和OTA(浓度分别为0.5mg/L)用粮食(尤其是玉米)中含有AFBl《20[xg.kg人含有OTA的限量 为《10(Vg.kg人我国的饲用用玉米中就同时检出过AFB1和OTA。玉米中的AFB1和OTA 浓度分别为0.5mg/L时，本发明中的地衣芽孢杆菌(5. &Aem> /》CGMCC No.2775可同时 降解其中的AFBl和OTA， AFBl和OTA的平均降解率分别达到78%和83% (表4)。
300mL三角瓶中加入100g不含AFBl和OTA的玉米面，灭菌备用。其中加入AFBl和 OTA标准品，分别达到500 ng.kg人接种10"cfu/mL浓度的地衣芽孢杆菌lOOmL， 37'C避光 培养，实验设不加菌的对照(CK)。 72小时后检测AFB1和OTA,设三个重复。
表4 地衣芽孢杆菌(S. //c/^w/wvmX) CGMCC No.2775降解玉米中AFB1和OTA的检测结果
序号AFB1浓度(叫.kg-')AFB1降解率(％)OTA浓度(吗.kg-')OTA降解率(％)
185.1±11.582.9109.3±9.578.3
2(CK)496.0±6.4502.4±8.7
*对照的AFB1和OTA值设为100%
试验表明，地衣芽孢杆菌(及"c&ra:/^w的CGMCC No.2775能够同时降解加标玉米中 AFB1和OTA，降解率分别达到80.5-85.2%和76.4-80.1%，平均降解率为82.9%和78.3%。
实施例6
地衣芽孢杆菌CGMCCNo.2775同时降解玉米中的AFB1和OTA(浓度分别为5mg/L) 在玉米样本中添加AFB1禾H OTA浓度高达5mg/L时，地衣芽孢杆菌(5. //c/ze /w7m'力 CGMCCNo.2775仍然可以同时降解粮食中的AFB1和OTA，降解率超过70% (表5)。
300mL三角瓶中加入100g不含AFBl和OTA的玉米面，灭菌备用。其中加入AFB1和 OTA标准品，分别达到5mg.kg"，接种107cfu/mL浓度的地衣芽孢杆菌100mL， 37"C避光培 养，实验设不加菌的对照(CK)。 72小时后检测AFBl和OTA,设三个重复。
表5 地衣芽孢杆菌CB. //ctem/onmX) CGMCC No.2775降解玉米中AFB1和OTA的检测结果
序号AFB1浓度(mg.kg")AFB1降解率(％)OTA浓度(mg.kg—1) OTA降解率(％)
11.2±0.575.01.3±0.5 73.5
2(CK)4.8±0.64.9±0.7
*对照的AFB1和OTA值设为100%
试验表明，地衣芽孢杆菌(及//cfe"!/onn!'s) CGMCC No.2775在玉米样本中添加AFB1和 OTA浓度高达5mg/L时，仍然能够同时降解加标玉米中AFB1和OTA，玉米中AFB1和OTA 平均降解率为75.0%和73.5°/0。
权利要求
1、筛选降解AFB1和OTA的地衣芽孢杆菌的筛选方法，其包括内容从动物粪便、发霉粮食、腐败饲料、枯枝败叶以及发酵食品等样本中筛选能够降解香豆素的菌株；二次筛选能够降解黄曲霉毒素(AFB1)和赭曲霉毒素A(OTA)的菌株，采用初筛培养基(基础培养基含≤0.5％的香豆素)分离的多株能够降解香豆素的菌株，再用这些菌株同时分别接种复筛培养基(肉汤培养基+特定浓度的真菌毒素)，选择到1株同时降解两种毒素的细菌，通过形态学，生理、生化鉴定，以及16rDNA序列分析，确定该菌株是地衣芽孢杆菌。
2、 根据权利要求1所获得的筛选降解AFB1和OTA的培养基配方， 初筛培养基A:基本培养基磷酸氢二钕0.01-0.1% 磷酸二氢钾0.1-0.2% 磷酸氢二钠0.3-0.4% 硫酸钠0.05-0.1% 硝酸钠0.1-0.2 g 琼脂1.2-2% pH7.2-7.4B:香豆素(《0.5%，过滤灭菌，实验中将菌株接于其中，再转接于初筛培养基A中) 复筛培养基(降解AFB1):蛋白月东0.5-1%牛肉膏0.3-1%AFB1 0.1-5mg/LpH7,2-7,4 复筛培养基(降解OTA):蔗糖2-3°/。硝酸钠0.2-0.3%磷酸二氢钾0.1-0.2%硫酸镁0.05-0.1%氯化钾0.05-0.1%硫酸亚铁0.001-0.005%OTA达到0.1-5mg/LpH6.0-6.5
3、 根据权利要求1所述方法获得的地衣芽孢杆菌(Bac!'Z/ws /z'cte"〖/b，的MZH-11，保藏编号 为CGMCCNo.2775。
4、 由权利要求1分离的权利要求3的菌株的培养，其特征在于所用培养和保存用培养基的 组分蛋白胨0.1-0.5% 牛肉膏0.1-0.5% 香豆素《0.05% pH7.2-7.4
5、 权利要求3的地衣芽孢杆菌在分别或同时降解AFB1和OTA的应用。
6、 权利要求5的地衣芽孢杆菌的解毒作用。主要应用在以粮食为原料的饲料行业。
全文摘要
本发明公开1株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株，能够同时降解真菌毒素(mycotoxins)中的黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)和赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)。首先通过香豆素为惟一碳源的培养基初筛目的菌株，再用AFB1和OTA的毒素纯品二次筛选，然后应用到加标的粮食样本中，该菌株对加标粮食中AFB1和OTA的平均降解率分别达到82.2和78.7％。该发明可以应用到食品及饲料行业，脱除粮食、饲料中的AFB1和OTA。
文档编号C12N1/20GK101457212SQ20081022472
公开日2009年6月17日 申请日期2008年12月10日 优先权日2008年12月10日
发明者舒 关, 李俊霞, 梁志宏, 牛天贵, 田杰生, 成 计 申请人:中国农业大学