专利名称：：一种用于制备秸秆饲料的低温发酵菌剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于制备秸秆饲料的低温发酵菌剂。
背景技术：
：农作物秸秆是一种重要的生物资源，具有数量大、分布广和种类多等特点。据报道，我国各类农作物秸秆年总产量达7亿吨以上，其中稻草2.3亿吨，玉米秸秆2.2亿吨，豆类和秋杂粮秸秆10亿吨，花生、薯类藤蔓和甜菜叶等1.0亿吨，占世界总秸秆量的30%左右。但是，长期以来，这些秸秆资源却没有得到合理的开发利用。近几年来，由于农作物产量的大幅度提高和农村薪材结构的改变，越来越多的秸秆成为废弃物，既浪费了资源又污染了环境。因此，解决我国剩余秸秆问题对资源利用和环境污染治理极其重要。秸秆是冬季我国东北地区反刍动物的主要饲料，但由于秸秆主要由木质纤维素组成，养分低、适口性差、消化率低、作为饲料的品质差、动物不愿采食，因而如何提高秸秆的适口性、提高其饲用价值是解决我国秸秆公害、提高有机物利用率的一大热点。采用发酵方法可以在保存秸秆中营养成分的同时，提高饲料的适口性，是提高秸秆饲料品质的主要手段之一。但是秋冬季节气温比较低，青贮饲料中主要的活动因子一乳酸菌的活动受到限制，目前，还没有专门针对低温的秸秆饲料发酵菌剂。
发明内容本发明的目的是提供一种用于制备秸秆饲料的低温发酵菌剂。本发明所提供的用于制备秸秆饲料的低温发酵菌剂的活性成分包括沙克乳酸杆菌(Xactobacillussakei)禾口仁海明串珠菌(Xeuconostocinhae)。所述秸秆饲料低温发酵菌剂中，所述沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)和所述仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)的集落形成单位数目比为(70-80):(20-30)，具体为79:21。所述沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)具体可为沙克乳酸杆菌(Xactobacillussakei)JCM1157，所述仁海明串珠菌(Xeuconostocinhae)具体可为仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774。本发明所提供的秸秆饲料低温发酵菌剂的活性成分也可仅有由所述沙克乳酸杆菌(Xactobacillussakei)禾口所述仁海明串珠菌(Xeuconostocinhae)组成。所述秸秆饲料低温发酵菌剂中，所述沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157和所述仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774可分别独立包装，也可混合在一起。本发明的秸秆饲料低温发酵菌剂可为液体制剂，也可为固体制剂。在上述秸秆饲料低温发酵菌剂的活性成分的培养物中加入甘油、EDTA等物质，即得到秸秆饲料的低温液体发酵菌剂，该液体菌剂中的活菌数量和菌的活性可以长期保持稳定，对饲喂的动物也比较安全；在上述液体菌剂中加入吸附载体，如加入麦饭石和/或秸秆粉等，即可获得秸秆饲料的低温固体发酵菌剂，该固体菌剂中的吸附载体与沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)具有高度的亲和力，对饲喂的动物安全，可以使制成的固体菌剂保质期长，方便运输和使用，且干燥、冷冻处理都不会降低固体菌剂中活菌的数量和活性。上述液体菌剂中，所述活性成分、甘油和EDTA的配比为1X10"CFU:(l-5)g甘油(1-2)gEDTA，具体为1X10"CFU:5g甘油lgEDTA。上述固体菌剂中，所述活性成分和所述吸附载体的配比为1X106CFU:(l-10)g吸附载体，具体为1X106CFU:5g吸附载体。本发明所制备的菌剂可用于降解各种植物秸秆(如玉米秸秆、水稻秸秆等)制备秸秆饲料。本发明的用于制备秸秆饲料的低温发酵菌剂中的各种菌具有高度的协同作用，自体形成稳定的生态系统，能在未经灭菌的天然原料中快速繁殖、定殖而占据优势，在5-l(TC的环境下可以迅速产生大量乳酸，降低发酵料的PH值，改善饲料的发酵品质，提高饲料的营养价值和适口性，对饲喂的动物安全，且应用简易，成本低廉。具体实施例方式实施例1、发酵菌剂中活性成分的筛选R-MRS培养基的组成(g/L):<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>将取自东北水稻产区的稻杆粉碎成l2cm长的小段，将上述稻杆、取自该地区的土壤和上述稻杆和土壤的混合物各O.5g分别接入10mlR-MRS培养基中，5t:冰箱中厌氧培养。10d后，分别取上述三种培养液各15ill接入300ul新鲜的R-MRS培养基中，每4d转接一次，连续继代培养。测定培养液的pH值和乳酸的产量。选择pH值下降迅速，产乳酸量较多且对外界环境变化相对稳定的培养物，筛选其中的活性成分。通过分子生态学方法建立16SrDNA克隆文库对上述获得的培养物进行研究，结果表明，上述培养物中的组成菌主要为沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)和仁海明串珠菌(Xeuconostocinhae)。实施例2、用于制备秸秆饲料的低温发酵菌剂的制备沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774分别购自日本微生物保存中心和韩国生命工学研究所基因银行。1、用于制备秸秆饲料的低温发酵菌剂的制备将沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157禾P仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774分别接种到R-MRS培养基中，l(TC静置培养24h，将79ml上述沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157的发酵液和21ml上述仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774的发酵液混合，使混合发酵液中，沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774的集落形成单位数目比为79:21，该混合发酵液中的集落形成单位数目为lX108CFU/ml。将上述混合发酵液、甘油和EDTA按照lX103ml:5g:lg的配比混合，得到秸秆饲料的低温液体发酵菌剂。将上述获得的秸秆饲料的低温液体发酵菌剂和玉米秸秆按照lml:500g的配比混合，沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774在30。C条件下厌氧发酵2d，乳酸菌大量繁殖，产生大量乳酸，发酵料的pH值迅速降低。利用分子生态学技术一变性梯度凝胶电泳法(DGGE)证明，在发酵料中，以沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774为主的乳酸菌迅速控制发酵过程，并且在发酵过程中稳定存在。发酵lOd后，得到用于制备秸秆饲料的低温固体发酵菌剂。2、用于制备秸秆饲料的低温发酵菌剂的发酵效果实验将50g上述步骤1获得的用于制备秸秆饲料的固体发酵菌剂分别接种到1000g玉米秸秆或1000g稻杆中，常温发酵30d后，测定发酵料的pH值和乳酸的含量，同时以未接种秸秆饲料发酵菌剂的玉米秸秆和稻杆作为对照。实验设三次重复，结果表明，接种秸秆饲料低温发酵菌剂的玉米秸秆发酵料比未接种秸秆饲料低温发酵菌剂的玉米秸秆的pH值降低8.54%±0.84%，乳酸含量提高了158.35%±4.65%;接种秸秆饲料低温发酵菌剂的稻杆发酵料比未接种秸秆饲料低温发酵菌剂的稻杆的pH值降低9.6X±0.84%，乳酸含量提高了145.56%±4.89%，玉米秸秆发酵料和稻杆发酵料的品质得到了明显改善。实施例3、用于制备秸秆饲料的低温发酵菌剂的制备沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774分别购自日本微生物保存中心和韩国生命工学研究所基因银行。1、用于制备秸秆饲料的低温发酵菌剂的制备将沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157禾P仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774分别接种到R-MRS培养基中，l(TC静置培养24h，将70ml上述沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157的发酵液和20ml上述仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774的发酵液混合，使混合发酵液中，沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774的集落形成单位数目比为70:20，该混合发酵液中的集落形成单位数目为lX108CFU/ml。将上述混合发酵液、甘油和EDTA按照lX103ml:lg:lg的配比混合，得到秸秆饲料的低温液体发酵菌剂。将上述获得的秸秆饲料的低温液体发酵菌剂和玉米秸秆按照lml:100g的配比混合，沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774在30°C条件下厌氧发酵2d，乳酸菌大量繁殖，产生大量乳酸，发酵料的pH值迅速降低。利用分子生态学技术一变性梯度凝胶电泳法(DGGE)证明，在发酵料中，以沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774为主的乳酸菌迅速控制发酵过程，并且在发酵过程中稳定存在。发酵lOd后，得到用于制备秸秆饲料的低温固体发酵菌剂。2、用于制备秸秆饲料的低温发酵菌剂的发酵效果实验将50g上述步骤1获得的用于制备秸秆饲料的固体发酵菌剂分别接种到1000g玉米秸秆或lOOOg稻杆中，常温发酵30d后，测定发酵料的pH值和乳酸的含量，同时以未接种秸秆饲料发酵菌剂的玉米秸秆和稻杆作为对照。实验设三次重复，结果表明，接种秸秆饲料低温发酵菌剂的玉米秸秆发酵料比未接种秸秆饲料低温发酵菌剂的玉米秸秆的PH值降低8.04%±0.64%，乳酸含量提高了152.35%±4.25%;接种秸秆饲料低温发酵菌剂的稻杆发酵料比未接种秸秆饲料低温发酵菌剂的稻杆的pH值降低8.6X±0.74%，乳酸含量提高了142.56%±3.89%，玉米秸秆发酵料和稻杆发酵料的品质得到了明显改善。实施例4、用于制备秸秆饲料的低温发酵菌剂的制备沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774分别购自日本微生物保存中心和韩国生命工学研究所基因银行。1、用于制备秸秆饲料的低温发酵菌剂的制备将沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157禾P仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774分别接种到R-MRS培养基中，l(TC静置培养24h，将80ml上述沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157的发酵液和30ml上述仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774的发酵液混合，使混合发酵液中，沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774的集落形成单位数目比为80:30，该混合发酵液中的集落形成单位数目为lX108CFU/ml。将上述混合发酵液、甘油和EDTA按照lX103ml:5g:2g的配比混合，得到秸秆饲料的低温液体发酵菌剂。将上述获得的秸秆饲料的低温液体发酵菌剂和玉米秸秆按照lml:1000g的配比混合，沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774在30。C条件下厌氧发酵2d，乳酸菌大量繁殖，产生大量乳酸，发酵料的pH值迅速降低。利用分子生态学技术一变性梯度凝胶电泳法(DGGE)证明，在发酵料中，以沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774为主的乳酸菌迅速控制发酵过程，并且在发酵过程中稳定存在。发酵lOd后，得到用于制备秸秆饲料的低温固体发酵菌剂。2、用于制备秸秆饲料的低温发酵菌剂的发酵效果实验将50g上述步骤1获得的用于制备秸秆饲料的固体发酵菌剂分别接种到1000g玉米秸秆或lOOOg稻杆中，常温发酵30d后，测定发酵料的pH值和乳酸的含量，同时以未接种秸秆饲料发酵菌剂的玉米秸秆和稻杆作为对照。结果表明，接种秸秆饲料低温发酵菌剂的玉米秸秆发酵料比未接种秸秆饲料低温发酵菌剂的玉米秸秆的pH值降低8.43%±0.76%，乳酸含量提高了149.35%±4.35%;接种秸秆饲料低温发酵菌剂的稻杆发酵料比未接种秸秆饲料低温发酵菌剂的稻杆的PH值降低9.3%±0.94%，乳酸含量提高了142.86%±4.67%，玉米秸秆发酵料和稻杆发酵料的品质得到了明显改善。权利要求一种用于制备秸秆饲料的发酵菌剂，它的活性成分包括沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)。2.根据权利要求1所述的菌齐U，其特征在于所述沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)的集落形成单位数目比为(70-80):(20-30)。3.根据权利要求2所述的菌齐U，其特征在于所述沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)的集落形成单位数目比为79:21。4.根据权利要求1-3中任一所述的菌齐U，其特征在于所述沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)为沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157，所述仁海明串珠菌(Xeuconostocinhae)为仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774。5.根据权利要求1-4中任一所述的菌剂，其特征在于所述菌剂中包括甘油和EDTA。6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于所述活性成分、甘油和EDTA的配比为1X10"CFU:(1-5)g甘油(l-2)gEDTA，优选为1X10"CFU:5g甘油lgEDTA。7.根据权利要求6所述的菌剂，其特征在于所述菌剂中包括吸附载体，所述吸附载体为麦饭石和/或秸秆粉。8.根据权利要求7所述的菌剂，其特征在于所述活性成分和所述吸附载体的配比为ixio6cfu:(i-io)g吸附载体，优选为ixio6cfu:5g吸附载体。9.根据权利要求1-8中任一所述的菌齐U，其特征在于所述沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)JCM1157和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)KCTC3774分别独立包装或混合在一起。10.权利要求1-9中任一所述的发酵菌剂在制备秸秆饲料中的应用。全文摘要本发明公开了一种用于制备秸秆饲料的低温发酵菌剂。它的活性成分包括沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)和仁海明串珠菌(Leuconostocinhae)。本发明的用于制备秸秆饲料的低温发酵菌剂中的各种乳酸菌具有高度的协同作用，自体形成稳定的生态系统，能在未经灭菌的天然原料中快速繁殖、定殖而占据优势，迅速产生大量乳酸，降低发酵料的pH值，改善饲料的发酵品质，提高饲料的营养价值和适口性，对饲喂的动物安全，且应用简易，成本低廉。文档编号C12R1/01GK101735962SQ20081022631公开日2010年6月16日申请日期2008年11月12日优先权日2008年11月12日发明者崔宗均,杨洪岩,王小芬申请人:中国农业大学